Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan đến quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các ph

Header Page 1 of 133.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HỢP TÁC KH&CN
VIỆT NAM-CỘNG HÒA PHÁP
NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA INTERFERENCE)
Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ QUỲNH MAI

7825
26/3/2010

HÀ NỘI – 2009

Footer Page 1 of 133.


Header Page 2 of 133.

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM – CỘNG HÒA PHÁP

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ðỀ TÀI/DỰ ÁN

NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ LIÊN
QUAN ðẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA interference)
Chủ nhiệm ñề tài/dự án:
(ký tên)

Cơ quan chủ trì ñề tài/dự án:
(ký tên và ñóng dấu)

TS. Lê Quỳnh Mai

Ban chủ nhiệm chương trình
(ký tên)

PGS. TS. Lê Huy Hàm

Bộ Khoa học và Công nghệ
(ký tên và ñóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội – 2009
Footer Page 2 of 133.

Header Page 3 of 133.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

__________________

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc
Hà Nội, ngày

tháng

năm 200...

BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ðỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên ñề tài/dự án: Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan
ñến quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA ( RNA interference)
Mã số ñề tài, dự án:
Thuộc: Chương trình hợp tác Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Cộng hòa Pháp
2. Chủ nhiệm ñề tài/dự án:
Họ và tên: Lê Quỳnh Mai
Ngày, tháng, năm sinh:

01/12/1980

Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học:

Nghiên cứu viên.

Chức vụ:............................

ðiện thoại: Tổ chức: +844 37544711 Nhà riêng: ................Mobile: ..............
Fax: ....................................... E mail:
Tên tổ chức ñang công tác: Viện Di truyền Nông nghiệp
ðịa chỉ tổ chức: Km2, Phạm Văn ðồng, Từ liêm, Cầu giấy, Hà Nội.
ðịa chỉ nhà riêng: Số nhà 11B, ngõ 27, phố Võng Thị, phường Bưởi, Quận
Tây Hồ, Hà Nội.
3. Tổ chức chủ trì ñề tài/dự án:
Tên tổ chức chủ trì ñề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp
ðiện thoại: +844 37544711

Footer Page 3 of 133.

Fax: 844 37540984


Header Page 4 of 133.

E-mail:
Website: .................................................................................................
ðịa chỉ: Km2, Phạm Văn ðồng, Từ liêm, Cầu giấy, Hà Nội.
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS. TS. Lê Huy Hàm

Số tài khoản: 301.01.035.4
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Từ Liêm, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản ñề tài: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
4. Chủ nhiệm ñề tài ñối tác nước ngoài
Họ và tên: Pascal Gantet
Học hàm, học vị, chuyên môn: Giáo sư
Chức danh khoa học: Giáo sư trường ðH Montppellier 2, Pháp
ðiện thoại cơ quan: +33 (0) 67 61 65 44
Fax: 33 (0) 67 61 56 05
E-mail:
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện ñề tài/dự án:
- Theo Hợp ñồng ñã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 ñến tháng 12/ năm 2009.
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 ñến tháng 12/năm 2009.
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.250 tr.ñ, trong ñó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH:1.250 tr.ñ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.ñ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi ñối với dự án (nếu có): …………............................
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Số
TT
1

Theo kế hoạch
Thời gian
Kinh phí
(Tháng, năm)
(Tr.ñ)
01/2008 –

400

Footer Page 4 of 133.

Thực tế ñạt ñược
Thời gian
Kinh phí
(Tháng, năm)
(Tr.ñ)
01/2008 – 12/
379,5

Ghi chú
(Số ñề nghị
quyết toán)


Header Page 5 of 133.

2

12/2008
01/2009 – 12/
2009

2008
01/2009 – 12/
2009

850

766,55

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
ðối với ñề tài:
ðơn vị tính: Triệu ñồng
Số
TT

Nội dung
các khoản chi

Theo kế hoạch

1

Trả công lao ñộng
(khoa học, phổ
thông)

350

350

Nguồn
khác
0

2

Nguyên, vật liệu,
năng lượng
Thiết bị, máy móc
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
ðoàn ra
ðoàn vào
Chi khác
Tổng cộng

500

500

0

497,825 497,825

0

202
64
134
1.250

202
64
134
1.250

0
0
0
0

201,912 201,912
46,5
46,5
99,879 99,879
1.146,1 1.146,1

0
0

3
4
5
6
7

Tổng

SNKH

Thực tế ñạt ñược
Tổng

SNKH

315,56

315,56

Nguồn
khác
0

0

- Lý do thay ñổi (nếu có):

ðối với dự án:
ðơn vị tính: Triệu ñồng
Số
TT

Nội dung
các khoản chi

1

Thiết bị, máy móc
mua mới
Nhà xưởng xây
dựng mới, cải tạo
Kinh phí hỗ trợ công
nghệ

2
3

Footer Page 5 of 133.

Theo kế hoạch
Tổng

SNKH

Nguồn
khác

Thực tế ñạt ñược
Tổng

SNKH

Nguồn
khác


Header Page 6 of 133.

4
5
6
7

Chi phí lao ñộng
Nguyên vật liệu,
năng lượng

Thuê thiết bị, nhà
xưởng
Khác
Tổng cộng

- Lý do thay ñổi (nếu có):
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện ñề tài/dự án:
(Liệt kê các quyết ñịnh, văn bản của cơ quan quản lý từ công ñoạn xác ñịnh nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí, hợp ñồng, ñiều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện...
nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì ñề tài, dự án (ñơn, kiến nghị ñiều chỉnh ... nếu có)
Số
TT

Số, thời gian ban
hành văn bản

1

Quyết ñịnh số 355/QðBKHCN
Ngày 10 tháng 3 năm
2008.
Quyết ñinh số
3152/Qð-BKHCN
Ngày 27 tháng 12 năm
2007
Quyết ñinh số
2530/Qð-BKHCN
Ngày 31 tháng 10 năm
2007
Hợp ñồng: 2008/HðNðT

Ngày 19 tháng 5 năm
2008
Quyết ñịnh số
2267/Qð-BKHCN
Ngày 14 tháng 10 năm
2008

2

3

4

5

Tên văn bản

Ghi chú

Về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác quốc tế
về khoa học và công nghệ theo nghị ñịnh thư bắt
ñầu thực hiện từ năm 2008
Về việc thành lập Tổ thấm ñịnh ñề tài khoa học
và công nghệ theo Nghị ñịnh thư.

Về việc thành lập Hội ñồng khoa học và công
nghệ cấp Nhà nước thẩm ñịnh chuyển ngành xem
xét nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ
theo Nghị ñinh thư năm 2008.
Hợp ñồng thực hiện hợp tác quốc tế về khoa học

và công nghệ theo nghị ñịnh thư.

Quyết ñịnh Về việc thay ñổi Chủ nhiệm ñề tài
nhiệm vụ Nghị ñịnh thư với cộng hòa Pháp

4. Tổ chức phối hợp thực hiện ñề tài, dự án:
Số
TT

Tên tổ chức
ñăng ký theo
Thuyết minh

1
2

Footer Page 6 of 133.

Tên tổ chức ñã
tham gia thực
hiện

Nội dung
tham gia chủ
yếu

Sản phẩm
chủ yếu ñạt
ñược

Ghi chú*


Header Page 7 of 133.

...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
5. Cá nhân tham gia thực hiện ñề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện ñề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không
quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

1

Tên cá nhân ñăng
ký theo Thuyết
minh
Lê Quỳnh Mai

Lê Quỳnh Mai

Nội dung
tham gia
chính
Nội dung 1

2

ðỗ Năng Vịnh

ðỗ Năng Vịnh

Nội dung 1

Hà Thị Thúy

Hà Thị Thúy

Nội dung 1

Nguyễn Văn Toàn

Nguyễn Văn Toàn

Nội dung 1

Trần Ngọc Thanh

Trần Ngọc Thanh

Nội dung 2

Khổng Ngân Giang

Khổng Ngân Giang

Nội dung 2

Số
TT

3

4

5

6

7

Tên cá nhân ñã
tham gia thực hiện

Nguyễn Văn Khiêm Nguyễn Văn Khiêm Nội dung 2

Nguyễn Thành ðức

Nguyễn Thành ðức

Nội dung 2

9

Pascal Gantet

Pascal Gantet

Nội dung 1

10

Jean-Christophe
Breitler

Jean-Christophe
Breitler

Nội dung 1

8

- Lý do thay ñổi ( nếu có):

Footer Page 7 of 133.

Sản phẩm
chủ yếu ñạt
ñược
Các vector
chuyển gen
Các vector
chuyển gen
Quy trình tái
sinh, chuyển
gen.
Quy trình tái
sinh, chuyển
gen.
Chọn lọc,
ñánh giá cây

chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Các vector
chuyển gen
Các vector
chuyển gen

Ghi
chú*


Header Page 8 of 133.

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
1

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm, tên tổ chức hợp tác, số
ñoàn, số lượng người tham

gia...)
Trung tâm quốc tế nghiên cứu
phát triển nông nghiệp (CIRAD)
chuyển giao các vật liệu,
phương pháp, các dòng lúa
chuyển gen, ñào tạo cán bộ cho
phía Việt Nam trong khoảng
thời gian 2008 – 2009.

Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm, tên tổ chức hợp tác, số
ñoàn, số lượng người tham
gia...)
Trung tâm quốc tế nghiên cứu
phát triển nông nghiệp (CIRAD)
ñã chuyển giao các vật liệu và
các dòng lúa chuyển gen siêu
biểu hiện và bất hoạt gen các
yếu tố phiên mã.
ðào tạo 01 tiến sĩ, tập huấn các
thực tập sinh ngắn hạn tại trung
tâm CIRAD.

Ghi
chú*

2
...
- Lý do thay ñổi (nếu có):

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm )

Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian,
kinh phí, ñịa ñiểm )

Ghi chú*

1
2
...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, ñiều tra
khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số
TT
1

Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc ñánh giá chủ yếu)
Nội dung 1: Nghiên cứu tạo các

cây lúa chuyển gen siêu biểu
hiện các yếu tố phiên mă ở rễ

Footer Page 8 of 133.

Thời gian
(Bắt ñầu, kết thúc
- tháng … năm)
Theo kế
Thực tế ñạt
hoạch
ñược
2008 – 2009 2008 – 2009

Người,
cơ quan
thực hiện
Viện DTNN
và CIRAD


Header Page 9 of 133.

2

3

4

5

lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi
gây bất hoạt các gen này.
Xác ñịnh các gen của các yếu tố
phiên mă có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng bộ rễ lúa
Nghiên cứu thiết kế các gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt
các gen của các yếu tố phiên mã
nghiên cứu.
Chuyển các plasmids thu ñược
vào các callus lúa thông qua vi
khuẩn A.tumefaciens
Nội dung 2: Chọn lọc, phân
tích, ñánh giá các cây lúa
chuyển gen

2008 – 2009

2008 – 2009

Viện DTNN
và CIRAD

2008 – 2009

2008 – 2009

Viện DTNN
và CIRAD

2009

2009

Viện DTNN
và CIRAD

2009

2009

Viện DTNN

- Lý do thay ñổi (nếu có):
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ðỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN ñã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
1

2

3

Tên sản phẩm và chỉ
ðơn
tiêu chất lượng chủ
vị ño

yếu
Phương pháp thiết kế Phương 1
vector mang gen pháp
nghiên cứu
Phương pháp thiết kế Phương 1
vector mang các pháp
RNAi tương ứng của
các gen nghiên cứu,
biểu hiện ñặc hiệu ở
lúa
Quy trình chuyển gen
Quy
1
các yếu tố phiên mã trình

Theo kế
hoạch

Số lượng

Thực tế
ñạt ñược

1

1

1

1

1

1

1-2

2

hệ rễ vào lúa thông
qua

vi

khuẩn

Agrobacterium
4

Dòng lúa chuyển gen

Footer Page 9 of 133.

Dòng

1-2


Header Page 10 of 133.

có khả năng kháng
hạn
5

Phương pháp ñánh Phương 1
giá biểu hiện gen ở pháp

1

1

hệ rễ của các cây
chuyển gen ở mức ñộ
kiểu hình
- Lý do thay ñổi (nếu có):
b) Sản phẩm Dạng II:
Số
TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học
cần ñạt
Theo kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược

Ghi chú

1

- Lý do thay ñổi (nếu có):
c) Sản phẩm Dạng III:
Số
TT
1

Số lượng, nơi
Yêu cầu khoa học
công bố
cần ñạt
Tên sản phẩm
(Tạp chí, nhà
Theo
Thực tế
xuất bản)
kế hoạch ñạt ñược
Bài báo quốc tế: Giang N. Khong,
01
01
01 bài
Frédérique Richaud, Yoan Coudert,
Tạp chí:
Pratap k. Pati, Carole Santi, Christophe
Biotechnology
Périn, Jean-christophe Breitler,
and Genetic
Donaldo Meynard, Do n. Vinh,
Engineering
Emmanuel Guiderdoni, Pascal Gantet
Reviews - Vol.

(2008). “Modulating Rice Stress
25, 381-404
Tolerance by Transcription Factors”

- Lý do thay ñổi (nếu có):
d) Kết quả ñào tạo:
Số
TT

Cấp ñào tạo, Chuyên
ngành ñào tạo

1

Thạc sỹ

Footer Page 10 of 133.

Số lượng
Theo kế hoạch
Thực tế ñạt
ñược
01
01

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
2010

Header Page 11 of 133.

2

Tiến sỹ

01

01

2010

- Lý do thay ñổi (nếu có):
ñ) Tình hình ñăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền ñối với giống cây
trồng:
Số
TT

Kết quả

Tên sản phẩm
ñăng ký

Theo
kế hoạch

Thực tế
ñạt ñược

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)

1
2
...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ñã ñược ứng dụng vào thực tế
Số
TT

Tên kết quả
ñã ñược ứng dụng

Thời gian

ðịa ñiểm
(Ghi rõ tên, ñịa
chỉ nơi ứng
dụng)

Kết quả
sơ bộ

1
2
2. ðánh giá về hiệu quả do ñề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức ñộ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình ñộ

công nghệ so với khu vực và thế giới…)
-

Lần ñầu tiên triển khai hướng nghiên cứu mới về cơ chế bất hoạt gen thông qua
RNAi ở Việt Nam. Cung cấp tài liệu, dữ liệu và kỹ năng thực hành có giá trị
cho mở rộng ứng dụng cơ chế RNAi trong bất hoạt gen ñích ở các cơ thể sống
nhân thực khác.

-

Phương pháp RNAi có thể gây bất hoạt gen ñã biết trình tự gen nhằm nghiên
cứu chức năng của gen trong chương trình nghiên cứu chức năng gen
(Functional genomics).

-

Phương pháp RNAi ứng dụng trong nghiên cứu ñiều khiển hoạt hoá gen (làm
mất hoạt tính gen (knockout) hoặc làm giảm hoạt tính gen (Knock-down).

-

Phương pháp xác ñịnh gen, phân lập gen, thiết kế vectors, chuyển các gen siêu
biểu hiện các yếu tố phiên mã liên quan ñến kháng hạn và cấu trúc rễ lúa

Footer Page 11 of 133.


Header Page 12 of 133.

(MADS box genes ) lần ñầu tiên sẽ ñược nghiên cứu có khả năng cho phép tạo

giống lúa kháng hạn và các yếu tố stress ở cây trồng.
-

Phương pháp RNAi ñã ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của
nông nghiệp, thuỷ sản, y học v.v...

-

Cập nhật kịp thời những kiến thức hiện ñại về sinh học phân tử của RNAi
trong nghiên cứu cơ bản, trong ñào tạo ðại học và sau ðại học.

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do ñề tài, dự án tạo ra so với các
sản phẩm cùng loại trên thị trường…)
-

ðề tài có thể mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng mới ở nước ta.

-

Cung cấp các dòng cây chuyển gen có triển vọng kháng hạn, giảm chi phí sản
xuất và thiệt hại mùa màng do hạn hoặc các nhân bất lợi khác.

3. Tình hình thực hiện chế ñộ báo cáo, kiểm tra của ñề tài, dự án:
Số
TT
I

Nội dung
Báo cáo ñịnh kỳ

Lần 1:
Nội dung 1: Nghiên cứu
tạo các cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện các
yếu tố phiên mã ở rễ lúa
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.

Lần 2:
Nội dung 1: Nghiên cứu
tạo các cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện các
yếu tố phiên mă ở rễ lúa

Footer Page 12 of 133.

Thời gian
thực hiện
01/2008 –
12/2008

01/2009 –
12/2009

Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,
người chủ trì…)
- ðã phân lập ñược RNA tổng số từ
mẫu rễ lúa xử lí kháng hạn và cây ñối

chứng.
- ðã sinh tổng hợp các cDNA tương
ứng từ RNA phân lập từ rễ lúa:
cDNA của gen OsNAC1 (Os06);
OsMADS56 (Os10), OsMADS26
(Os08).
- ðã xác ñịnh ñược 4 gen của các yếu
tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng bộ rễ lúa:
OsNAC1 (Os06g46270);
OsMADS25 (Os04g23910);
OsMADS26 (Os08g02070);
OsMADS56 (Os10g39130).
- ðã thiết kế 6 cặp mồi ñặc hiệu và
tách dòng các cDNA tương ứng.
ðã thiết kế thành công các vector
pDONR207 mang các gen của các
yếu tố phiên mã OsNAC1;


Header Page 13 of 133.
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.
Nội dung 2: Chọn lọc,
phân tích, ñánh giá các
cây lúa chuyển gen

II
III

OsMADS26; OsMADS56.
- ðã thiết kế thành công vector
pC5300.OE mang gen nghiên cứu
OsMADS26.
- ðã xác ñịnh và tạo ñược 7 ñoạn
GST khác nhau từ các cDNA tương
ứng: OsNAC1; OsMADS26;
OsMADS25; OsMADS56
- ðã thiết kế thành công 2 vector gây
bất hoạt gen OsMADS26 mang 01
trong 02 trình tự ñích khác nhau
(GST1 và GST2) với vector gốc là
vector RNAi: pANDA.
- ðã xây dựng thành công mô hình
tái sinh cây lúa invitro phục vụ công
tác chuyển gen quan tâm.
- ðã xây dựng thành công quy trình
chuyển gen với các vector siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
- ðã chọn lọc và ñánh giá các dòng
lúa chuyển gen siêu biểu hiện và bất
hoạt

Kiểm tra ñịnh kỳ
Lần 1
Nghiệm thu cơ sở
……

Chủ nhiệm ñề tài
(Họ tên, chữ ký)

Lê Quỳnh Mai

Footer Page 13 of 133.

Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và ñóng dấu)


Header Page 14 of 133.

LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành ñề tài nghiên cứu “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố
phiên mã liên quan ñến quá trình phân hóa của rễ lúa bằng phương pháp gây siêu
biểu hiện và bất hoạt RNA (RNA interference)” chủ nhiệm ñề tài xin chân thành
cảm ơn tới:
-

Bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

-

Lãnh ñạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

-

Lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp.

-

Lãnh ñạo phòng thí nghiệm Trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật.

-

Các nhà nghiên cứu thuộc trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông
nghiệp (CIRAD).

-

Cùng toàn bộ những người tham gia thực hiện ñề tài.

ðã ủng hộ, tạo ñiều kiện thuận lợi về mọi mặt tài chính, hành chính, trang thiết
bị và nhân lực cho việc thực hiện và hoàn thành ñề tài trong thời gian quy ñịnh.

Hà Nội, Ngày

tháng

năm 2010

Chủ nhiệm ðề tài

TS. Lê Quỳnh Mai

Footer Page 14 of 133.


cáo

Header Page 15 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..........................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................5
I. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................11
1.1. Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh trưởng của
cây lúa .............................................................................................................11
1.2.

Nghiên cứu xác ñịnh hệ gen liên quan ñến khả năng kháng hạn ở cây trồng
15
1.3.

Khám phá ra các gen “hàng ñầu” tham gia vào việc cải thiện khả năng

kháng hạn của thực vật thông qua các thành tựu chuyển gen............................16
1.4.

Vai trò của các yếu tố phiên mã trong việc ñiều khiển biểu hiện của gen

phản ứng với hạn ............................................................................................18
1.5.

Biểu hiện của các yếu tố phiên mã phụ thuộc hàm lượng ABA nội bào

trong ñiều kiện hạn hán....................................................................................19
1.6.

Giới thiệu chung về ñối tác cùng nghiên cứu trong ñề tài ......................20

1.7.

Mục tiêu của ñề tài ................................................................................22

1.8.

Các nội dung nghiên cứu trong nước.....................................................23

1.8.1. Nghiên cứu tạo ra các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố
phiên mã ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen này. ..........23
1.8.2. Phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen ......................................24
1.9. Các nội dung và kế hoạch hợp tác với ñối tác nước ngoài .....................24
1.10. Kế hoạch thực hiện ...............................................................................26
CÁC NỘI DUNG CHÍNH CẦN THỰC HIỆN......................................................28
II.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................29
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................29
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................................30

2.2.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng của bộ rễ lúa..............................................................................30
2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA từ các mẫu khác nhau như lá non, thân
và rễ cây lúa. ..................................................................................................31

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu thiết kế cặp mồi ñặc hiệu ..........................32
2.2.4. Sinh tổng hợp cDNA tương ứng từ RNA ñược phân lập từ mẫu rễ lúa.
33

Footer Page 15 of 133.

1


cáo
Header Page 16 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

2.2.5. Nghiên cứu thiết kế các vector siêu biểu hiện và bất hoạt gen ñích
quan tâm.........................................................................................................34
2.2.6. Phương pháp xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả cao cho các
giống lúa kháng hạn. ......................................................................................40
2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào
callus lúa ........................................................................................................41
2.2.8. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ kiểu hình.........................................................................................43
2.2.9. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ sinh lý.............................................................................................44
III.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................46
3.1. Nghiên cứu tạo các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố phiên mã
ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen nghiên cứu. ...............46
3.1.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc

và chức năng bộ rễ lúa....................................................................................46
Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 .......................47
3.1.2. Nghiên cứu thiết kế các gen RNAi có khả năng gây bất hoạt các gen
của các yếu tố phiên mã nghiên cứu. ..............................................................56
3.1.3. Chuyển các plasmid thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien..............................................................................62
3.2. Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen ...........................71
3.2.1. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình............................................................................................71
3.2.2. Chọn lọc cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý. ...............................................................................................75
3.2.3. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ kiểu hình............................................................................................79
3.2.4. ðánh giá cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen nghiên cứu ở
mức ñộ sinh lý. ...............................................................................................83
3.3. Các kết quả ñạt ñược với sự hợp tác của trung tâm CIRAD, Pháp .........87
3.3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen OsMADS26 (ORF8) và số lượng copy
TDNA trong các dòng lúa biến nạp với vector PC5300.OE thế hệ T0 và T1
bằng Southern blot .........................................................................................87
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của GST1 và GST2 và số lượng copy T-DNA
trong các dòng lúa biến nạp với vector gây bất hoạt gen pANDA thế hệ T0 và
T1 bằng Southern blot ....................................................................................90
3.3.3. Phân tích biểu hiện của gen OsMADS26 (ORF8) trong các dòng lúa
biến nạp với vector PC5300.OE hoặc pANDA bằng kỹ thuật northern blot ....92
IV. CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT VÀ ðÁNH GIÁ KẾT QUẢ ðỀ TÀI .............94
4.1. KẾT QUẢ KHOA HỌC .......................................................................94
4.2.

Footer Page 16 of 133.

KHẢ NĂNG ÁP DỤNG VÀ ðÀO TẠO NHÂN LỰC .........................97

2


cáo
Header Page 17 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................99
5.1. KẾT LUẬN ..........................................................................................99
5.2.
VI.

Footer Page 17 of 133.

KIẾN NGHỊ........................................................................................100

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................101

3


cáo
Header Page 18 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2.4-D: Dichlorophenoxy Acetatic acid
DNA-T: DNA transfer
AS: Acetosyringone
bp: cặp base
BSA: Bovine Serum Albumin
cDNA: complementary DNA
DEPC: Diethylpyrocacbonte
DNAg: hệ gen DNA
dNTPs: deoxy nucleotid triphosphat
E.coli: Escherichia coli
EDTA: Axit ethylene dinitriotet acetic
GST: Gene Sequence Target
hpRNA: hairpin RNA (RNA dạng kẹp tóc)
Hpt: Hygromycin
Kb: Kilobase
LB: Môi trường Luria-Bertani
ORF: Open reading frame
PCR: Polymerase Chain Reaction
pH: Potential Hydrogen
RNAi: Axít ribonucleic interference
RNase: ribonuclease
RT: Reverse transcription
SDS: sodium dodecyl sulfate
TAE: tris-acetate-EDTA
Taq: Thermus aquaticus polymerase
TE: Tris-EDTA
Tm: Nhiệt ñộ bắt cặp

UV: ultra-violet
v/p: vòng/phút

Footer Page 18 of 133.

4


cáo
Header Page 19 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 .......................47
Bảng 3.2. Các ñoạn GST thuộc các gen yếu tố phiên mã khác nhau.......................59
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4-D (mg/l) ñến khả năng tạo mô sẹo từ hạt lúa
(giống Nipponbare).........................................................................................62
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn hydrate carbon....................................................63
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng ñộ agar .................................................................64
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh64
Bảng 3.7. Kết quả tái sinh của giống nipponbare trên môi trường tối ưu ................65

Footer Page 19 of 133.

5


cáo

Header Page 20 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. A: Rễ cây lúa phát triển sau 10 ngày, B: Mẫu tách chiết RNA từ rễ lúa ..46
Hình 3.2. Ảnh kiểm tra gắn ñoạn gen Os06 (OsNAC1) và Os10 (OsMADS56) vào
vector tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn.....................................................49
Hình 3.3. Ảnh kiểm tra gắn ñoạn gen Os04 (OsMADS25) vào vector tách dòng
bằng cắt enzyme giới hạn................................................................................50
Các giếng 1→ 4 đều cho thấy ñã gắn thành công ñoạn gen nghiên cứu vào vector
tách dòng. .......................................................................................................50
Hình 3.4. Ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân ñoạn gen Os06 (A) và Os08 (B),
Os10 (C) nhờ phản ứng RT-PCR ....................................................................51
Hình 3.5. Sơ ñồ ñặc ñiểm vector pDONR207 ........................................................52
Hình 3.6. Ảnh ñiện di kiểm tra ñoạn trình tự gắn vào vector pDONR207 ..............53
Hình 3.7. Sơ ñồ cấu trúc vector siêu biểu hiện pC5300 ..........................................54
Hình 3.8. Ảnh ñiện di kiểm tra ñoạn trình tự gắn vào vector pC5300. ....................55
Hình 3.9. Sơ ñồ thiết kế vector pC5300 siêu biểu hiện gen OsMADS26 ................55
Hình 3.10. Ảnh ñiện di kiểm tra nhân các ñoạn GST bằng PCR.............................59
Hình 3.11. Sơ ñồ thiết kế vector RNAi (vector pANDA) và cấu trúc RNA kẹp tóc
tạo thành trong thực vật ..................................................................................61
Hình 3.12. Hệ thống tái sinh giống Nipponbare .....................................................66
Hình 3.13. Quá trình tạo callus lúa giống Nipponbare tạo vật liệu cho chuyển gen
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens..................................................................67
Hình 3.15. Chọn lọc các callus sau khi ñồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens68
Hình 3.15. Tái sinh và nhân các dòng lúa chuyển gen ............................................69
Hình 3.16. Thử khả năng nảy mầm của hạt lúa chuyển gen trên môi trường có

kháng sinh Hygromycin..................................................................................70
Hình 3.17. Hình thái rễ sau thay ñổi từ 2 ñến 7 ngày tuổi.......................................71
Hình 3.18. Hình thái bộ rễ lúa ở các dòng chuyển gen khác nhau (7 ngày tuổi)......72
Hình 3.19. So sánh mật ñộ rễ của các dòng lúa chuyển gen....................................73
Hình 3.20. So sánh tính hướng trọng lực của các dòng lúa chuyển gen ..................74
Hình 3.21. ðiện di kiểm tra chất lượng RNA tách chiết trên gel Agarose 1% ........75
Hình 3.22: Mức ñộ biểu hiện của gen OsMADS26 ở các bộ phận khác nhau của cây
lúa và trong ñiều kiện stress áp suất thẩm thấu và mặn. ..................................76

Footer Page 20 of 133.

6


cáo
Header Page 21 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

Hình 3.23. So sánh sự sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) .................................................77
Hình 3.24. So sánh chiều cao thân của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) .................................................78
Hình 3.25. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng siêu biểu hiện gen .................79
Hình 3.26. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng gât bất hoạt gen.....................80
Hình 3.27. Sự tăng trưởng chiều cao cây của các dòng bất hoạt gen OsMADS26 ..81
Hình 3.28. So sánh số nhánh tạo thành của dòng bất hoạt gen với cây ñối chứng...81

Hình 3.29. Thời gian ra hoa của các dòng lúa chuyển gen......................................82
Hình 3.30. Hình thái bộ rễ lúa sau thu hạt của các dòng lúa chuyển gen.................83
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. ........84
Hình 3.31. So sánh cường ñộ quang hợp của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu
hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. ........85
Hình 3.32. So sánh hàm lượng diệp lục (Pi) của các dòng lúa chuyển gen gây siêu
biểu hiện và bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện gây hạn và ñối chứng. 86
Hình 3.33. Mô hình minh họa thí nghiệm southern blot .........................................88
Hình 3.34. Sơ ñồ cắt enzyme giới hạn cho thí nghiệm southern blot ......................89
Hình 3.35. Kết quả lai các dòng DNA trên màng với mẫu dò ORF8 ......................89
Hình 3.36. Xác ñịnh số lượng bản sao trong các dòng cây bằng mẫu dò HPT ........90
Hình 3.37. Sơ ñồ cắt enzyme giới hạn cho thí nghiệm southern blot ......................91
Hình 3.38. Kết quả lai các dòng DNA với mẫu dò GST ñặc hiệu và HPT ..............91
Hình 3.39. Ảnh kết quả lai các dòng RNA khác nhau tách chiết từ cây lúa chuyển
gen siêu biểu hiện với các mẫu dò ORF8 ........................................................92
Hình 3.40. Ảnh kết quả lai các dòng RNA khác nhau tách chiết từ cây chuyển gen
bất hoạt với các mẫu dò GST1 và GST2 .........................................................93

Footer Page 21 of 133.

7


cáo
Header Page 22 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

LỜI MỞ ðẦU

Thực vật là những sinh vật không dễ biến ñổi và chúng phải thích nghi với
ñiều kiện sống bất lợi của môi trường chủ yếu bằng ñiều khiển sự sinh trưởng
và phát triển của chúng cùng với sự thay ñổi về mặt sinh lý và sinh hóa. Các
nhân tố phiên mã ñiều khiển sự biểu hiện gen ñể phản ứng trước các tín hiệu
của môi trường và sinh lý. Một nhân tố phiên mã ñược mã hóa bởi một gen
ñơn ñộc nhưng ñiều khiển sự biểu hiện của nhiều gen khác dẫn ñến sự hoạt
hóa của một phức hợp các cơ chế và do vậy là mục tiêu ở mức ñộ sinh học
phân tử ñể cải tiến khả năng chống chịu của cây trồng với các ñiều kiện sống
khắc nghiệt. Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực quan
trọng nhất. Do ñó, cây lúa ñã và ñang ñược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm.
ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng nhanh
hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo. ðối với các nước ñang
phát triển, hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng
nghiêm trọng tới sản lượng cây trồng; việc nghiên cứu tạo ra các giống lúa
chịu hạn tốt và ổn ñịnh vẫn là biện pháp tối ưu trong tình hình hiện nay.
Việc xác ñịnh những gen chìa khóa tham gia vào quá trình phân nhánh bộ
rễ ở cây lúa có thể cho phép sử dụng các chỉ thị phân tử vào việc chọn lọc
những tính trạng cấu trúc bộ rễ lúa phù hợp với khả năng chịu hạn của lúa.
Mục tiêu của dự án là nghiên cứu chức năng của một số gen mã hóa một số
yếu tố phiên mã ở rễ lúa và vai trò của các yếu tố này trong sự hình thành
hình thái bộ rễ lúa. ðề tài phải giải quyết một loạt các vấn ñề kỹ thuật mới
trong ñó ñáng kể nhất là công nghệ RNAi. Công nghệ này lần ñầu tiên ñược
nghiên cứu ở nước ta.

Footer Page 22 of 133.

8

cáo
Header Page 23 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

ðề tài “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan ñến
quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA (RNA interference)”, ñược thực hiện trên cơ sở hợp tác
khoa học với nhóm nghiên cứu “Phát triển và thích nghi của cây lúa”
(DAR) của UMR 1098 “Phát triển và thích nghi của thực vật” thuộc CIRAD
(Trung tâm quốc tế nghiên cứu phát triển nông nghiệp, Pháp). Mục tiêu của
ñề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn ñề sau: i) Xác ñịnh 1-2
gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và chức năng bộ rễ ở
lúa; ii) Nghiên cứu thiết kế 1-2 vector mang gen siêu biểu hiện và mang gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt gen của các yếu tố phiên mã nghiên cứu; iii)
Nghiên cứu quy trình chuyển các gen nghiên cứu vào lúa thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens; và iv) Phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen
bằng phương pháp sinh học phân tử và kiểu hình.
ðề tài ñã thực hiện ñầy ñủ các nội dung nghiên cứu và thu ñược những
kết quả chính như sau:
- Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc và
chức năng của bộ rễ lúa: Xác ñịnh ñược bốn gen có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng của bộ rễ lúa. ðó là: OsNAC2, OsMADS25,
OsMADS26 và OsMADS56.
- Nghiên cứu thiết kế các gen RNAi có khả năng gây bất hoạt các gen
của các yếu tố phiên mã nghiên cứu: Thiết kế ñược các vector pC5300
mang gen siêu biểu hiện và vector pANDA mang gen RNAi có khả
năng gây bất hoạt các gen của các yếu tố phiên mã nghiên cứu.

- Chuyển các plasmids thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa

Footer Page 23 of 133.

9


cáo
Header Page 24 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Nghiên cứu tối ưu hóa hệ thống tái
sinh in vitro ở lúa thích hợp cho việc tái sinh callus chuyển gen.
- Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen: Phân tích, ñánh
giá các dòng cây chuyển gen siêu biểu hiện hoặc bất hoạt gen
OsMADS26 ở mức ñộ kiểu hình và ở mức ñộ sinh lý.

Footer Page 24 of 133.

10


cáo
Header Page 25 ofBáo
133.

I.

1.1.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh
trưởng của cây lúa

Lúa là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu cho hơn một nửa dân số thế
giới trong ñó có 17 nước thuộc châu Á và Thái Bình Dương
( Theo thông báo của
FAO (năm 2005), 6-20% trong tổng sản lượng lương thực hàng năm của cả
thế giới (tương ñương với khoảng 120 tỉ USD) bị thất thoát do những tác nhân
phi sinh học như: hạn, lạnh, mặn, lũ lụt…ðối với các nước ñang phát triển,
hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng nghiêm
trọng tới sản lượng cây trồng. Chỉ tính riêng cho vùng nhiệt ñới, hàng năm ñã
có tới 20 triệu tấn lương thực bị mất mát do khô hạn gây ra. Ở Việt Nam, diện
tích canh tác lúa khoảng 4,36 triệu ha, trong ñó có 2,2 triệu ha là ñất thâm
canh, chủ ñộng tưới tiêu nước, còn lại hơn 2,1 triệu ha là ñất canh tác lúa có
những khó khăn: hạn, mặn, úng [31].
Nước thường xuyên ñược coi là nguồn năng lượng dồi dào ở những khu
vực có ñộ ẩm cao như ðông Nam Á trong ñó có Việt Nam, tuy nhiên nay ñã
trở thành một nhân tố hạn chế trong sản xuất nông nghiệp [14]. Trong những
năm vừa qua, hạn hán kéo dài xảy ra ở một số vùng thuộc ñồng bằng sông
Cửu Long và miền Trung Việt Nam làm giảm mực nước của các con sông
dẫn ñến việc nước biển tràn vào các kênh tưới tiêu, năng suất lúa trong những
khu vực bị hạn hán này ñã bị giảm từ 20 - 60%. Việc sản xuất lúa gạo ở ðông
Nam Á cũng như ở Việt Nam cần phải bắt kịp với sự bùng nổ dân số của khu

Footer Page 25 of 133.

11