bồi dưỡng học sinh giỏi môn sinh học thpt chuyên đề ENZIM cắt GIỚI HẠN

ENZIM CẮT GIỚI HẠN
(Restriction enzim)
Có thể khẳng định rằng : Khi nói tới công nghệ sinh học (đặc biệt sinh
học phân tử ) thì người ta không thể không nói tới công nghệ enzim . Bởi lẽ,
enzim và công nghệ enzim ra đã xác lập và thúc đẩy ngành công nghệ sinh
học phát triển lên một bước tiến mới.
Có rất nhiều loại en zim đựợc dùng trong sinh học phân tử. Tính riêng
trong hệ thống enzim sửa đổi axit nucleotit (nucleotid modifying enzymes) đã
được phát hiện thì enzim giới hạn có vai trò rất quan trọng, đặc biệt là trong
công nghệ ADN tái tổ hợp, chuyển ghép gen.
Vậy enzim giới hạn là gì ?
I/ Enzym giới hạn (Restriction enzym)
I.1 Hiện tượng giới hạn
Từ những năm 1950 , S.Luris,đã phát hiện thấy các phage thế hệ con
sinh ra từ thí nghiệm gây nhiễm phage T 2 vào nòi E.Coli B/4 không còn khả
năng sinh sản trong nòi vật chủ E.Coli bình thường và cho rằng các phage sinh
ra từ E.Coli B/4 đã bị sửa đổi theo một cách nói nào đó, làm cho các phage
này mất khả năng sinh trưởng trong vật chủ bình thường: đó là do enzim giới
hạn . Trong hiện tượng này chức năng quan trọng của enzym giới hạn là bảo
vệ chất di truyền của vi khuẩn không bị “ xâm lấn” bởi các ADN lạ, nói cách
khác ở đây có cả cơ chế bảo vệ virút để duy trì ADN riêng của các vi khuẩn.
Vào năm 1962, V.arber lần đầu tiên chứng minh đựợc rằng có những
loại enzim đặc biệt có khả năng phân biệt được ADN của tế bào chủ và ADN
ngọai lai ( ADN của phage) Các enzim này có khả năng hạn chế khả năng sinh
sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân huỷ chúng một cách đặc
hiệu người ta gọi nó là restriction enzim .
I.2 Enzym giới hạn (Restriction enzym)
Người đầu tiên phát hiện enzym giới hạn là H.Smith và D.Nathaus
(1970) hai ông đã tách được restriction endonuclease từ vi khuẩn Haemophilus
1

influenzase và gọi là Hind II . Ngay sau đó ông cũng đã chứng minh được
rằng phần lớn các vi khuẩn có một hệ thống enzim chuyên biệt dùng để hạn
chế - biến đổi (restriction -modification system) , bảo vệ tế bào khỏi sự xâm
nhập của các ADN lạ . Với công trình nghiên cứu này ông và cộng sự đã
được nhận giải thưởng Nobel năm 1978 .
I.3 Những qui định chung về danh pháp và phân loại của RE
a/ Danh pháp
Tên đầy đủ là restriction endonuclease và kèm theo tên hệ thống nhưng
người ta thường gọi theo tên hệ thống , bỏ tiền ngữ .Tên hệ thống thường được
biểu thị bằng 3-4 chữ cái viết tắt tên của vi khủn mà người ta tách được enzim
đó .Các chữ cái đều được viết hoa để chỉ giống còn 2 chữ tiếp theo viết để chỉ
loài , khi cần thiết thì viết thêm chữ cái thứ 4 để chỉ nòi hay chủng .
Ví dụ EcoB : Là en zim cắt giới hạn được tách ra từ vi khuẩn E.coli nòi B
Ngoài ra để nhận biết các enzim khác của cùng một nòi nguời tacòn dùng
thêm các chữ số la mã kem theo tên hệ thống
Ví dụ : Hind II , Hind III là các enzim giơí hạn có đoạn đích khác nhau đều
được chiết ra từ vi khuẩn Haemophilus influenzase nòi d .
b/ Phân loại
Đến nay, người ta đã tách chiết được hàng trăm loại enzym giới hạn
khác nhau và dựa vào đặc tính của các loại RE mà chia chúng ra làm 3 loại
ĐẶC TÍNH

Điểm cắt
Khả năng metyl hoá
gốc Adenin
Điều kiện để cắt
Cấu trúc của enzim
(Số chuỗi

LOẠI I

LOẠI II

LOẠI III

Cách xa điểm nhận Nằm trong điểm
biết (trên 1000bp) nhận biết

Nằm ngoài điểm
nhận biết (gần
hơn loại I)

có

Không

có

ATP,Mg++, S-AdoMet

Mg++hoặc Mn++

Mg++, S-AdoMet

3 chuỗi khác nhau

2 chuỗi giống nhau

2 chuỗi khác nhau

polypeptít)

c/ Chức năng
2


Chức năng nói chung của enzym giới hạn là thuỷ phân ADN, cắt sợi dài
ADN tại các vị trí (site) đặc thù, thành các đoạn ngắn (sequence), điều đó
được nhận biết chính xác bởi các enzim đặc thù.
Mỗi loại endonuclease giới hạn có khả năng nhận biết và cắt phân tử
ADN ở vị trí đặc hiệu gọi là vị trí giới hạn (restriction site).
Tất cả các vị trí giới hạn trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ đều được
bảo vệ với bản thân các nuclease giới hạn cuả chúng để ngăn hiện tượng tự
biến tính. Điều này được thực hiện bởi sự metyl hoá của một hoặc nhiều
nucleotit trong mỗi đoạn nucleotit được nhận biết bởi nuclease giới hạn của
bản thân vi khuẩn. Sự methyl hoá xảy ra nhanh chóng ngay sau khi vi khuẩn
tái bản và được xúc tác bởi methylase đặc hiệu được mã hoá bởi nhiễm sắc thể
vi khuẩn chủ. Mỗi enzym giới hạn có thể cắt phân tử ADN lạ từ các loài khác,
thành một số đoạn, nhiều hay ít là phụ thuộc vào số các site giới hạn trong
từng phân tử ADN.
Độ dài, kích thước các đoạn có thể được xác định qua diện di trên gen
agaose hoặc polyacrilamid. Enzym giới hạn cùng mang một trình tự nucleotit
nhất định, được sử dụng làm dầu dính. Khi được các dầu dính của các đoạn
ADN có trình tự nucleotit bổ sung được cho nhau theo nguyên lý bổ sung
Chargaff, thì các đoạn này có khả năng được đối lại với nhau nhờ các mối liên
kết hydro và dưới xúc tác cuả enzym nối ligase. Các mối được thực hiện từ đó
ADN tái tổ hợp (ADN lai) sẽ được phục hồi toàn vẹn về phương diện vật lý
của phân tử, trở thành ổn định, bền vững qua xử lý tiếp bằng ligase.
Trong 3 nhóm enzim giới hạn trên thì nhóm thứ II được dùng nhiều

nhất trong sinh học phân tử. Đó là các enzim nhận biết ADN mạch kép ở
những trình tự nhận biết và cắt các ADN ở những vị trí đặc hiệu trong đoạn
được nhận biết ( Ngay điểm nhận biết hay kế cận ). Các điểm nhận biết này
thường có trình tự 4-6bp đối xứng đảo ngược nhau gọilà các palindrom
Trong cấu trúc phân tử nó được câu tạo bởi 2 chuỗi polypéptit đồng nhất và
chúng có giá trị hơn cả trong các kỹ thuật phân tích ở mức phân tử ADN vì
3


chúng có các điểm cắt đặc trưng lại mngay trong đoạn nhận biết và không cần
năng lượng bổ sung để tiến hành phản ứng , chúng không có chức năng metyl
hoá. Điểmcắt và điểm nhận biết của các RE thuộc nhóm này có thứ tự các
gốc nucleotit đối xứng nhau ví dụ như điểm nhận biết và điểm cắt của một số
loại RE thuộc nhóm bày như sau :
+ EcoRI
5'--- G A A T T C ---- 3'
3' ---C T T A A G----5'

5'--- G
A A T T C ---- 3'
3' ---C T T A A
G------5'

+ PstI
5'----C T G C A. G ---- 3'

5'----C T G C A.

3'---G.A C G T C----5'

3'---G.

G ---- 3'

A C G T C----5'

Các enzim thuộc nhóm này khi cắt ADN mạch kép tạo ra các đầu lệch
cố kết hay "dính " vì các baze bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với nhau như lúc
chưa bị cắt dời . Nếu có một đoạn ADN lạ khác có cùng bị cắt bởi một enzim
hạn chế thì nó dễ dàng đính xen vào giữa như sơ đồ sau:
G-A A T T C-- G A A T T C -------G-A A T T C-X T T A A G --X T T A A G- ---- X T T A A G --

G
AAT T C
C T T AA
G

A A T T C ---------------GG- ------------- C T T A A
4


G A A T T C ---------------------- G - A A T T C---C T T A A G----------------------- C- T T A A G--Đoạn ADN xen giữa

Đầu dính

Đầu đính

CÁC LOẠI RE VÀ ĐIỂM CẮT HAY DÙNG THUỘC NHÓM II

STT TÊN

ENZIM

VI KHUẨN

ĐIỂM CẮT ( . )

1

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens H

G. ATCC

2

BglII

Bacillus globiggi

A. GATCT

3

EcoRI

E.coli RY13

G. AATTC

4

EcoRII

E.coli R245

CC. GG

5

HaeIII

Haemophilus aegyptius

GG.CC

6

HgaI

Haemophilus gallinarum

GACGCNNNNN.

7

Hba I

Haemophilus baemolyticus

GCG.C

8

HindII

Haemophilus infuenzae Rd

GTPy.PuAC

9

HindIII

Haemophilus infuenzae Rd

A.AGCTT

10

HinfI

Haemophilus infuenzae Rf

GANTC

11

HpaI

Haemophilus parain fuenzae

GTT.AAC

12

HpaII

Haemophilus parain fuenzae

C. CGG

13

MspI

Moracella species

C.CGG

14

NotI

Nocardia rubra

GC. GGCCGC

15

PleI

Pseudomonas lemoignei

GAGTCNNNN.

........

.....

.....

Nhóm thứ nhất được cấu tạo bởi 3 chuỗipolypeptit khác nhau :
+ Một chuỗi thực hiện chức năng nhận biết ,
+ Một chuỗi thực hiện chức năng cắt
5


+ Một chuỗi thực hiện chức năng metyl hoá
Các enzim thuộc nhóm thứ 3 ít được quan tâm hơn cả . Chúng được cấu
tạo bởi 2 chuỗi polypeptit khác nhau trong đó một chuỗi polypeptit thực hiện
chức năng cắt và chuỗi còn lại vừa thực hiện chức năng nhận biết và metyl
hoá .Trong hoạt động cắt chúng cho các điểm cắt không đặc trưng
Ngày nay đãcó tới hơn 500 loại RE được phát hiện chúng có khả năng cắt
ADN với tổngcộng hơn120 trình tự nhận biết khác nhau .
I.4/ Các kiểu cắt của RE
Có hai kiểu cắt cơ bản của RE
1/Cắt thẳng tại một điểm qua trung tâm đối xứng luân phiên .
Cắt điểm 1 ( ở cả 2 liên kết của trục đối xứng)

3'----C-A-A--------------T-T-G-----5'
5'----G-T-T-------------A-A-C----3'
Ví dụ như Re: E.CoRI cắt ADN của SV40 tại chỉ một điểm ( site). Site này
được qui ước như là ở vị trí số 0 trên ADN SV40 .
2/ Cắt nhiều điểm của đoạn ADN
Các enzim giới hạn Hpal và HindIII cắt ADN của SV40 tại 4 site .Khi SV40
đều được tác động bởi cả 3 enzym trên, thì sẽ có 11 đoạn giới hạn được tạo ra.

Cắt nhiều điểm

3'-----T-T-C-----------G-A-A----5'
5' ----A-A-G-------- ---C-T-T-----3'
đầu tận cùng của sợi đơn đựơc cắt

3'-----T-T-C-----------G-A'
5' A-G-------- ---C-T-T-----3'
đầu tận cùng của sợi đơn đựơc cắt ra và tạo đoạn ADN cần

II/ Vai trò của RE trong công nghệ gen
1/ Tạo ADN tái tổ hợp
6


2/ Dùng enzim cắt giới hạn để phân tích tổ chức của ADN
+ Nghiên cứu các hệ gen.
+ Lập bản đồ một số hệ gen Như bản đồ của ɸX174, SV40
3/ Dùng en zim cắt trong chuẩn đoán y học , phát hiện bệnh di truyền.

+ Một số đột biến di truyền ảnh hưởng đến các điểm dành cho enzim cắt
giới hạn .

+ Phân biệt được kiểu gen bình thường ( kiểu dại ) với các kiêu đột biến
bằng cách :
*Cắt mẫu ADN của hệ gen bằng enzim giới hạn thích hợp
* Phân tích các đoạn ADN trên gen điện di ( qua độ dài khác nhau của
các đoạn )
* Chuyển các đoạn lên màng lọc .
* Cho lai với mãu đánh dấu (probe) thích hợp ( dùng ARN ) , như đánh
dấu phóng xạ ( thường là 32p)
* ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí các dòng ADN bổ trợ với mẫu
ARN
* Các dòng nàyđược tách ra để nghiên cứu
*Chọc ối lấy tế bào phôi , và phân tích chuẩn đoán như trên , phát hiện
các khác biệt trong mẫu xử lý enzim giới hạn .
4/ Dùng tính chất đặc hiệu của enzim giới hạn để tìm hiểu mối quan hệ di
truyền , nguồn gốc của quần thể .

__________________________

7


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1/ Phan Cự Nhân - Nguyễn Minh Công - Đặng Hữu Lanh
Di truyền học tập II - Nhà xuất bản Giáo dục 1999
(Từ trang 264 đến 271)
2/ Lê thanh Bình - Lê Thị Muội
Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống cây trồng - Nhà xuất bản nông
nghiệp - Hà nội 1997 ( Từ trang 38 đến trang 46)
3/ Lê Duy Thành - Tạ Toàn - Đỗ Lê Thăng - Trần Văn Diễn
Di truyền học - Nhà xuất bản nông nghiệp 1995 (Từ trang 317-322 )

4/ Hồ Huỳnh Thuỳ Dương
Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục 1998 (Từ trang 135 -140 )
5 / Phạm Thành Hổ
Di truyền học - Nhà xuất bản giáo dục1999 (Từ trang379 đến 381)

8