Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài trà hoa vàng ở vườn quốc gia tam đảo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN
CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN
CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Hà Văn Huân
2. PGS.TS. Nguyễn Trung Thành

Hà Nội – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn
khoa học của PGS.TS. Hà Văn Huân và PGS.TS. Nguyễn Trung Thành. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới
bất kỳ hình thức nào.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của
các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung
luận văn.
Học viên

Hoàng Minh Trang


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hà Văn Huân – Viện
CNSH Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp và PGS.TS. Nguyễn Trung Thành – Khoa
Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này.
Xin được cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Xây dựng cơ sở dữ liệu
mã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài
gỗ có giá trị kinh tế” do PGS. TS Hà Văn Huân chủ nhiệm đã hỗ trợ tôi về mọi phương
diện để thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Đại học
Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Xin được cảm ơn
Ban Quản lý VQG Tam Đảo đã cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề
tài, cảm ơn chuyên gia thực vật học Lê Thành Cương đã giúp tôi thu thập và nhận
dạng các loài Trà hoa vàng trong nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn
sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm

Học viên

Hoàng Minh Trang


1 MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1

Tổng quan về Trà hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo ..............................3

1.1.1

Điều kiện tự nhiên và đa dạng thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Đảo .....3

1.1.2

Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo ................................3

1.1.3
Đảo

Đặc điểm hình thái và phân bố một số loài Trà hoa vàng VQG Tam
.................................................................................................................5

1.1.4

Trà hoa vàng và giá trị sử dụng ..............................................................8

1.2

Tổng quan về mã vạch ADN .........................................................................9

1.2.1

Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode) .........................................9

1.2.2

Một số đoạn mã vạch ADN được sử dụng ...........................................12

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân biệt của các mã vạch ADN
thực vật ..............................................................................................................20
1.2.4

Ứng dụng của mã vạch ADN ................................................................21

1.2.5

Một số nghiên cứu về mã vạch ADN ở các loài Trà ............................22

Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................25
2.1

Vật liệu nghiên cứu......................................................................................25

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................25

2.1.2

Nội dung nghiên cứu.............................................................................25

2.2

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................26

2.2.1

Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ................................................................26

2.2.2

Phương pháp nghiên cứu ......................................................................27

Chương 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .....................................................................29
3.1

Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trà hoa vàng ...............................29

3.2

Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN .........................................................30

3.3

Giải trình tự và phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN .........................32

3.3.1

Kết quả giải trình tự ..............................................................................33

3.3.2

Khoảng cách di truyền trong và giữa các loài ......................................58

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ......................................................................................64
1. Kết luận .............................................................................................................64


2. Kiến nghị ...........................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................66

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng ...................................................................26
Bảng 3.1. Mẫu vật nghiên cứu ..................................................................................29
Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) ..30
Bảng 3.3. Đánh giá trình tự các đoạn mã vạch thu được ..........................................33
Bảng 3.4. So sánh trình tự đoạn matK giữa các loài Trà hoa vàng ...........................34
Bảng 3.5. So sánh trình tự matK giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu .................36
Bảng 3.6. Mức độ tương đồng đoạn matK các loài Trà nghiên cứu với một số loài
khác ...........................................................................................................................37
Bảng 3.7. So sánh trình tự đoạn rbcL giữa các loài Trà hoa vàng ............................39
Bảng 3.8. So sánh trình tự rbcL giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu ..................41
Bảng 3.9. Mức độ tương đồng đoạn rbcL các loài Trà nghiên cứu với một số loài
khác ...........................................................................................................................41
Bảng 3.10. So sánh trình tự đoạn trnH-psbA giữa các loài Trà hoa vàng ................44
Bảng 3.11. So sánh trình tự trnH-psbA giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu ......45
Bảng 3.12. Mức độ tương đồng đoạn trnH-psbA các loài Trà nghiên cứu với một số
loài khác ....................................................................................................................46
Bảng 3.13. So sánh trình tự đoạn ycf1b giữa các loài Trà hoa vàng ........................49
Bảng 3.14. So sánh trình tự ycf1b giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu ...............51
Bảng 3.15. Mức độ tương đồng đoạn ycf1b các loài Trà nghiên cứu với một số loài
khác ...........................................................................................................................51
Bảng 3.16. So sánh trình tự đoạn ITS2 giữa các loài Trà hoa vàng .........................54
Bảng 3.17. So sánh trình tự ITS2 giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu ...............55
Bảng 3.18. Mức độ tương đồng đoạn ITS2 các loài Trà nghiên cứu với một số loài
khác ...........................................................................................................................55
Bảng 3.19. Khoảng cách di truyền của từng đoạn mã vạch riêng rẽ và khi kết hợp
các đoạn mã vạch ......................................................................................................59

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hệ gen lục lạp một số loài thuộc chi Camellia [94] .................................24
Hình 2.1. Chu trình nhiệt nhân bản đoạn mã vạch ADN ..........................................28
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số các mẫu Trà hoa vàng
...................................................................................................................................29
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR các đoạn mã vạch ADN ..........................32
Hình 3.3. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen matK .........38
Hình 3.4. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen rbcL ...........43
Hình 3.5. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn trnH-psbA ........48
Hình 3.6. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn ycf1b.................53
Hình 3.7. Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn ITS2..................57
Hình 3.8. Khoảng cách di truyền các đoạn mã vạch .................................................58
Hình 3.9. Cây phân loại sinh học dựa trên sự kết hợp một vài trình tự mã vạch......63


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT Tên viết tắt
1

DNA

2

Tên đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

Deoxyribonucleic acid

ADN

bp

Base pair

Cặp base

3

ITS

Internal transcribed spacer

Vùng đệm giữa các vùng
phiên mã

4

matK

Maturase K

Protein maturase K

5

NCBI

National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm Thông tin Công
nghệ sinh học Quốc gia

6

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polimer hóa

7

rbcL

Ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase large subunit

Tiểu đơn vị lớn enzyme
ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase

8

RNA

Ribonucleic acid

ARN

9

VQG

Vườn Quốc gia


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

0 MỞ ĐẦU
Trà hoa vàng thuộc chi Trà Camellia (họ Theaceae, bộ Ericales) có hoa màu
vàng, được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào những năm đầu thế kỉ XX. Cho
đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ra khoảng trên 30 loài Trà hoa vàng, trong đó
có 28 loài được tìm thấy ở Trung Quốc và 24 loài tìm thấy ở Việt Nam [2]. Các loài
trà hoa vàng có giá trị lớn về mặt dược liệu, được biết đến với tác dụng kiềm chế sinh
trưởng khối u, ngăn ngừa ung thư, giảm lượng cholesterol và lipoprotein trong máu
do có các nguyên tố vi lượng như Germanium (Ge), Selenium (Se), Mangan (Mn)…
Ngoài ra trà hoa vàng còn có giá trị thẩm mỹ cao, được trồng làm cây cảnh do có hoa
lớn màu vàng đặc trưng [5].
Ở Việt Nam, Trà hoa vàng được phát hiện chủ yếu ở một số địa phương như
VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc), VQG Cúc Phương (Ninh Bình), Phước Lộc (Lâm
Đồng)… [21, 65, 67], trong đó ở VQG Tam Đảo phát hiện ra 8 loài với một số loài
đặc hữu của Việt Nam như Camellia tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia
petelotii … [63, 65]. Đây là nguồn gen vô cùng quý hiếm cho hệ thực vật ở Tam Đảo
nói riêng và Việt Nam nói chung, cần được bảo vệ và phân loại để đưa ra biện pháp
thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, đa dạng sinh học. Tuy nhiên, hiện nay Trà hoa
vàng ở Tam Đảo đang bị đe dọa nghiêm trọng do việc khai thác quá mức từ phía
người dân, đồng thời việc bảo tồn và nghiên cứu còn chưa được chú ý nhiều [65].
Cho đến nay, việc phân loại thực vật nói chung và các loài thuộc chi Trà nói

riêng chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu bên trong [94]. Việc
phân loại này trong một số trường hợp gặp nhiều khó khăn do một số loài Trà hoa
vàng có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau. Với sự phát triển của sinh học phân
tử và công nghệ gen, một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã
được nghiên cứu và phát triển sử dụng các đoạn mã vạch ADN đặc trưng cho loài
(DNA barcode) [17]. Phương pháp này trở thành công cụ đắc lực cho các nhà khoa
học trong việc phát hiện loài mới, phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ
di truyền các loài. Mỗi đoạn mã vạch ADN có đặc trưng riêng và có khả năng phân

1


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau (chi, loài, dưới loài). Một số đoạn Mã vạch
ADN được sử dụng phổ biến ở thực vật có thể kể đến như matK, rbcL, trnH-psbA,
rpoB, rpoC1, psbI-psbK, atpF-atpH, trnL-trnF...[40, 47, 94]
Với mục xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử cho các loài Trà hoa vàng ở VQG
Tam Đảo, cụ thể là 5 loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh), Trà vàng Hakoda
(Camellia hakoda Ninh, Tr.), Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et
Hakoda), Trà vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Trà vàng Petelo
(Camellia petelotii (Merr.) Sealy), đề xuất mã vạch thích hợp đặc trưng cho các loài
trà này thông qua việc xác định và phân tích trình tự của một số đoạn mã vạch, tác
giả tiến hành đề tài “Xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài Trà hoa
vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo” với đối tượng phân tích là năm vùng trình tự
rbcL, matK, ycf1b, trnH – psbA và ITS2. Kết quả thu được sẽ đóng góp vào Ngân
hàng gen Quốc tế để giám định các loài Trà hoa vàng, xác định mối quan hệ di truyền
giữa các loài Trà hoa vàng với nhau và với các loài trong chi trà Camellia, nâng cao
hiệu quả bảo tồn và phát triển các loài Trà hoa vàng quý hiếm ở không chỉ ở Việt
Nam mà còn trên toàn thế giới.

2


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

1 Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Trà hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo
1.1.1 Điều kiện tự nhiên và đa dạng thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Đảo
Vườn Quốc gia (VQG) Tam Đảo có vị trí địa lý nằm ở phía bắc đồng bằng
Bắc Bộ, từ 21 độ 21' đến 21 độ 42' vĩ Bắc và 105 độ 23' đến 105 độ 44' kinh Đông,
nằm trên địa phận 3 tỉnh: Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Tuyên Quang, chiếm giữ toàn bộ
hệ núi Tam Đảo, chạy dài theo hướng Tây Bắc – Đông Nam. Đây. Khối núi có đặc
điểm chung là đỉnh nhọn, sườn dốc, độ chia cắt sâu và dầy, tạo nên các dạng địa hình
khác biệt. Khí hậu VQG Tam Đảo nằm trong vùng khí hậu ẩm nhiệt đới, hai sườn
đông tây ngăn cách cùng với sự thay đổi về lượng mưa hàng năm đã tạo nên sự đa
dạng về các tiểu vùng khí hậu cho khu vực này. Phong phú về dạng địa hình, chia
vùng khí hậu và đa dạng về mặt thổ nhưỡng là nguyên nhân chính đã tạo ra sự đa
dạng về các hệ sinh thái rừng, các quần xã sinh học và đa dạng về loài của rừng Tam
Đảo. Dựa trên cơ sở các cuộc điều tra, khảo sát đã thống kê được cho đến năm 2005,
VQG Tam Đảo có 1436 loài thuộc 741 chi, 219 họ, 6 ngành thực vật bậc cao. Trong
số đó, ngành Mộc lan (Magnoliophyta) có số loài nhiều nhất (1149 loài), ngành Cỏ
tháp bút (Equisetophyta) có số loài ít nhất (1 loài). Trong số các loài thực vật ở VQG
Tam đảo, có 68 loai đặc hữu và 58 loài quý hiếm được ghi vào sách đỏ Việt Nam hay
theo tiêu chuẩn của Liên minh bảo tồn thiên nhiên Quốc tế IUCN [102] cần được bảo
tồn như Lan hài tam đảo (Paphiopedilum gratrixianum), Trà vàng tam đảo (Camellia
tamdaoensis), Trà vàng petelo (Camellia petelotii), Kim giao (Nageia fleuryii)...
Trong số đó, đa dạng về các loài trà nói chung và Trà hoa vàng nói riêng nhận được
nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu không chỉ trong nước mà còn mở rộng ra
phạm vi quốc tế [5].

1.1.2 Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo
Trà hoa vàng nói riêng và các loài thuộc chi trà Camellia nói chung ưa khí hậu
nóng ẩm, thường mọc ở nơi đất tơi xốp bên bờ suối có bóng râm, thoát nước tốt. Với
khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa vùng núi cao, địa hình phân hóa mạnh và đa dạng tạo

3


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

nên các thung lũng ẩm ướt, VQG Tam Đảo trở thành khu bảo tồn có số lượng loài trà
phong phú nhất ở Việt Nam. Cho đến nay đã tìm ra 16 loài và 1 thứ thuộc chi trà được
tìm thấy ở đây, trong đó có 8 loài trà hoa vàng phân bố rải rác trong dãy núi Tam Đảo
[65].
Loài Trà hoa vàng đầu tiên được tìm thấy ở VQG Tam Đảo là loài trà vàng
petelo Camellia petelotii bởi thầy thuốc người Pháp Alfred Petelot vào năm 1923.
Trong những năm của nửa đầu thế kỷ 20, nhiều cuộc khảo sát và thu thập đã được
tiến hành trong đó có các loài thuộc chi Camellia [5]. Tháng 01 năm 1998 trong đợt
khảo sát sự đa dạng sinh học chi Camellia ở VQG Tam Đảo, PGS.TS Trần Ninh cùng
với GS. Hakoda Naotoshi trường đại học Tokyo (Nhật Bản) đã công bố 3 loài trà mới
trong đó có loài trà vàng lá dày Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda. Các loài mới
này được công bố trong tạp chí Trà quốc tế (International Camellia Journal)
[64][101]. Dựa trên các tài liệu tham khảo và nghiên cứu của tác giả, năm 2002
PGS.TS Trần Ninh đã công bố trên tạp chí Trà quốc tế 50 loài trà ghi nhận có mặt ở
Việt Nam. Trong số 50 loài đó có 12 loài trà gặp ở VQG Tam Đảo. Trong nhiều năm
tiếp theo PGS.TS Trần Ninh đã tiến hành nhiều đợt khảo sát ở các địa điểm khác nhau
của VQG Tam Đảo. Năm 2007 trong tạp chỉ khoa học trường ĐHQG Hà Nội, ông
cho công bố 2 loài trà hoa vàng mới đó là Camellia hakoda Ninh và Camellia
tamdaoensis Ninh et Hakoda. Năm 2008 PGS.TS Trần Nình cùng đồng nghiệp đã thu
thập được thêm 3 loài ở VQG Tam Đảo, trong đó có 2 loài Trà hoa vàng lần đầu tiên

được tìm thấy ở đây là Camellia hirsuta Hakoda et Ninh, Camellia phanii Hakoda et
Ninh [5]. Cho đến nay, 8 loài Trà hoa vàng đã được phát hiện ở VQG Tam Đảo là
các loài:
 Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày)
 Camellia gilberti (A.Chev.) Sealy (Trà vàng ginbec)
 Camellia hakodae Ninh (Trà vàng hakoda)
 Camellia hirsuta Hakoda et Ninh (Trà vàng nhiều lông)
 Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo)

4


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

 Camellia phanii Hakoda et Ninh (Trà vàng phan)
 Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo)
 Camellia tienii Ninh, Tr. (Hải đường vàng) [65]
Trong số đó có một số loài đặc hữu của Việt Nam như Camellia crassiphylla,
Camellia hakodae, Camellia tamdaoensis… Tuy đa dạng về loài nhưng phân bố của
các loài trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo lại khá hẹp trừ loài Camellia gilberti. Hai loài
Camellia tamdaoensis và Camellia tienii phân bố ở sườn dốc phía Tây Nam dãy núi
Tam Đảo, ở độ cao 200 – 600m. Trong khi đó, các loài Camellia hakodae, Camellia
hirsuta, Camellia phanii lại thường được tìm thấy ở phía đông nam. Đăc biệt, loài
Trà vàng petelo (Camellia petelotii) – loài đặc hữu của VQG Tam Đảo là loài trà hoa
vàng duy nhất ở Bắc Việt Nam phân bố ở độ cao trên 900m. Hiện nay, với hệ thống
bảo vệ còn lỏng lẻo và chưa được quan tâm đúng mức, số lượng cá thể của các loài
trà hoa vàng sụt giảm đáng kể do việc khai thác quá mức từ phía người dân do các
loài trà này có giá trị kinh tế rất lớn [65].
1.1.3 Đặc điểm hình thái và phân bố một số loài Trà hoa vàng VQG Tam Đảo
Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Trà vàng lá dày)

Cây gỗ nhỏ; cao 3-5 m. Lá có cuống dài, không lông, phiến lá hình bầu dục
rộng hoặc bầu dục, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới, có nhiều
điểm tuyến màu đen, lá dày, gốc lá tròn hoặc tim nông, chóp lá tù, mép lá có răng cưa
lõm nông, gân bên 8-9 cặp. Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, đường kính
khi nở khoảng 4-4,3 cm. Lá đài 5, có lông. Tràng hoa gồm 9-10 cánh, các cánh bên
ngoài có lông mịn ở mặt lưng, các cánh bên trong hình bầu dục thuôn, có lông mịn.
Quả hình cầu dẹp, khía 3 rãnh. Quả 3 ô, 1-3 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2-3 mm.
Mùa ra hoa: Mùa đông đến đầu xuân.
Sinh thái: Mọc rải rác trong thung lũng rừng thường xanh ở độ cao 500-600 m
[5, 65].

5


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

Camellia hakodae Ninh (Trà vàng hakoda)
Cây gỗ nhỏ, cao 3-4 m. Cành non màu nâu nhạt, nhẵn. Phiến lá hình bầu dục,
bầu dục rộng hoặc thuôn, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sáng ở mặt dưới với
nhiều điểm tuyến màu đen, cả hai mặt đều không lông, mép lá có răng cưa nhỏ cách
đều nhau, hệ gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới. Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành
hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 6-8 cm. Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, mép
và mặt trong có lông. Tràng hoa gồm 16-17 cánh, gần tròn đến bầu dục, có lông ở
mặt trong và thưa dần ở các cánh bên trong. Quả gần dạng cầu, 3-4 hạt trong mỗi ô,
vỏ quả dày 4,5-6,5 mm. Hạt dài 2,2 cm, có lông.
Mùa ra hoa: Đầu mùa đông tới đầu xuân.
Điều kiện sinh thái: Mọc trong thung lũng của rừng thường xanh ở độ cao 150500 m.
Phân bố: Loài này được thu thập đầu tiên ở VQG Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc từ
tháng 12 năm 1998. Đây là loài đặc hữu của VQG Tam Đảo. Loài này còn số lượng
cá thể rất ít và khu phân bố khá hẹp, hơn nữa sự tái sinh không nhiều nên cần có biện

pháp bảo vệ [5, 65].
Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trà vàng petelo)
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao 3-5 m, cành non màu xám nhạt, nhẵn. Lá có
cuống, hình bầu dục thuôn, đôi khi hình bầu dục hoặc thuôn, mặt trên phiến lá màu
xanh đậm, mặt dưới xanh sáng với nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, nhẵn, gốc lá hình
nêm hoặc nêm rộng, chóp lá có mũi nhọn. mép lá có răng cưa nhọn nhưng cách nhau
không đều. Hoa màu vàng, mọc đơn độc ở đầu các cành non, đường kính khi nở
khoảng 4,7 cm. Cuống hoa to, lá đài 5, hình trứng rộng ngược. Cánh hoa gồm 14
cánh, hình trứng rộng ngược, bầu dục. Cánh hoa bên ngoài có lông mịn màu trắng ở
mặt ngoài, tất cả hợp với nhau và với bộ nhị khoảng 8 mm ở gốc. Quả hình cầu dẹt.
Hạt dài 1-2 cm, có lông.
Mùa ra hoa: Mùa đông tới đầu mùa xuân năm sau.
Sinh thái: Mọc trong rừng thường xanh ở độ cao 950-1100 m.
Phân bố: Vĩnh Phúc, VQG Tam Đảo. Loài đặc hữu của Việt Nam [5, 65].

6


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh (Trà vàng tam đảo)
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao 2 - 4 m, cành non màu nâu nhạt, có lông mịn,
cành già nhẵn. Lá có cuống nhẵn. phiến lá hình bầu dục thuôn hoặc bầu dục rộng,
dài, mặt trên phiến lá màu xanh đậm, láng, không lông, mặt dưới màu xanh tía đỏ,
không lông, có nhiều điểm tuyến màu nâu đen. Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành hoặc
nách lá, đường kính khi nở khoảng 3,5-4 cm. Cuống hoa dài 5-7 mm. Lá bắc 5. Lá
đài 5, hình móng hay gần tròn, có lông ở mặt trong và mép. Cánh hoa gồm 11-12
cánh, gần tròn, trứng ngược hoặc bầu dục. Quả hình cầu dẹt, khía 3 rãnh, đường kính
4 cm, cao 2,3 cm. Quả 3 ô, 3 hạt trong mỗi ô, vỏ quả dày 2 mm Hạt có dạng bán cầu
hay nêm, vỏ hạt nhẵn.

Mùa ra hoa: Mùa đông
Điều kiện sinh thái: mọc trong những thung lũng ẩm ướt trong rừng nhiệt đới
ở độ cao 300-400 m,
Phân bố: Vĩnh Phúc (VQG Tam Đảo). Đây là loài đặc hữu của Việt Nam [5,
65].
Camellia tienii Ninh, Tr. (Hải đường vàng)
Cây gỗ nhỏ, thân màu trắng nhợt, cao 2,5 m. Cành và lá non màu tím, không
lông. Lá có cuống gần trònx, không lông, lá dạng da, dày, phiến lá thuôn, cả hai mặt
đều không có lông, mặt trên láng, mặt dưới có nhiều tuyến màu đen. Hoa màu vàng,
mọc ở nách lá, kích thước 5-6 cm. Lá đài 5, hình vẩy đến gần tròn, cao 3-7 mm, rộng
8-10 mm, có lông ở mép. Cánh hoa 14, các cánh ngoài phủ nhiều lông, các cánh còn
lại có lông thưa, mặt trong của tất cả các cánh đều không lông, hình dạng cánh hoa
thay đổi từ ngoài vào, các cánh từ gần tròn, bầu dục hay bầu dục thuôn.
Mùa ra hoa: Mùa đông tới đầu xuân
Điều kiện sinh thái: Mọc ven suối trong rừng thường xanh núi thấp ở độ cao
250m.
Phân bố: Vườn Quốc gia Tam Đảo [5, 65].

7


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

1.1.4 Trà hoa vàng và giá trị sử dụng
Từ xa xưa các loài trà đã được con người khai thác làm đồ uống có tác dụng
thanh nhiệt, giải độc. Tuy nhiên, công dụng của các loài trà hoa vàng không dừng lại
ở đó. Ngày nay, đời sống của con người được nâng cao cùng với sự tiến bộ của khoa
học kỹ thuật, ngày càng có nhiều công dụng của trà hoa vàng được tìm ra và tận dụng
triệt để nguồn tài nguyên quý báu này.
Đồ uống từ lá, hoa trà

Đây là một giá trị đáng kể và phổ biến không chỉ với trà hoa vàng mà còn đối
với các loài thuộc chi Trà Camellia nói chung. Từ những năm trước Công nguyên,
người Trung Quốc đã sử dụng trà như một thứ nước uống và trà được phổ biến ở
nhiều nước châu Á sau đó. Với một số đất nước như Nhật Bản, Trung Quốc, thức
uống từ trà đã trở thành một nét văn hóa đặc trưng. Ở Việt Nam cây trà cũng được
trồng từ khá lâu, hầu như tỉnh nào cũng có cây trà. Tuy nhiên, phổ biến hiện nay vẫn
là các loài Trà xanh, Trà hoa vàng còn chưa được biết đến nhiều. Một ưu điểm so với
trà xanh thông thường đó là chiết suất từ lá Trà hoa vàng không chứa caffein vốn là
một chất chiếm tỷ lệ đáng kể ở trà xanh [5].
Tách dầu từ hạt trà
Hạt của các loài trà có thể dùng để chưng cất dầu. Ở Trung quốc và Nhật Bản,
dầu ăn chiết từ hạt trà khá phổ biến. Dầu của hơn 200 loài thuộc chi trà đã được sử
dụng làm thực phẩm và dung cho các ngành công nghiệp khác. Ngoài ra, một số hợp
chất trong lá và quả trà như acid tanic, oleic acid … là những thành phần quan trọng
được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm [5].
Giá trị dược liệu của trà hoa vàng
Giá trị dược liệu là giá trị đáng quý nhất của cây Trà hoa vàng. Ngày nay, các
công trình khoa học đã chỉ ra ngày càng nhiều công dụng của cây trà. Riêng đối với
trà hoa vàng, các nghiên cứu đã cho thấy trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh
trưởng của các khối u đến 33,8%. Ngoài ra nó còn giúp giảm đến 35% hàm lượng
cholesterol, 36,1% lượng lipoprotein trong máu, cao hơn 10% so với các biện pháp

8


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

sử dụng tây dược hiện nay. Các chế phẩm từ trà hoa vàng có khả năng làm giảm biểu
hiện triệu chứng xơ vữa động mạch, điều hòa huyết áp. Bên cạnh đó, một số bệnh về
đường hô hấp, bài tiết đều có thể sử dụng thức uống nay như một phương pháp chữa

trị đơn giản và sớm mang lại kết quả.
Đất nước Trung Quốc từ lâu đã khai thác tiềm năng to lớn từ giá trị dược liệu
của cây trà hoa vàng. Họ đã xây dựng nên Vườn Camellia Quốc tế, trồng nhân tạo
vùng Trà hoa vàng nguyên liệu, nghiên cứu và sản xuất thành công các chế phẩm từ
trà hoa vàng như Golden Camellia, Superior tea… là những mặt hàng có giá trị và
đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ hàng năm. Việt Nam cũng là một trong số các nước
có số loài trà hoa vàng phong phú bậc nhất trên thế giới, tuy nhiên việc nghiên cứu
ứng dụng và khai thác giá trị dược liệu của các loài này còn chưa được chú trọng.
Công tác bảo tồn chưa được tốt, lượng cá thể tự nhiên hàng năm suy giảm đáng kể là
một thực trạng đáng buồn và đe dọa trực tiếp đến nguồn gen quý giá này [5].
Giá trị thẩm mỹ - làm cây cảnh
Chi trà là chi có hoa lớn, đẹp, nhiều màu sắc, một số loài hoa nở đúng vào dip
Tết Nguyên đán nên thường được sử dụng để chơi như cây cảnh. Việc lai tạo, phối
hợp các màu hoa cũng như thu hút sự chú ý của các nhà lai tạo, làm tăng giá trị của
cây trà lên nhiều lần nếu có thể tạo ra giống trà có màu hoa hiếm và độc đáo [5].
1.2 Tổng quan về mã vạch ADN
1.2.1 Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode)
Phân loại thực vật từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng trong việc
làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và đa dạng thực vật. Phương
pháp phân loại truyền thống được xây dựng và phát triển xưa nay là phương pháp
phân loại dựa trên đặc điểm hình thái các loài thực vật. Phương pháp phân loại này
chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan thực vật, đặc biệt là cơ quan
sinh sản. Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đây chưa phải là phương pháp tối ưu trong
việc phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển, các mẫu có đặc điểm giống
nhau do hiện tượng tiến hóa đồng quy, các mẫu không có đủ các bộ phận [3]… Ngoài

9


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia
hình thái học, việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [31]. Khắc phục
những hạn chế của phương pháp phân loại hình thái, từ giữa những năm 1990, một
phương pháp loại mới dựa trên lĩnh vực sinh học phân tử đã được hình thành. Phương
pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân (ADN) hoặc
sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có
thể lựa chọn các gen hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [83]. Trong phương
pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu tính đa
dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại
cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi. Một số kỹ thuật có thể kể
đến được sử dụng phổ biến trên thế giới như RFLP (đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế),
VNTR (số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề), DNA barcode (mã vạch
ADN)...[41, 42]
Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada – Paul Hebert - đã đề
xuất một phương pháp xác định loài dựa trên mã vạch ADN (DNA barcode) [31]. Mã
vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ
tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình
tiến hóa [31, 46]. Ngoài ra việc lựa chọn một vùng trình tự làm mã vạch ADN còn
cần phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp (không quá ngắn để có độ đa
hình về trình tự giữa các taxon, không quá dài để có thể giải trình tự theo cách thông
thường, thậm chí cả khi trong điều kiện chưa được tối ưu); không phải vùng dị hợp
để có thể nhân bản trực tiếp trình tự mà không cần tách dòng; thuận lợi trong việc so
sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các base và không có đoạn trình tự chưa chắc
chắn như một vài đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [36]. Dựa vào
mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các
sinh vật, tương tự như máy quét mã vạch trong siêu thị [60]. Hai mẫu vật của hai loài
có thể có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng
cách sử dụng mã vạch ADN. Với ưu thế đó, mã vạch ADN có thể được sử dụng cho

10


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các loài đã được mô tả [90] và tìm
ra các loài mới chưa được mô tả [33].
Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân
loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus [29, 34,
50, 79]. Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong việc phân biệt
các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ
sở để định danh hoặc phân biệt loài [15, 81].
Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém nhiều
công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện
được. Thay vào đó, việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc trưng cho loài (thậm
chí cá thể) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài này với loài khác
là giải pháp hiệu quả trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định
nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hướng
nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài, giám
định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản
phẩm nông - lâm - thủy sản,…)[43].
Việc sử dụng mã vạch ADN để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý
nghĩa ngày càng lớn. Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã có trên 6000 công
trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự Mã vạch ADN ở các loài sinh
vật theo số liệu của BOLD [98]. Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng mã
vạch ADN, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN
làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [39, 54, 97].
Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:
- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự).

- Trình tự có tính đặc hiệu cao.
- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [39].

11


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

Mỗi đoạn mã vạch có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật
ở các mức độ khác nhau: chi, họ, loài hay dưới loài. Các đoạn mã vạch ADN có thể
là những đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S, 26S, ITS…)[8, 18, 19, 78], hệ gen
ty thể (Cytb, CO1…)[8, 12, 34], hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH – psbA...) [36, 38,
58, 85]. Tuy nhiên, chưa có đoạn ADN nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất
cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn những đoạn ADN đặc trưng và việc
phối hợp các đoạn mã vạch ADN sẽ đem lại hiệu quả cao hơn [25, 27]. Tùy vào đối
tượng giám định mà các đoạn mã vạch ADN sẽ được sử dụng một cách hợp lý [16,
39, 51].
1.2.2 Một số đoạn mã vạch ADN được sử dụng
Mã vạch ADN ở động vật
Việc lựa chọn đoạn trình tự làm mã vạch ADN cho động vật đã được nghiên
cứu trong nhiều công trình khoa học [34, 35, 89, 95, 96]. Theo đó, mã vạch ADN có
thể là một hoặc một vài locus có thể thu được trình tự một cách tương đối dễ dàng và
đáng tin cậy. Các đoạn mã vạch ADN có thể thu từ các vùng, hệ gen khác nhau, tuy
nhiên đều phải mang đặc điểm là có khả năng so sánh, phân biệt giữa các loài, nói
cách khác là trình tự các đoạn mã vạch ADN phải có ý nghĩa cung cấp thông tin nhận
dạng về mặt di truyền [15, 31]. Để làm được điều đó đòi hỏi vùng chứa các đoạn mã
vạch ADN phải có tỷ lệ đột biến trong quá trình tiến hóa đủ chậm để hạn chế tối đa
sự sai khác trong loài, tuy nhiên phải đủ nhanh để có thể phân biệt những cá thế khác
loài [31, 37]. Ở động vật, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể là vùng gen có ưu thế hơn
trong việc lựa chọn ra các locus là mã vạch ADN do có tốc độ tiến hóa nhanh [13,

75]. Hệ gen ty thể (mtDNA) ở động vật là một vòng xoắn kép bao gồm 13 gene mã
hóa protein, 2 gen ribosome, vùng điều hòa không mã hóa protein và các gen mã hóa
tRNA. Mỗi tế bào có thể có một vài ty thể, do vậy trong trường hợp phân tích một
lượng mẫu nhỏ, hệ gen ty thể cho thấy ưu thế hơn do có nhiều bản sao của trình tự
quan tâm [84, 89].

12


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

Cytochrome c oxidase là một họ protein xuyên màng lớn được tìm thấy ở ty
thể, là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp [92]. Protein này bao gồm một
vài tiểu đơn vị có nguồn gốc từ nhân và 3 tiểu đơn vị được tổng hợp từ ty thể. Các
tiểu đơn vị ở ty thể được biết đến là các tiểu đơn vị I, II, III, trong đó tiểu đơn vị COI
chủ yếu được gắn trên màng của mào ty thể [68, 89]. Các nucleotide của gen mã hóa
cho tiểu đơn vị này có sự biến đổi đủ để phân biệt giữa các loài. Ngược lại, sự biến
đổi trong loài thường thấp hơn 10% so với quan sát ở các loài khác nhau [34]. Cùng
với việc đột biến mất đoạn hay thêm đoạn ít khi xảy ra, đoạn trình tự COI là sự lựa
chọn phù hợp và được sử dụng rộng rãi để làm mã vạch ADN ở động vật [89].
Do có sự khác biệt lớn ở hệ gen ty thể giữa các loài nên cặp mồi được thiết kế
để sử dụng nhân bản đoạn CO1 ở từng loài cũng khác nhau [56, 87]. Tuy nhiên khi
cặp mồi được thiết kế phù hợp với trình tự, hiệu quả sử dụng gene COI để phân biệt
nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao
ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài. Nhiều nghiên cứu đã được thử
nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CO1 trong phân loại các nhóm động vật đa
dạng, phân bố trên đất liền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt
đới, giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác
định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, các loài chỉ
vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên [32, 34, 89]. Ở động vật ngoài locus

gen COI còn có một vài đoạn trình tự khác cũng được sử dụng làm Mã vạch ADN
như đoạn Cytb (cytochrome b), đoạn gene mã hóa ARN ribosome 12S, 16S… Đây
đều là những đoạn trình tự thuộc hệ gen ty thể và có mức độ sai khác lớn giữa các
loài, từ đó có thể cùng với đoạn COI đem lại khả năng giám định và nhận diện các
loài tốt hơn [8, 31].
Mã vạch ADN ở thực vật
Khác với ở động vật, hệ gen ty thể không phù hợp để lựa chọn ra các đoạn mã
vạch ADN do hệ gen này tiến hóa chậm ở thực vật [29, 36]. Thay vào đó, một số
vùng trình tự trong hệ gen lục lạp đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng

13


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

phân biệt tốt ở các loài thực vật và nghiên cứu phát sinh loài [11, 36, 66]. Hệ gen lục
lạp được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1962. Lượng ADN ở hệ gen lục lạp tương
đối lớn, chiếm khoảng 15% tổng lượng ADN của tế bào. Phần lớn các hệ gen ở lục
lạp là một phân tử ADN dạng mạch vòng, dài khoảng 120000-170000bp với khoảng
100 gen mã hóa protein và các gen mã hóa tRNA và rRNA [20, 80]. Một đặc điểm
của hệ gen lục lạp đó là có các trình tự lặp đảo ngược với chiều dài có thể lên tới
25000bp [45]. Ngoại trừ một vài trường hợp ngoại lệ, hệ gen lục lạp thường bao gồm
hai trình tự lặp đảo ngược như hai tấm gương phản chiếu lẫn nhau. Hai vùng trình tự
này được ngăn cách bởi vùng trình tự đơn bản lớn và nhỏ. Nghiên cứu thực nghiệm
đã cho thấy tỷ lệ nucleotide thay thế ở vùng đơn bản thường cao gấp 2,3 lần so với
vùng lặp lại đảo ngược, do đó phần lớn các nghiên cứu về mã vạch ADN thường tập
trung ở vùng trình tự đơn bản [80]. Các gen thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có
thể được chia thành 3 nhóm như sau: Nhóm 1 là các gen mã hóa những yếu tố thuộc
hệ thống quang hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB...), cytochrome b6f
(petA, petB...), ATP synthase (atpA, atpB...), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H

dehydrogenease (ndhA, ndhB...); Nhóm 2 là các gen mã hóa cho các rRNA (rrn16,
rrn5...), trnA (trnH, trnK...), RNA polymerase (rpoA, rpoB...), các gen tiểu phần
ribosome (rps2,rps3...); và nhóm 3 gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ
chức năng) và các gen mã hóa protein như matK, cemA. Mỗi đoạn mã vạch ADN có
những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví
dụ, các đoạn ADN như: 18S, 16S, 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và
chi; các đoạn ADN, như: 26S, rbcL, ndnF, atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và
loài; các đoạn ADN, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức
loài và dưới loài [99]. Cho đến nay đã có 7 dấu chuẩn gen lục lạp được sử dụng rộng
rãi làm Mã vạch ADN cho thực vật, bao gồm 4 đoạn trình tự mã hóa là matK, rbcL,
rpoB, rpoC1 và 3 đoạn không mã hóa là atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI [29, 36,
39]. Ngoài các đoạn mã vạch trong hệ gen lục lạp, một đoạn trình tự khác trong hệ
gen nhân cũng được sử dụng rộng rãi làm dấu chuẩn nhận biết ở thực vật đó là đoạn
ITS. Đây là đoạn trình tự cho thấy mức độ khác biệt tương đối lớn giữa các loài bên

14


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

cạnh các trình tự trong hệ gen lục lạp [38, 39]. Mỗi đoạn mã vạch đều có ưu điểm và
nhược điểm riêng, do đó tùy vào từng trường hợp để có thể lựa chọn đoạn Mã vạch
ADN cho phù hợp hoặc kết hợp nhiều đoạn mã vạch với nhau nhằm nâng cao hiệu
quả trong việc giám định và nghiên cứu phát sinh loài ở thực vật [48, 53].
Đoạn trình tự matK là một trong những đoạn trình tự tiềm năng nhất được sử
dụng làm Mã vạch ADN ở thực vật [48]. Đoạn matK có độ dài xấp xỉ 1570bp và mã
hóa cho protein maturase K. Trình tự này nằm bên trong đoạn intron của đoạn gen
trnK ở lục lạp và nằm trên vùng trình tự đơn bản lớn [97]. Ờ loài cây mô hình
Arabidopsis thaliana đoạn mã vạch matK có độ dài 801bp, nằm ở vị trí 205-1046 của
đoạn gen [39]. Với mức độ tiến hóa cao, đoạn matK được sử dụng để xây dựng nên

hệ thống phát sinh của những taxon bậc cao như bộ và họ, một vài trường hợp ở
những bậc thấp hơn là chi và loài [97]. Ưu điểm của đoạn trình tự matK là có khả
năng phân biệt tốt, tuy nhiên nhược điểm của đoạn trình tự này đó là khó khuếch đại,
đặc biệt là khi đối tượng nghiên cứu không phải là thực vật hạt kín [29, 36, 39].
Để khắc phục nhược điểm trên của trình tự matK, nhóm nghiên cứu CBOL đã
đề xuất một mã vạch cốt lõi bao gồm hai vùng trình tự trong hệ gen lục lạp là
matK+rbcL [29]. Đoạn trình tự rbcL mã hóa cho enzyme Rubisco tham gia vào quá
trình cố định carbon ở thực vật, có chiều dài 599bp ở đầu 5’ của gen trong hệ gen lục
lạp của loài Arabidopsis thaliana [39]. Ưu điểm của đoạn trình tự này là dễ khuếch
đại ở phần lớn thực vật và được biết đến như một locus chuẩn trong nghiên cứu hệ
thống phát sinh loài bởi nó đưa ra một vị trí đáng tin cậy cho taxon trong các họ hay
chi thực vật [46]. Mặc dù tiến hóa chậm và khả năng phân biệt khiêm tốn, nhưng khi
kết hợp với đoạn trình tự matK, bộ đôi rbcL+matK đã cho thấy ưu thế như một mã
vạch cốt lõi dựa trên sự khuếch đại đơn giản của đoạn rbcL và khả năng phân biệt
cao của đoạn matK [14, 29].
Một đoạn mã vạch khác nằm trong hệ gen lục lạp được sử dụng rộng rãi ở các
loài thực vật có hoa là đoạn trình tự không mã hóa trnH-psbA [10, 36]. Đây là đoạn
trình tự có chiều dài thay đổi ở các loài khác nhau, khoảng 286-504bp [88]. Với ưu

15


Hoàng Minh Trang – K23 QH2014

điểm là dễ dàng nhân lên bằng một cặp mồi ở 95% các loài, đoạn trình tự này cho
thấy được ưu thế so với matK khi cùng với trình tự ITS là hai vùng có khả năng phân
biệt tốt nhất [46, 69]. Tuy nhiên, việc sử dụng đoạn mã vạch trnH-psbA như một mã
vạch tiêu chuẩn gặp phải khó khăn khi đọc trình tự do thường xuyên có những đơn
nucleotide lặp lại dẫn đến việc đọc bị dừng lại sớm. Nhằm hạn chế nhược điểm đó,
các thử nghiệm sử dụng các enzyme polymerase mới đã được nghiên cứu và đem lại

hiệu quả đáng kể khi có thể chạy được đoạn trình tự dài 13 đơn nucleotide lặp lại
[39].
Đoạn trình tự liên gen atpF-atpH và psbK-psbI được đề xuất làm mã vạch cho
thực vật ở hội thảo quốc tế Barcode of life lần thứ hai [51]. Cả hai đoạn đều nằm
trong vùng trình tự đơn bản lớn của hệ gen lục lạp. Hai đoạn gen atpF và atpH mã
hóa cho hai tiểu đơn vị tổng hợp ATP là CFO I và CFO III, trong khi đó hai gen psbK
và psbI mã hóa cho hai polypeptide có khối lượng phân tử thấp là K và I của hệ thống
quang hóa II [49]. Giống như trnH-psbA, hai đoạn trình tự liên gen này cũng có chiều
dài thay đổi giữa các loài, khoảng 579-622bp với đoạn atpF-atpH và 185-576bp đối
với psbK-psbI [88]. Hai trình tự này trước đó không được sử dụng rộng rãi trong hệ
thống học và phân loại học thực vật, do vậy không có nhiều kết quả được công bố.
Theo nghiên cứu của nhóm nghiên cứu thực vật CBOL, psbK-psbI cho kết quả phân
biệt tốt, song chất lượng trình tự và tính phổ biến không cao, trong khi đó atpF-atpH
cho kết quả khiêm tốn nhất trong việc phân biệt các loài và mức độ phổ biến cũng
như chất lượng trình tự chỉ ở ngưỡng trung bình [29, 39]. Một số nghiên cứu gần đây
đã cung cấp những kết quả khả quan cho cả hai đoạn atpF-atpH [62, 88] đối với các
loài thuộc chi Ceratozamia cùng một số loài trong họ Lemnaceae, và psbK-psbI đối
với các loài thuộc chi Dioon và Zamia (>50%) [61]. Kết quả này cũng được báo cáo
trong các nghiên cứu về thực vật có hoa ở Hàn Quốc (Ki-Joong Kim).
Hai đoạn trình tự còn lại trong số 7 đoạn trình tự lục lạp được sử dụng phổ
biến là làm mã vạch ADN là rpoB và rpoC1 [24, 39, 71]. Hai gen này đều thuộc họ
gen RPO bao gồm rpoA, rpoB, rpoC1 và rpoC2, mã hóa cho các tiều đơn vị khác

16