Luận văn Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Header Page
of 133.
Kỹ1thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

MỤC LỤC
A. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 2
B. NỘI DUNG................................................................................................ 5
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen ............................ 5
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen .................................................. 6
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật ...................................... 7
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp ........................................ 7
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens ........... 7
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus .............................................. 11
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp ....................................... 12
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)............................ 12
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ....................... 14
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) ............................. 14
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm ........................................... 15
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học ................................ 15
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) .................. 16
4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen .................................. 16
4.1. Lợi ích ............................................................................................ 16
4.2. Nguy cơ tiềm ẩn ............................................................................ 18
5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng
chuyển gen ............................................................................................... 20
6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen ........................... 21
6.1. Chuyển gen kháng sâu ................................................................. 21
6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ .................................................. 22
6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh .................................. 22
6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật............................ 24

6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh
dưỡng của cây ...................................................................................... 24
6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc.............................. 25
7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference
(RNAi) ...................................................................................................... 26
C. KẾT LUẬN ............................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36
Footer PageThủy
1 ofHồng
133.

1


Header Page
of 133.
Kỹ2thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

A. MỞ ĐẦU
Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật
chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử
dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực
vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này
được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây
khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện
được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai
xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần
cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và
thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài

có họ hàng gần nhau.
Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển
gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng
chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua,
cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh
vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất
những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật
chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng
những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được
giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống
truyền thống.
Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn
ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế
Footer PageThủy
2 ofHồng
133.

2


Header Page
of 133.
Kỹ3thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế
bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu,
gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của

những cơ thể chuyển gen.
Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt
như sau:
- Tăng sản lượng
- Giảm chi phí sản xuất
- Tăng lợi nhuận nông nghiệp
- Cải thiện môi trường
Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản
xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây
chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những
đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng
này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như:
- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt
- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột
- Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây
- Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh
dưỡng
- Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn
trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm:
- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc
làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm
- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ
hoang dại
Footer PageThủy
3 ofHồng
133.

3

Header Page
of 133.
Kỹ4thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra
từ cây chuyển gen
- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là
loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển
gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế,
công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số
vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu
được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.
Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo
ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con
người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự
nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ
sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt
quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao
của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.

Footer PageThủy
4 ofHồng
133.

4

Header Page
of 133.
Kỹ5thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

B. NỘI DUNG
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý
một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập
của một gen ngoại lai
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và
khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau.
Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp
và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế
bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác
hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen,
từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho
đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua
Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển
gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự
biểu hiện tạm thời của gen
- Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ
chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome
- Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó

chỉ ở nơi mà nó được đưa vào

Footer PageThủy
5 ofHồng
133.

5


Header Page
of 133.
Kỹ6thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại
không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại
trừ mô phân sinh (meristem).
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen
Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể
thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà
khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng.
Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium
không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt
các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển
gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di
(electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen
tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen
bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật
này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật.

Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện
genomic ADN)
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp
- Biến nạp vào E. coli
- Tách chiết ADN plasmid
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương
pháp khác nhau đã kể trên
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc
- Tái sinh cây biến nạp
Footer PageThủy
6 ofHồng
133.

6


Header Page
of 133.
Kỹ7thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot)
và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot,
ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...)
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ,
các mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và

dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần
tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những
enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo
thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo
thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn
chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern
blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi
gen.
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật
Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và
chuyển gen gián tiếp.
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
* Nguyên lý chung
Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để
chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay
nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác
và ổn định.
Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như
hình sau
Footer PageThủy
7 ofHồng
133.

7


Header Page
of 133.
Kỹ8thuật

chuyển gen thực vật & ứng dụng

Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing
plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA).
Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp
chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein
tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật,
T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế
bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ
này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan
tâm.

Footer PageThủy
8 ofHồng
133.

8


Header Page
of 133.
Kỹ9thuật
chuyển gen thực vật & ứng dụng

Bộ gen của
vi khuẩn

Ti plasmid

Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens

Cụ thể như sau:
Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti
plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai
thành phần: T- DNA và vùng Vir.
T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính
nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. TDNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp
các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì
đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật.
Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải.
Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA
đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều
hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất
diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối
cùng gắn gen cần biến nạp.

Footer PageThủy
9 ofHồng
133.

9


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ10
thuật

* Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen
thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể.
- Vector liên hợp (Cointegrated vector)
Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên
hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc
từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc
trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế
bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang
trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ
lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng
cho chuyển gen vào thực vật.
- Vector nhị thể (Binary vector)
Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp TADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng
thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang
gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi
plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những
sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù TADN nằm trên phân tử ADN khác.
* Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả,
đặc biệt là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều
giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa
hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống
lúa này đã giải quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự thiếu vitamin A ở
các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi.
* Ưu điểm
- Gen ít bị đào thải
Footer PageThủy
10 of
133.
Hồng

10


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ11
thuật

- Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn
nhau và câm lặng lẫn nhau.
- Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào
hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái
tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay
sau đó.
* Nhược điểm
- Có phổ tấn công giới hạn
- Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không
gây khối u cho cây một lá mầm (do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến
hoá nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi
bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái
tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm...)
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector
chuyển gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ
xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể
mang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên,
virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau:
- Hệ gen của virus phải là ADN
- Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các

lỗ ở vách tế bào
- Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen
này vào tế bào thực vật
- Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)
- Không gây tác hại đáng kể cho thực vật

Footer PageThủy
11 of
133.
Hồng

11


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ12
thuật

Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng
làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử
dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó
ghép nối với hệ gen của thực vật.
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Hình 3. Súng bắn gen

* Nguyên lý

Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích
thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 - 1,5 m với dung dịch có chứa đoạn
ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô
trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này
được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật
liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi
bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên
đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn)
vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn rồi
rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để

Footer PageThủy
12 of
133.
Hồng

12


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ13
thuật

tái sinh cây. Các gen cần chuyển có thể tái tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó
tạo thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen
chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium
áp lực cao để bắn gen.

Hình 4. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen

* Ưu điểm
- Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào
- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô
hóa và mô phân sinh)
* Nhược điểm

Footer PageThủy
13 of
133.
Hồng

13


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ14
thuật

Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của
phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời. Tuy nhiên, những năm gần
đây phương pháp này đã thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳng
định tính ưu việt của phương pháp này.
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
* Nguyên lý
Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp
xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời

gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho
ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta
chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần
chuyển vào thực vật.
Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong
khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất
hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ
gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau
quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo
là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen.
* Đối với protoplast phương pháp xung điện đã có kết quả khích lệ
nhưng chưa chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy
protoplast ở một số loài cây vẫn còn gặp khó khăn.
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Phương pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa ADN
những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast và cây
biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.
* Ưu điểm
Footer PageThủy
14 of
133.
Hồng

14


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng

Kỹ15
thuật

- Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào
- Quyết định được đưa ADN vào loại tế bào nào
- Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan
sát được
- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù
hạn chế về số lượng cũng có thể tiêm chính xác
- Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi
giống cây
* Nhược điểm
- Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào
- Thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast. Sau
khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen
mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù.
Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền
phù sâu khoảng 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo từng
nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với
tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây.
Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp,
chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái
sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài.
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học
Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen
vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG).
Khi có mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu
nhận ADN ngoại lai vào bên trong tế bào.

Footer PageThủy
15 of
133.
Hồng

15


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ16
thuật

Phương pháp chuyển gen bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loài
thực vật nhưng khả năng chuyển gen với tần số chuyển gen rất thấp. Tuy
nhiên, với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được
hạn chế của phương pháp này.
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)
(Ray Wu & cộng sự, 1988)
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen
không qua nuôi cấy mô invitro.
Nguyên tắc của phương pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây
theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen vào lúc hạt
phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt nhất là sự
chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử
chưa phân chia. Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái
duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không hình thành thể khảm.
- Sau thời gian hoa nở 1- 2 giờ, cắt 2/3 hoặc 3/4 phần trên của hoa lúa
- Sau khi cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa

dung dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy đã bị cắt
(nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 g/ml)
- Bao bông lúa lại, chờ lúa chín thu hái
- Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau
4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen
4.1. Lợi ích
Hiện nay, những sản phẩm lương thực- thực phẩm do công nghệ sinh
học tạo ra đã có mặt trên thị trường. Những cây trồng được biến đổi gen vẫn
giống những cây trồng truyền thống nhưng chúng có thêm một số đặc điểm
được cải thiện. Chúng không những có lợi cho nông dân mà còn cho cả
người tiêu dùng. Người nông dân gặt hái được những vụ mùa bội thu, trong
Footer PageThủy
16 of
133.
Hồng

16


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ17
thuật

khi người tiêu dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn.
Ngoài ra, những giống mới được tạo ra bằng công nghệ sinh học còn có tiềm
năng bảo vệ môi trường. Trên thị trường hiện nay, đã có một số loại cây
trồng công nghệ sinh học được cải thiện tình trạng và chất lượng như:
- Có khả năng chống chịu bệnh

- Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu
- Tăng thành phần dinh dưỡng
- Tăng thời gian bảo quản
Nhìn chung, việc sử dụng các giống cây trồng chuyển gen có thể đem
lại lợi nhuận đáng kể cho các nước đang phát triển. “Thế hệ đầu tiên” của
những giống cây này đã chứng minh được khả năng tăng năng suất cây
trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp và góp phần
bảo vệ môi trường. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng đến các cây trồng
biến đổi gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng
và khả năng chế biến. Các giống cây trồng này sẽ khẳng định được giá trị
của chúng ở những quốc gia có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm.
Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể
giúp giảm liều lượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng. Ví dụ: ở
Trung Quốc bông Bt đã giảm thuốc diệt côn trùng 40 kg/ha.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở
những vùng sử dụng thuốc. Ví dụ: nước chảy qua các cánh đồng bông Bt ở
Mỹ hoàn toàn không còn nhiễm thuốc trừ sâu trong suốt 4 năm nghiên cứu
của Bộ nông nghiệp Mỹ.
Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không
cày đất, một yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai trở nên phổ biến.
Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy
hơn so với khi trồng cây cải dầu truyền thống.
Footer PageThủy
17 of
133.
Hồng

17

Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ18
thuật

Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với
diện tích đất canh tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn. Ví
dụ: ở Mỹ, năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân.
4.2. Nguy cơ tiềm ẩn
* Cây chuyển gen được đánh giá như thế nào đối với an toàn môi
trường?
Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi
trường trước khi đưa ra thị trường. Chúng được các nhà chức trách đánh giá
tuân theo các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên khắp thế giới đưa ra
(Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển
kinh tế năm 1992; chính phủ Canada năm 1994). Những người đánh giá ảnh
hưởng của cây chuyển gen gồn những người tạo ra chúng, các cơ quan kiểm
soát và các nhà khoa học.
Hầu hết các quốc gia sử dụng các quy trình đánh giá tương tự để xét
xem sự tương tác giữa cây chuyển gen và môi trường. Bao gồm những thông
tin về vau trò của gen được đưa vào, ảnh hưởng của nó đối với vây nhận
gen, đồng thời cả những cây hỏi cụ thể về ảnh hưởng không mong muốn
như: ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong môi
trường đó.
Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc
xâm chiếm những nơi cư ngụ mới không? Khả năng gen phát tán ngoài ý
muốn từ cây chuyển gen sang loài khác và những hậu quả có thể.
* Cây chuyển gen, những rủi ro có thể
Khả năng xẩy ra lai chéo xa của gen được chuyển vào với các cây cỏ

họ hàng, cũng như khả năng tạo ra những loại cỏ mới.
Lai chéo xa là lai không mong muốn giữa cây trồng với một cây có
quan hệ họ hàng. Lo ngại chính về ảnh hưởng của cây chuyển gen đối với
Footer PageThủy
18 of
133.
Hồng

18


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ19
thuật

môi trường là khả năng tạo ra loài cỏ mới thông qua lai chéo xa với các cây
họ hàng hoang dại hoặc đơn giản hơn là tồn tại lâu trong tự nhiên.
Khả năng trên có thể xảy ra, được đánh giá trước quá trình chuyển gen
và được kiểm soát sau khi cây được đưa ra trồng. Một nghiên cứu bắt đầu từ
năm 1990 kéo dài 10 năm chứng minh rằng thực vật chuyển gen (như cải
dầu, khoai tây, ngô, củ cải đường) không làm tăng nguy cơ xâm chiếm hay
tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên so với các cây không chuyển gen
tương ứng. Các tính trạng như chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng
đồng thời được điều tra so với những cây không chuyển gen tương ứng
(Crawley và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu phát biểu rằng
những kết quả này không có nghĩa là sự thay đổi di truyền không thể làm gia
tăng tính hoang dại hay khả năng phát tán của cây trồng mà chúng chỉ ra
rằng những cây trồng năng suất khó có thể tồn tại lâu dài mà không được

canh tác. Do đó, việc đánh giá cây chuyển gen theo từng trường hợp như đã
quy định là rất quan trọng.
* Ảnh hưởng trực tiếp lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt
Tháng 5 năm 1999, xuất hiện báo cáo rằng hạt phấn từ cây ngô Bt có
ảnh hưởng bất lợi đối với ấu trùng bướm Monarch. Báo cáo này gây ra
những lo lắng về nguy cơ tiềm tàng đối với bướm Monarch và có thể đối với
những sinh vật không phải là sinh vật cần diệt khác. Một số nhà khoa học lại
cho là cần phải thận trọng trong việc giải thích những kết quả nghiên cứu vì
nghiên cứu phản ánh một tình huống khác với thực trạng môi trường.
Tác giả chỉ ra rằng nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành trong
phòng thí nghiệm và là khởi đầu của những vấn đề quan trọng nhưng chỉ dựa
vào nó không đủ cơ sở để rút ra kết luận về nguy cơ đối với quần thể bướm
Monarch trên cánh đồng.

Footer PageThủy
19 of
133.
Hồng

19


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ20
thuật

Một báo cáo của Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ chỉ ra các số liệu đã
chứng minh rằng protein trong cây trồng không có ảnh hưởng bất lợi đối với

sinh vật không phải là sinh vật cần diệt. Thêm vào đó, một nghiên cứu của
trường Đại học Linnois chỉ ra rằng bướm Monarch không bị gây hại bởi hạt
phấn Bt trong điều kiện đồng ruộng thực sự.
* Phát triển tính kháng của côn trùng
Một lo ngại khác về thực vật Bt là sự phát triển tính kháng của côn
trùng đối với Bt. Chính phủ, Bộ ngành và các nhà khoa học đã đưa ra các kế
hoạch quản lý tính kháng của côn trùng để giải quyết vấn đề này.
Những kế hoạch này bao gồm một quy định rằng mọi cánh đồng trồng
cây chuyển gen kháng côn trùng phải có cả cây không chuyển gen để côn
trùng phát triển mà không bị chọn lọc đối với những giống kháng sâu.
Những biện pháp quản lý tính kháng khác cũng đang được các nhà
khoa học trên khắp thế giới xây dựng.
5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng
chuyển gen
Công nghệ chuyển gen vào cây trồng hiện nay không còn là vấn đề
phải tranh cãi mà nó trở thành kỹ thuật thông dụng để tạo ra giống cây trồng
mới, phục vụ trực tiếp cho trồng trọt. Những mốc quan trọng trong sự phát
triển kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là:
Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển ADN ngoại lai vào cây nhờ
Agrobacterium.
Năm 1983: Tạo marker chọn lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị kháng
với kháng sinh. Thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài gen
mong muốn vào plasmid Ti).
Năm 1984: Thực hiện chuyển gen trực tiếp và gián tiếp vào tế bào
protoplast.
Footer PageThủy
20 of
133.
Hồng

20


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ21
thuật

Năm 1985: Tạo các giống cây trồng kháng virus, đưa cây chuyển gen
ra đồng ruộng.
Năm 1987: Chuyển gen kháng sâu bằng súng bắn gen.
Năm 1988: Tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm.
Năm 1990: Chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy vô
tính.
Năm 1992: Chuyển gen cho lúa mì.
Năm 1994: Thương mại hóa cà chua chuyển gen. Đây là sản phẩm
chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa.
Năm 1998: Toàn thế giới có 48 giống cây trồng chuyển gen được
thương mại hóa.
Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm
lượng vitamin A cao.
Từ năm 2000 đến nay, cây trồng chuyển gen không ngừng phát triển.
Năm 2000, toàn thế giới có 44,2 triệu ha trồng cây chuyển gen thì đến năm
2003 tăng lên 67,6 triệu ha. Có 6 nước trồng cây chuyển gen phổ biến là: Mỹ
42,8 triệu ha; Acgentina 13,9 triệu ha; Canada 4,4 triệu ha; Braxin 3 triệu ha;
Trung Quốc 2,8 triệu ha; Nam Phi 0,4 triệu ha.
Các cây chuyển gen chính là đậu tương (chiếm 61%), ngô (23%),
bông (11%), đu đủ (21%). Các gen chính được chuyển là gen kháng thuốc
trừ cỏ, gen kháng sâu.

6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen
6.1. Chuyển gen kháng sâu
Trong 30 năm gần đây, trong sản xuất nông nghiệp, người ta sử dụng
thuốc trừ sâu vi sinh Bt do vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn
này sản xuất ra các protein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của côn trùng
nhưng không gây độc đối với động vật có xương sống.
Footer PageThủy
21 of
133.
Hồng

21


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ22
thuật

Tinh thể protein độc tố của vi khuẩn này khi vào một côn trùng sẽ bị
các enzym protease phân giải thành các đoạn peptit, trong đó có đoạn khối
lượng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn
trùng. Các gen mã hóa độc tố này nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi
chung là Cry (crystal).

Hình 5. Chuyển gen kháng sâu bệnh

6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Thuốc diệt cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự phân

hủy và ít gây ô nhiễm môi trường. Cơ chế diệt cỏ là thuốc kìm hãm sự hoạt
động của một enzym có tên là enol pyruvat sikimat phosphat synthetase
(EPSPS). Enzym EPSPS có chức năng chuyển hóa sản phẩm quang hợp
thành axit mang mạch vòng có tên là axit sikimic. Axit sikimic không được
hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm cỏ
chết.
Cây trồng được tạo ra có hàm lượng và hoạt tính của enzym EPSPS
cao gấp 4 lần so với cây trồng bình thường và cây hoàn toàn chống chịu
được với thuốc diệt cỏ glyphosat.
6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh
Có nhiều cách tạo cây kháng virus, chuyển gen mã hóa protein vỏ của
virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus (ví dụ enzym ribozyme), hoặc

Footer PageThủy
22 of
133.
Hồng

22


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ23
thuật

chuyển gen có trình tự đối bản (antisens) với ARN của virus. Các đối bản
này sẽ khóa lại sự sao chép và sự phiên mã của ARN virus. Kỹ thuật chuyển
gen mã hóa vỏ protein của virus thường được sử dụng phổ biến. Virus có

cấu tạo 2 phần: phần lõi là axit nucleic (ADN hoặc ARN) và phần vỏ là
protein. Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ của virus ở trong tế bào của cây
thì sẽ gây hiệu ứng kìm hãm sự tổng hợp protein vỏ của gen tạo vỏ ở virus.
Do vậy virus không nhân lên được.
Nhiều loại cây trồng được chuyển gen tạo vỏ của nhiều loại virus nên
đã kháng được các virus gây bệnh như: đu đủ kháng với virus gây bệnh đốm
vòng; cây thuốc lá kháng với virus khảm dưa chuột; cây thuốc lá kháng với
virus khảm alfa; khoai tây kháng với virus X, virus Y; khoai tây kháng với
virus xoăn lá; cây cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza …

Hình 6. Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và đối chứng

Hình 7. Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối chứng
(PRSV: Papaya ringspor virus, gây bệnh đốm vòng)
Footer PageThủy
23 of
133.
Hồng

23


Header Page
of chuyển
133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ24
thuật

6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật
Các nhà khoa học đã tìm cách giải trình tự các gen mã hóa cho protein

động vật, thiết kế lại, sau đó chuyển các gen này vào thực vật, biến thực vật
thành cơ thể sản xuất protein động vật.
Ví dụ: gen tổng hợp lactoferrin là một protein có trong sữa người,
được chuyển vào khoai tây, lúa và thu được cây khoai tây, cây lúa có khả
năng tổng hợp lactoferrin.
Một hướng quan trọng khác là sản xuất “thực phẩm chức năng”. Điều
đó có nghĩa là cần chuyển nhiêu gen tổng hợp ra các protein có tác dụng như
là các kháng nguyên vào các đối tượng cây trồng như rau, đậu, cây ăn quả.
Do vậy các cây này tạo ra các vacxin. Nhờ đó có thể ăn rau, đậu, hoa, quả
của cây trồng được chuyển gen tạo vacxin này để thay thế cho việc tiêm
vacxin phòng bệnh.

Hình 8. Thực phẩm chức năng

6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh
dưỡng của cây
Đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein chứa nhiều methionin
vào đậu tương và ngô, kết quả là làm tăng loại protein giàu methionin lên
hơn 8% trong tổng số protein có trong hạt.

Footer PageThủy
24 of
133.
Hồng

24


Header Page
of chuyển

133. gen thực vật & ứng dụng
Kỹ25
thuật

Người ta cũng đã chuyển thành công gen mã hóa cho việc tổng hợp
chất thaumatin (chất có độ ngọt gấp hàng nghìn lần so với đường mía) vào
cây khoai tây. Kết quả toàn bộ thân, lá, rễ và củ khoai tây đều ngọt.

Hình 9. Hạt gạo vàng

Người ta cũng đã chuyển nhóm gen mã hóa cho các enzym chuyển
hóa pyrophosphat thành β- caroten. Gạo có hàm lượng β- caroten giải quyết
vấn đề thiếu vitamin A cho con người.
6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc

Hình 10. Đa dạng màu hoa

Màu sắc hoa, đặc biệt là hoa có những màu xanh, nhung đen rất có giá
trị. Trong mô của cánh hoa, nhất là các tế bào biểu bì thường chứa các sắc tố

Footer PageThủy
25 of
133.
Hồng

25