Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum) lên khả năng sinh tổng hợp melanin ở mức độ in vitro và in vivo

kffj
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------o0o--------

Lê Thị Liên

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô
ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ
IN VITRO VÀ IN VIVO.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ
(POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ
IN-VITRO VÀ IN-VIVO.
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN ĐÌNH THẮNG

Hà Nội – 2016


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
tới TS. Nguyễn Đình Thắng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc
chuyên ngành Sinh học thực nghiệm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức
quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, sinh viên Phòng
Sinh học Nano và Ứng dụng và phòng Ung thư thực nghiệm - thuộc Phòng
Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein những người đã giúp đỡ
tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới đề tài mang mã số KLEPT-14-02 vì đã hỗ trợ
kinh phí cho các nghiên cứu trong luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người
đã tạo cho tôi điều kiện tốt nhất để hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2016
Học viên

Lê Thị Liên

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Mô hình nghiên cứu ........................................................................................... 2
1.1.1. Mô hình nghiên cứu in vitro .......................................................................2
1.1.2. Mô hình nghiên cứu in vivo ........................................................................2
1.2. Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) .............................................................. 3
1.2.1. Đặc điểm chung ..........................................................................................3
1.2.2. Tác dụng hà thủ ô đỏ trong y học ...............................................................4
1.2.3. Một số nghiên cứu trên thế giới .................................................................5
1.3. Melanin................................................................................................................ 5
1.3.1. Giới thiệu về melanin .................................................................................5
1.3.2. Melanocyte .................................................................................................6
1.3.3. Melanosome ...............................................................................................7
1.3.4. Cơ sở hóa sinh của quá trình tổng hợp melanin. ........................................7
1.3.5. Cơ sở di truyền của quá trình tổng hợp melanin ........................................8
1.3.6. Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin. ................................9
1.3.7. Các chỉ thị phân tử xác định mức độ biểu hiện melanin ..........................10
1.4. Sự hình thành sắc tố melanin trong sự sinh trƣởng của cá ngựa vằn ......... 11
1.4.1. Cá ngựa vằn ..............................................................................................11
1.4.2. Sự hình thành sắc tố melanin trong quá trình phát triển của cá ngựa vằn ....14
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 17
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................17
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................17
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................18
2.1.4. Dụng cụ và vật tư tiêu hao........................................................................18
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................... 18

2.2.1. Tách chiết hà thủ ô ...................................................................................18


2.2.2. Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp
melanin ở mức độ in vitro ..................................................................................20
2.2.3. Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp
melanin ở mức độ in vivo ..................................................................................25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 29
3.1. Tách chiết hà thủ ô đỏ ...................................................................................... 29
3.2. Kết quả nghiên cứu in vitro ............................................................................. 29
3.2.1. Kết quả hoạt hóa và nhân nuôi tế bào ......................................................29
3.2.2. Độc tính của cao dịch chiết hà thủ ô đỏ đối với sự sinh trưởng của
tế bào SK-MEL-28 ..............................................................................................30
3.2.3. Ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin
của các tế bào SK-MEL-28 .................................................................................32
3.2.4. Con đường tác dụng của cao dịch chiết HTO lên sự tổng hợp melanin .......34
3.3. Kết quả in vivo .................................................................................................. 41
3.3.1. Thử độc tính của methanol lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn .........41
3.3.2. Thử độc tính của dịch chiết của hà thủ ô đỏ trong methanol lên
sự phát triển của phôi cá ngựa vằn .....................................................................45
3.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của dịch chiết
hà thủ ô trong methanol lên cá ngựa vằn ở mức độ phiên mã. ..........................48
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 52
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 54


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm nổi bật của các thời kì phát triển của phôi cá ngựa vằn 13
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 17

Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 18
Bảng 2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao trong nghiên cứu. ................................ 18
Bảng 2.4. Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng trong thí nghiệm. ......................... 24
Bảng 2.5. Các thành phần phản ứng PCR trong nghí nghiệm in vitro ........... 24
Bảng 2.6. Các đặc điểm gây chết trong quá trình phơi nhiễm phôi................ 26
Bảng 2.7. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α ................................... 26
Bảng 2.8. Các thành phần của phản ứng PCR trong thí nghiệm vi vitro. ....... 27
Bảng 2.9. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf .................................... 27
Bảng 2.10. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase........................ 28
Bảng 3.1. Khối lượng các cao dịch chiết thu được từ bột khô rễ HTO đỏ. .... 29
Bảng 3.2. Kết quả đo nanodrop của RNA tổng số tách được từ tế bào .......... 35
Bảng 3.3. Dải nồng độ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn .... 41
Bảng 3.4. Bảng thống kê dị dạng gây ra bởi methanol ................................... 42
Bảng 3.5. Dải nồng độ dịch chiết hà thủ ô trong methanol dùng để thử
độc tính lên phôi cá ngựa vằn ......................................................... 45
Bảng 3.6. Bảng thống kê dị dạng gây ra bởi dịch chiết hà thủ ô
trong methanol ................................................................................ 46
Bảng 3.7. Môi trường phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn dùng cho
thí nghiệm thử hoạt tính. ................................................................. 48
Bảng 3.8. Kết quả tinh sạch ARN tổng số ...................................................... 48
Bảng 3.9. Kết quả tổng hợp cADN ................................................................. 49


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây và củ hà thủ ô đỏ. .................................................................................3
Hình 1.2. Công thức hóa học của eumelanin và pheomelanin ....................................6
Hình 1.3. Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin .............................................................7
Hình 1.4. Con đường tín hiệu điều khiển quá trình sinh tổng hợp melanin ...............9
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn ........................................14
Hình 2.1. Hình ảnh tế bào SK-MEL-28. ....................................................................20

Hình 2.2. Chu trình nhiệt PCR ..................................................................................27
Hình 3.1. Tế bào SK-MEL-28 (sau 24h hoạt hóa) .....................................................30
Hình 3.2. Tế bào sau khi bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ ở các nồng độ khác nhau.......... 31
Hình 3.3. Biểu đồ đánh giá độc tính HTO đỏ. ..........................................................31
Hình 3.4. Tế bào sản sinh melanin nội bào và ngoại bào .........................................33
Hình 3.5. Sự khác biệt về hàm lượng melanin sinh ra đối với các nồng độ
dịch chiết HTO đỏ khác nhau ....................................................................33
Hình 3.6. Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số...........................................34
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện của gene giữ nhà GAPDH của cDNA
các mẫu tế bào melanoma .........................................................................36
Hình 3.8. Mức độ biểu hiện của gene MC1R của cDNA các mẫu
tế bào melanoma ......................................................................................37
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện của gene MITF (A) và tyrosinase (B) của cDNA
các mẫu tế bào melanoma.........................................................................38
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện của gene Nras (120bp) của cDNA các mẫu
tế bào melanoma .......................................................................................39
Hình 3.11. Mức độ biểu hiện của gene ERK của cDNA các mẫu
tế bào melanoma .......................................................................................40
Hình 3.12. Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng methanol. ..............43
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm
bằng methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi. .......................44
Hình 3.14. Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng dịch chiết
hà thủ ô trong methanol. ...........................................................................46
Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm bằng dịch
chiết hà thủ ô trong methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi. ........47
Hình 3.16. Kết quả điện di và phân tích hình ảnh điện di Chú thích: A – Gen ef1α
B – Gen mitf
C – Gen tyrosinase .........................................................50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ARN
cADN

: Acid ribonucleic
: Complement acid deoxyribonucleic

cAMP

: Cyclic adenosine monophosphate

CREB

: response element-binding protein

cAMP
ĐC
DMEM

(protein bám vùng đáp ứng cAMP)
: Đối chứng
: Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DOPA

: Dihydroxyphenylalanine

dpf

: Day post fertilisation (ngày sau thụ tinh)

ef1α

: Elongation factor 1 alpha (nhân tố kéo dài 1 alpha)

ERK
EtAc

: extracellular -signal -regulated kinases
: Ethyl acetate

Fw
HTO
mc1r
MC1R
MeOH

: Forward Primer (Mồi xuôi)
: Hà thủ ô
: Melanocortin 1 receptor
: Melanocortin-1-receptor
: Methanol

MT
NC
n-hex
OD
OECD
PBS
Rv

: Microphthalmia-associated transcription factor
(nhân tố phiên mã liên kết với microphthalmia)
: Môi trường
: Đối chứng
: n-hexane
: Mật độ quang
: Organisation for Economic Co-operation and Development
: Phosphate – buffered saline
: everse primer (Mồi ngược)

PCR
PKA
SDS
TRP1
TRP2
UV
α-MSH

: Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân gen)
: Protein kinase A
: Sodium dodecyl sulphate
: Tyrosinase-related protein 1
: Tyrosinase-related protein 2
: Tia cực tím
: α -Melanocyte-stimulating hormone

mitf

Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

MỞ ĐẦU
Melanin là một loại sắc tố màu nâu hoặc đen, được tìm thấy trong rất nhiều
các sinh vật sống, từ nấm, thực vật đến động vật có vú. Nó có chức năng khác nhau
trong tất cả các sinh vật [13]. Ở người, melanin là yếu tố quyết định chính của màu
da, màu tóc. Melanin cũng được tìm thấy trong các mô sắc tố nằm bên dưới tròng
đen của mắt, tế bào thần kinh và sắc tố mang trong các khu vực của não, chẳng hạn
như các locus coeruleus và chất đen [43]. Rối loạn tổng hợp hoặc con đường truyền
dẫn melanin được xem là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng tóc bị nhạt màu,
nám, tàn nhang, đốm nâu và sạm da. Sự rối loạn sắc tố melanin được gây ra bởi rất
nhiều nguyên nhân, bao gồm: yếu tố nội sinh (do di truyền) và yếu tố ngoại sinh
(chế độ dinh dưỡng không hợp lý, thường xuyên thức khuya, hút thuốc lá, bị stress,
sốc tâm lý, tia UV...) [52]. Ở thời điểm hiện tại, chưa có một số liệu thống kê cụ thể
nào về tỷ lệ bệnh nhân bị bạc tóc sớm, nákm, tàn nhang, sạm da và cũng chưa có
nhiều nghiên cứu chuyên sâu về melanin và cơ chế sinh tổng hợp melanin từ đó tìm
ra các phương pháp điều trị [52].
Ngày nay, việc chữa bệnh bằng các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên đang
được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Từ lâu, nguồn dược liệu có sẵn
trong tự nhiên này được dân gian sử dụng làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, chẳng
hạn như bệnh tim, hen suyễn, ho, thấp khớp, tiểu đường,... và cho thấy có những kết
quả khả quan [3]. Bên cạnh đó, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, các loại
thuốc có nguồn gốc thảo dược ít có tác hại đối với sức khỏe con người, trong khi đó
thuốc tổng hợp hóa học lại rất dễ gây các tác dụng phụ không mong muốn [3]. Các
nước phương Đông, đặc biệt là Việt Nam, nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa
nóng ẩm quanh năm, do vậy mà hệ thống thực vật tương đối đa dạng và phong phú,
tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc chữa bệnh từ các loại thảo dược.
Theo kinh nghiệm dân gian, ông cha ta đã biết dùng hà thủ ô để chữa bạc tóc

sớm. Hà thủ ô có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp melanin. Để trả lời câu hỏi
này, chúng tôi chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hà
thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) lên khả năng psinh tổng hợp melanin ở mức độ
in vitro và in vivo” với mục đích: Phân tích ảnh hưởng của các dịch chiết hà thủ ô
đỏ lên khả năng tăng sinh tổng hợp của melanin trên mô hình tế bào và mô hình
phôi cá ngựa vằn.

1


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Mô hình nghiên cứu
1.1.1. Mô hình nghiên cứu in vitro trong thử nghiệm trên tế bào.
Phương pháp nghiên cứu trong sinh học thực nghiệm cho phép người nghiên
cứu sử dụng thành phần, hay bộ phận của một sinh vật (thường ở quy mô tế bào hay
vi khuẩn) dưới dạng cô lập được khỏi môi trường thông thường của nó, để có thể
nghiên cứu và phân tích chi tiết hơn trước khi thực hiện trên sinh vật sống. Nói cách
khác, đây là thử nghiệm thường được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm" [54].
Viê ̣c các tế bào đô ̣ng vâ ̣t có thể nuôi cấ y , duy trì sự tăng sinh trong các chai ,
điã ngày càng dễ dàng hơn trong các phòng thí nghiê ̣m đã mở ra hướng đi mới quan
trọng trong công cuô ̣c tìm kiế m các hoa ̣t chấ t có vai trò quan tr ọng trong lĩnh vực y
học. Có thể thấy được các ưu điểm của mô hình nghiên c ứu này là khả năng tự đô ̣ng
hóa cao , rút ngắn được thời gian nghiên cứu và cho phép quan sát tr

ực tiếp diễn

biế n tra ̣ng thái bê ̣nh lí của tế bào . Đồng thời, nhà nghiên cứu có thể thao tác cùng
lúc trên nhiều dòng tế bào khác nhau , nhiề u hơ ̣p chấ t khác nhau với dải nồ ng đô ̣
rô ̣ng. Tuy nhiên, mô hình này có nhươ ̣c điể m là tương tác giữa các tế bào với hợp
chấ t chỉ theo mô ̣t chiề u , thiế u đi sự tương tác giữa các tế bào với hê ̣ miễn dich
̣ cũng
như của hê ̣ miễn dich
̣ với chấ t thử nghiê ̣m ; điề u kiê ̣n làm viê ̣c phải hoàn toàn vô
trùng đòi hỏi ki ̃ thuâ ̣t và kinh nghiê ̣m cao của người làm thí nghiê ̣m , chi phí cho thí
nghiê ̣m đắ t tiề n .
1.1.2. Mô hình nghiên cứu in vivo trong thử nghiệm trên cá ngựa vằn.
Phương pháp in vivo được dùng để chỉ những thí nghiệm dùng các mô sống
hay toàn bộ cơ thể còn sống làm đối tượng thử nghiệm. Các phương pháp in vivo
khác với in vitro (thí nghiệm ngoài cơ thể sống, thử nghiệm trong ống nghiệm) và
các thí nghiệm trên các mô hay cơ thể đã chết. Thông thường, khi nói đến in vivo,
người ta thường nghĩ đến các thí nghiệm, thử nghiệm trên đối tượng là sinh vật
sống. Các thí nghiệm sử dụng động vật hay các thử nghiệm lâm sàng trên người là
ví dụ của nghiên cứu in vivo [55].
Mô hiǹ h in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động của
thuố c lên có thể sinh vâ ̣t do có đầ y đủ sự tương tác của yế u tố : chấ t thử nghiê ̣m và
hê ̣ miễn dich
̣ của đối tượng thử nghiệm.

2


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Có nhiều loại động vật được sử dụng để xây dựng mô hình

in vivo như thỏ ,

cá, chuô ̣t, gà, .... Tuy nhiên, viê ̣c thử nghiê ̣m trên đô ̣ng vâ ̣t vấ p phải vấ n đề về đa ̣o
đức sinh ho ̣c, hàng năm có hàng nghìn độn g vâ ̣t bi ̣giế t để phu ̣c vu ̣ cho mu ̣c đić h thí
nghiê ̣m của con người.
Thử nghiê ̣m đô ̣c tính trên mô hình in vivo thường tố n nhiề u thời gian và cầ n
theo dõi chă ̣t chẽ , thường xuyên của người làm thí nghiê ̣m

, cầ n có khu vực thí

nghiê ̣m rô ̣ng raĩ , có đầy đủ điều kiện phù hợp với động vật thí nghiệm .
Như vâ ̣y , viê ̣c sử du ̣ng bấ t thể kì mô hin
̀ h nào cũng có ưu điể m và nhươ ̣c
điể m riêng. Nế u như mô hiǹ h in vitro thể hiê ̣n rõ ưu điể m trong quá trin
̀ h sàng lo ̣ c
nhanh với thời gian ngắ n , khả năng tự động hóa cao , sàng lo ̣c đươ ̣c nhiề u chấ t trên
quy mô lớn thì mô hiǹ h in vivo lại cho phép đánh giá chính xác tác động của thuốc
lên khố i u của cơ thể . Tùy vào mục đích thí nghiệm , người nghiên cứu phải lựa
chọn mô hình nuôi cấy phù hợp , tránh lãng phí , đă ̣c biê ̣t là vấ n đề đ ạo đức trong
sinh ho ̣c.
Dựa trên mục đích nghiên cứu của đề tài, chúng tôi xây dựng mô hình thử
nghiệm trên phôi cá ngựa vằn.
1.2. Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum)
1.2.1. Đặc điểm chung
Hà thủ ô đỏ tên khoa học là Fallopia multiflora (hay còn gọi là Polygonum
multiflorum), thuộc họ Rau răm – Polygonaceae [1, 2].

Hình 1.1. Cây và củ hà thủ ô đỏ.

3


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Đặc điểm thực vật: Dây leo nhỏ, sống dai, có rễ phình thành củ. Thân quấn
mọc xoắn vào nhau, màu xanh tía. Lá mọc so le, hình tim, có mũi nhọn ở đỉnh, dài 4
– 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm. Cuống lá có phủ lông, bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt. Hoa
hợp thành chùy ở nách lá hay ở ngọn, có nhiều nhánh. Hoa nhiều, nhỏ, đường kính
2 mm mọc ở nách các lá bắc ngắn. Bao hoa màu trắng ngà, nhị 8 trong đó có 3 nhị
hơi dài. Quả 3 góc nhẵn bóng nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài còn lại phát triển
thành cánh rộng [2].
Phân bố: Cây mọc hoang ở vùng núi cao các tỉnh phía Bắc như Lào Cai, Sơn
La, Lai Châu, Yên Bái .
Bộ phận dùng: Rễ củ tròn hoặc hình thoi, thường có những sống lồi dọc theo
củ. Củ dài 6 – 16 cm, chỗ phình thường có đường kính 4 – 8 cm. Có thể gặp những
củ dài đến 40 cm, đường kính trên 10 cm. Mặt ngoài màu nâu đỏ, mặt cắt màu
hồng, có bột. Vị hơi đắng chát. Thu hoạch vào mùa thu, đào lấy củ, rửa sạch, cắt bỏ
rễ con, cắt nhỏ rồi phơi hoặc sấy khô [2].
Thành phần hóa học: Thành phần tan trong nước của hà thủ ô có các
dẫn chất stilben glycosid như rhaponticosid; 2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2-Oβ-D-glucosid. Ngoài ra, hà thủ ô đỏ có nhiều tanin như: 3,3’-diOgalloylprocyanidinB-2, 3-O-gallyol-l-catechin, 3-O-galloyl-l-epicatechin, 3-O-galloyl-procyanidin-B1, d-catechin, d-epicatechin và acid gallic. Trong củ hà thủ ô đỏ có các dẫn chất
anthranoid với hàm lượng thấp: acid chrysophanic, emodin, physcion, chrysophanol
anthron, emodin-8-O-β Dglucosid. Từ phần tan trong ethyl acetate, một dẫn chất
naphtalen với nhóm chức amid cũng được phân lập và xác định cấu trúc với tên là
polygonimitin A. Trong thân hà thủ ô đỏ còn có chứa polygoacetophenoside, acid
chrysophanic anthron, chrysophanol [2].
1.2.2. Tác dụng hà thủ ô đỏ trong y học
Hà thủ ô có rất nhiều công dụng, chẳng hạn như chống oxy hóa, bảo vệ cơ

tim ex vivo, giảm xơ cứng động mạch, tăng tạo hồng cầu,... mà nổi bật trong số đó
là hoạt tính chống oxy hóa. Cao dịch chiết hà thủ ô ở phân đoạn ethyl acetate có tác
dụng chống oxy hóa mạnh, trong đó có các thành phần như anthraquinon, emodin,

4


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2- O-β-D-glucosid, acid gallic và catechin được xem là
một trong những chất có tác dụng chính.
Hà thủ ô chưa chế biến có tác dụng nhuận tràng. Y học cổ truyền dùng hà thủ
ô đỏ làm thuốc bổ gan thận, bổ máu, thuốc dùng cho những người có râu tóc bạc
sớm, lưng gối đau mỏi, đại tiện huyết, ung nhọt, tràng nhạc, thần kinh suy nhược,
sốt rét lâu ngày. Ngoài ra, hà thủ ô cũng được sử dụng làm thuốc an thần, thuốc cầm
mồ hôi, dùng ngoài trị lở ngứa [1, 2].
1.2.3. Một số nghiên cứu trên thế giới về hà thủ ô đỏ.
Dựa trên hiệu quả làm đen tóc của hà thủ ô mà các nhà khoa học đã bắt
đầu có những nghiên cứu về cơ chế tác động của nó lên khả năng sinh tổng hợp
của melanin:
Năm 2009, Jiang Z. và cộng sự đã tìm ra 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-Obeta-D-glucoside (THSG), một thành phần hòa tan được trong nước chiết xuất từ rễ
củ khô của Polygonum multiflorum, có hoạt tính làm tăng sắc tố trên dòng tế bào
B16. THSG làm tăng hàm lượng melanin và hoạt động của enzyme tyrosinase ở
nồng độ thích hợp. Xử lý tế bào B16 với 10μg/ml THSG thấy rằng có sự tăng biểu
hiện của tyrosinase theo thời gian. Sau đó, nhóm nghiên cứu tiếp tục phân tích ảnh
hưởng của THSG lên MITF và nhận thấy có sự tăng biểu hiện MITF đồng thời với
việc kích hoạt CREB, điều này dẫn đến dự đoán rằng sự hoạt hóa MITF thông qua
THSG có thể phụ thuộc vào cAMP [25].

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Park H. J. chứng minh được rằng dịch chiết
Polygonum multiflorum có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng của lông (tóc) từ giai đoạn
Telogen (giai đoạn nghỉ) sang giai đoạn Anagen (giai đoạn tăng trưởng) trên chuột
C57BL6/N [41].
1.3. Melanin
1.3.1. Giới thiệu về melanin
Melanin là một protein màu (chromoprotein) được tổng hợp từ tế bào hắc tố.
Từ những năm 1916-1921, Bruno-Bloch tìm thấy một chất không màu là DOPA có
khả năng bị oxy hóa thành hắc tố dưới ảnh hưởng của DOPA oxidase [9]. Năm
1953-1954 Fitzpatrick và Lerner đã xác nhận quá trình trên và phát hiện ra một chất

5


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

khác là tyrosine cũng tham gia vào quá trình tạo hắc tố của da [20]. Quá trình này
được tóm tắt như sau: tyrosine (trong máu) + tyrosinase (được hoạt hóa bởi proteinđồng) + tia tử ngoại  tiền hắc tố DOPA + DOPA oxidase + oxy DOPA-quinone
và các quinone khác + tyrosine + oxy  melanin. Tyrosinase (tyrosinase,
tyrosinase-related protein 1-Tyrp 1 và DCT) có liên quan đến quá trình tạo thành
hạt hắc tố, sản xuất eumelanin (hắc tố nâu đen) và pheomelanin (hắc tố vàng đỏ).

Hình 1.2. Công thức hóa học của eumelanin và pheomelanin [12].
Eumelanin là hợp chất cao phân tử có tính kiềm, màu nâu, không tan.
Eumelanin có thể bị oxy hóa khi có các ion kim loại và tạo thành hắc tố sáng màu
hơn [11,12]. Eumelanin hấp thu và phân tán tia cực tím, giảm mức độ xâm nhập và
tác hại của ánh nắng vào da [14]. Pheomelanin là hắc tố có tính kiềm, vàng nhạt.
Pheomelanin có thể bị oxy hóa và tạo ra các gốc tự do dưới tác động của

UVR, gây hại cho DNA. Điều này giải thích lý do vì sao người da sáng màu (nhiều
pheomelanin) dễ bị bỏng nắng và có nguy cơ cao bị tổn thương DNA tế bào da do
UVR, bao gồm cả u tân sinh (neoplasm) [12, 35].
1.3.2. Melanocyte
Tế bào hắc tố tổng hợp hắc tố nâu (melanin), quy định màu sắc của da và tóc,
đồng thời bảo vệ da chống lại tác hại của tia tử ngoại (UVR – ultraviolet ray). Về
cấu trúc, tế bào hắc tố có dạng cành cây, được biệt hóa từ nguyên bào hắc tố
(melanoblast), có nguồn gốc từ mào thần kinh [10, 48]. Ngay sau khi ống thần kinh
đóng lại, các tế bào hắc tố phát triển thành tế bào hoàn chỉnh và di chuyển đến nhiều
nơi khác nhau trong cơ thể như mắt (biểu mô hắc tố võng mạc, mống mắt, màng

6


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

mạch), tai (dải mạch trong ốc tai), hệ thần kinh trung ương (màng mềm), chất nền
của tóc, niêm mạc, da [36]. Tín hiệu nào tác động trực tiếp đến quá trình này vẫn
đang được nghiên cứu [10, 53].
1.3.3. Melanosome
Trong bào tương của tế bào hắc tố có chứa các “túi hắc tố” đa phân tử được gọi
là melanosome. Túi hắc tố là bào quan đặc biệt hình elip, nơi tổng hợp và dự trữ hắc
tố, dự trữ men tyrosinase và xảy ra các hiện tượng sinh hóa hình thành hạt hắc tố
melanin [31].
1.3.4. Cơ sở hóa sinh của quá trình tổng hợp melanin.
Cả 2 loại eumelanin và pheomelanin đều xuất phát từ hợp chất ban đầu là
dopaquinone (DQ). DQ có nguồn gốc từ sự oxy hóa acid amin tyrosine nhờ enzyme
tyrosinase. DQ là hợp chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin.

Hình 1.3. Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin [17]
Bước đầu tiên của quá trình này là sự oxy hóa tyrosine thành DOPAquinone
nhờ sự xúc tác của enzyme tyrosinase. Đây là bước duy nhất trong quá trình tổng
hợp melanin bị hạn chế tốc độ, các phản ứng sau này có thể diễn ra một cách tự phát
ở giá trị pH sinh lý [22]. Tiếp theo, DOPAquinone tự động oxy hóa tạo nên hai
phân tử DOPA và DOPAchrome. DOPA hoạt động như là chất nền cho tyrosinase
và bị oxy hóa một lần nữa thành DOPAquinone bởi enzyme này. Cuối cùng,

7


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

eumelanin được tạo thành sau một chuỗi phản ứng oxy hóa từ dihydroxyindole
(DHI) và dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA), là các sản phẩm của phản
ứng từ DOPAchrome. Nếu có mặt cystein (hay glutathione), DOPAquinone tạo
thành cysteinylDOPA (hay glutathionylDOPA) và sau đó hình thành nên sắc tố
pheomelanin. Mặc dù ba enzyme tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 và 2 – TRP
1 và TRP2 đều liên quan đến con đường tổng hợp melanin nhưng chỉ có tyrosinase
là enzyme không thể thiếu được cho quá trình này [30]. Tyrosinase là enzyme chỉ
được sản xuất duy nhất tại các tế bào melanocyte.
Sau khi được tổng hợp và trải qua quá trình chế biến ở lưới nội chất và thể Golgi,
nó được vận chuyển tới melanosome, xúc tác cho các phản ứng tạo melanin [15].
1.3.5. Cơ sở di truyền của quá trình tổng hợp melanin
Sự điều hòa tổng hợp hắc tố ở động vật có vú được kiểm soát ở nhiều mức
độ khác nhau và bởi nhiều phức hệ ở mỗi mức độ [4]. Trong quá trình phát triển
phôi, melanocyte ban đầu được phát sinh từ mào thần kinh và di chuyển tới các vị

trí đích trên khắp phôi. Quá trình này bị kiểm soát một cách chặt chẽ và đây chính là
mức độ kiểm soát đầu tiên trong điều hòa tổng hợp hắc tố. Quá trình sinh sắc tố
(melanogenesis) cũng được điều hòa ở mức độ tế bào thông qua điều khiển sự hình
thành melanosome – các hạt được sản xuất với kích thước, số lượng và mật độ khác
nhau phụ thuộc vào lượng melanin.
Cuối cùng, melanogenesis được điều hòa bởi mức độ dưới tế bào, tức là điều
hòa sự biểu hiện của các gen mã cho các enzyme tham gia tổng hợp hắc tố, bao gồm
tyrosinase, TRP1 và TRP2 được điều hòa bởi các con đường nội bào. Các con đường
điều hòa được kích hoạt bởi một loạt các hormone (interleukin, interferon, nhân tố phát
triển và prostaglandin) quy định số lượng cũng như chất lượng melanin được tạo thành.
Các hormone này còn điều khiển các phức hợp tín hiệu đáp ứng lại tác động của tia UV
hay tác động của môi trường. Có 3 con đường tín hiệu phổ biến điều hòa quá trình sinh
hắc tố: con đường α-MSH/MC1R/MITF (hình 1.4), con đường Wnt (β catenin/
MITF), con đường Ras/ERK/MITF (hình 1.4). Trong đó, dù là con đường điều hòa
nào cũng phải thông qua MITF. MITF liên quan đến sự tồn tại, tăng sinh và biệt hóa
melanocyte, nó là nhân tố chính điều hòa quá trình tổng hợp hắc tố ở melanocyte

8


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

thông qua việc gắn vào hộp M của vùng promoter và điều tiết biểu hiện các gen mã
cho tyrosinase, TRP1, TRP2 [20,49]. Do vậy, sự tăng cường hoạt động của MITF
kích thích biểu hiện các enzyme này, thúc đẩy quá trình tổng hợp sắc tố.
1.3.6. Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin.

Hình 1.4. Con đường tín hiệu điều khiển quá trình sinh tổng hợp melanin [47].

Chú thích:
Kích thích
Ức chế

1.3.6.1. Con đường α-MSH/MC1R/MITF.
Con đường cổ điển được coi là con đường chính thống nhất, khởi đầu bằng
sự kích hoạt phân tử MC1R và cuối cùng dẫn đến biểu hiện phiên mã của gene
tyrosinase. MC1R đóng vai trò trung gian trong một con đường truyền tín hiệu cổ
điển ở màng melanocyte.

9


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Khi MC1R được gắn vào thụ thể Gαs của nó ở trên màng tế bào
melanocytes, các hoóc môn kích hoạt adenylate cyclase (AC) để sản xuất cAMP.
cAMP được sản xuất ra sẽ kích hoạt PKA, sau đó kích hoạt MITF phiên mã thông
qua việc phosphoryl hóa các protein CREB. Sự phiên mã của các tyrosinase,
TYRP1 và TYRP2 được quy định bởi các yếu tố phiên mã MITF. Nhờ đó, khi
MC1R trong melanocyte được kích hoạt sẽ làm kích thích sự tổng hợp melanin, đặc
biệt là eumelanin thông qua việc thúc đẩy phiên mã của tyrosinase [18].
Khi α-MSH liên kết với MC1R có thể làm tăng đến 100 lần sự tổng hợp
melanin. Ngoài α-MSH thì β-MSH và hormone vỏ thượng thận (ACTH), cũng có
khả năng kích thích quá trình sinh tổng hợp melanin theo cùng con đường đó [28].

1.3.6.2. Con đường Ras/ERK/MITF.
 Quá trình tổng hợp melanin theo con đƣờng ERK

- Con đường thứ hai đi từ cAMP là con đường Ras/ERK.
- cAMP kích hoạt Ras, dẫn đến kích hoạt B-Raf, MEK và ERK. Ras/ERK
kích hoạt trong các tế bào này có hai tác dụng: Ban đầu, phosphoryl hóa MITF dẫn
đến tăng cường hoạt động phiên mã của promoter tyrosinase, cuối cùng làm tăng sự
tổng hợp melanin [32].
1.3.7. Các chỉ thị phân tử xác định mức độ biểu hiện melanin

1.3.7.1. Tyrosinase
Tyrosinase là một enzyme có hai hoạt tính hydroxylase và DOPA oxidase
được mã hóa bởi gen tyrosinase tham gia xúc tác cho hai bước đầu tiên của quá
trình chuyển hóa tyrosine thành melanin.
Tyrosinase gắn vào màng ngoài của hạt melanosome, cấu trúc gồm có ba
phần: một phần nằm trong melanosome có hoạt tính xúc tác của enzyme, phần thứ
hai ngắn nằm xuyên màng và cuối cùng là phần cho phép tyrosinase gắn chính xác
vào các hạt melanosome [6].
Như đã nhắc đến ở trên tyrosinase là enzyme không thể vắng mặt trong chuỗi
phản ứng tạo melanin, do đó đây chính là một chỉ thị phân tử cho phép xác định
gián tiếp mức độ biểu hiện của sắc tố melanin.

10


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

1.3.7.2. MITF
MITF là một nhân tố phiên mã đóng một vai trò quan trọng trong quá
trình phát triển của một số dòng tế bào, bao gồm các tế bào melanocyte, tế bào biểu
mô sắc tố võng mạc (RPE), các tế bào mast và tế bào hủy xương [42]. MITF-M là

một protein thuộc MITF chỉ biểu hiện trong các tế bào melanocyte và melanoma
(dòng tế bào ung thư da). Theo tổng hợp của Shigeki Shibahara và cộng sự (năm
2001, tạp chí Nature), MITF-M có thể được tăng cường biểu hiện bởi các yếu tố
hoạt động ở dạng cis như CREB, PAX3, SOX10 hay protein Wnt (là các
glycoprotein giàu cystein). Hoạt động cụ thể của MITF-M chính là nhân tố phiên
mã đóng vai trò chìa khóa cho tyrosinase. Nó tăng cường điều hòa và thúc đẩy sự
biểu hiện của tyrosinase. Ngoài ra, MITF còn liên hệ hết sức mật thiết đối với sự
tồn tại của tế bào melanocyte [41]. Vì những lý do trên mà MITF được coi là một
chỉ thị có giá trị trong đánh giá biểu hiện melanin ở tế bào melanocyte.

1.3.7.3. MC1R
MC1R ở người là một phân tử gồm 317 amino acid, thuộc lớp A của họ
GPCR. MC1R đã được tìm thấy ở trong rất nhiều loại tế bào bao gồm cả trong các
tế bào ở hệ thống miễn dịch, tuy nhiên nó lại chỉ chủ yếu biểu hiện trong các tế bào
sinh sắc tố melanocyte [8].
MC1R là phân tử nằm trên màng của tế bào melanocytes, được kích hoạt bởi
melanocortin, đặc biệt là hormone α-MSH của tuyến yên. MC1R có thể bị ức chế
bởi protein tín hiệu Agouti (ASP hoặc ASIP, ở chuột và ở người). Agouti hoạt động
bằng cách cạnh tranh với và ức chế tác dụng của melanocortin [8, 9].
1.4. Sự hình thành sắc tố melanin trong sự sinh trƣởng của cá ngựa vằn
1.4.1. Cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn Danio rerio còn được biết đến với tên gọi Brachydanio rerio là
một loài cá nhỏ nước ngọt nhiệt đới. Cá ngựa vằn thuộc chi Danio, họ Cá chép
Cyprinidae, bộ Cá chép Cypriniformes, lớp Cá xương Actinopterygii, ngành có dây
sống Chodarta, giới Animalia (theo Hamilton, 1822). Loài cá này phân bố chủ yếu
ở Nam Á, đặc biệt là vùng Bắc Ấn Độ, Pakistan, Nepal và Bhutan. Cá ngựa vằn có
thân mỏng, hơi dẹp bên, lưng màu oliu nâu, bụng màu trắng, có bốn sọc màu chạy

11

Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

dọc cơ thể. Chiều dài thân của cá trưởng thành khoảng 3 – 5 cm. Con cái lớn hơn
con đực, bụng tròn hơn. Vòng đời của chúng ngắn, sau khoảng 3 tháng có thể thành
thục sinh sản. Trong tự nhiên, cá sinh sản theo mùa, tuy nhiên trong phòng thí
nghiệm, có thể cho cá sinh sản theo chu kì sáng tối với 14 giờ chiếu sáng và 10 giờ
tối. Chúng sinh sản tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ môi trường nước khoảng 27 –
28˚C [16].
Cá ngựa vằn được đưa vào với quy mô lớn từ những năm cuối thập niên 70,
đầu thập niên 80 và nhanh chóng trở thành sinh vật mô hình lý tưởng cho nghiên
cứu sinh học phát triển cũng như các quá trình sinh học của tế bào. Cá ngựa vằn có
kích thước nhỏ, sống thành đàn, dễ chăm sóc, dễ dàng nuôi trong điều kiện phòng
thí nghiệm. Cá đẻ trứng với số lượng lớn (khoảng 200 trứng/1 tuần/1con cái), quá
trình sinh sản có thể được điều khiển bằng chu kì sáng tối nên có thể chủ động về
nguồn phôi cá trong quá trình nghiên cứu. So với các động vật có xương sống khác
thì sự phát triển của phôi cá ngựa vằn là vô cùng nhanh, chỉ mất khoảng 2 ngày, ấu
trùng nở vào ngày thứ 3, đến ngày thứ 5 hầu hết các loại tế bào đã biệt hóa và cá con
có đủ chức năng của chúng. Quá trình phát triển phôi cá ngựa vằn về cơ bản cũng
tương tự như các động vật có xương sống, bao gồm cả người và động vật có vú khác.
Tuy nhiên, sự phát triển của phôi cá ngựa vằn lại xảy ra ở ngoài cơ thể mẹ, điều này
cho phép thao tác dễ dàng với phôi mà không làm ảnh hưởng tới cá mẹ. Hơn nữa,
không giống như chim và bò sát, chúng có lớp vỏ trứng trong suốt và trứng tương đối
nhỏ nên có thể quan sát trực tiếp qua từng giai đoạn nhờ kính hiển vi quang học mà
không cần bất cứ sự can thiệp nào (như mổ và cắt phôi) hay các kỹ thuật hiện đại [16,
32]. Ngoài ra, hệ genome của cá ngựa vằn có mức độ tương đồng cao với các động
vật có xương sống bậc cao hơn, bao gồm cả người [24].
Thêm vào đó, cá ngựa vằn thu hút ngành công nghệ dược vì phôi cá ngựa

vằn có thể được sử dụng để sàng lọc các phân tử có hoạt tính sinh học từ nhiều
nguồn khác nhau. Cá ngựa vằn còn có thể được sử dụng trong các nghiên cứu về
độc tố học mà các đột biến được coi là nguyên nhân gây bệnh điển hình ở người hay
để thử thuốc và ứng dụng trong sinh học phát triển [15, 19].

12


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn
Theo mô tả của Kimmel và cộng sự (năm 1995), quá trình phát triển sớm của
cá ngựa vằn trải qua bốn thời kì chính, bao gồm: Thời kỳ 0 – 10 giờ 10 –24 giờ, 24
– 48 giờ và 48 – 72 giờ. Những đặc điểm phát triển nổi bật của các thời kì được mô
tả ở bảng 1.1 và hình 1.5.
Bảng 1.1. Đặc điểm nổi bật của các thời kì phát triển của phôi cá ngựa vằn [29].
Thời kì

Đặc điểm nổi bật

0-10 giờ

+ Giai đoạn hợp tử: Trứng mới được thụ tinh, vừa phải qua chu kỳ
phân cắt đầu tiên của tế bào.
+ Giai đoạn phân cắt: 2-7 chu kỳ phân cắt đầu tiên của tế bào diễn ra
nhanh chóng và đồng bộ.
+ Giai đoạn phôi nang: Chu kì phân cắt thứ 8,9 diễn ra nhanh chóng và
các tế bào bắt đầu lan phủ khắp noãn hoàng.

+ Giai đoạn phôi vị: Những chuyển động hình thái như sự co cụm, hội
tụ và mở rộng của ngoại bì, nội bì và trục phôi, quá trình lan tỏa của
các tế bào kết thúc.

10-24 giờ

Hình thành các đốt cơ, phát sinh hình thái các cơ quan chính, đuôi dài
ra và xuất hiện những chuyển động đầu tiên của cơ thể.

24-48 giờ

Trục cơ thể duỗi thẳng về túi noãn hoàng, sự lưu thông của dòng vật
chất trong cơ thể, sự xuất hiện sắc tố đen và vây cá bắt đầu phát triển.

48-72 giờ

Hoàn thiện nhanh chóng hệ thống các cơ quan chính, sự phát triển sụn
ở đầu và vây ngực, túi khí xuất hiện và phôi cá nở một cách đồng bộ.

13


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn [29].
1.4.2. Sự hình thành sắc tố melanin trong quá trình phát triển của cá ngựa vằn.
Trong quá trình phát triển phôi ở động vật có xương sống, các tế bào
mào thần kinh được phát sinh dọc theo ống thần kinh lưng, phân tán khắp cơ

thể và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm các tế bào thần
kinh cảm giác và thần kinh giao cảm, các tế bào Schwann và các tế bào sắc
tố [12, 44].
Ở cá ngựa vằn có 3 loại tế bào sắc tố chính: xanthophore, iridophore,
melanophore (thường dùng ở động vật biến nhiệt, hay còn gọi là melanocyte
ở các động vật hằng nhiệt). Quá trình biệt hóa các tế bào mào thần kinh thường xảy
ra trước khi các tế bào di cư. Điều này chứng tỏ rằng các tín hiệu thúc đẩy sự hình
thành và phát triển melanocyte xảy ra rất sớm trong quá trình phát triển. Sau khi thụ
tinh khoảng 24 giờ, tiền melanocyte (melanoblast) bắt đầu biểu hiện sắc tố melanin
[44].

14


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

Mô hình melanocyte ở phôi tiếp tục được phát triển và hoàn thiện trong vòng
48 giờ sau khi thụ tinh, chúng chỉ bổ sung một lượng tối thiểu melanocyte và giảm
dần số lượng tế bào này ở 12 ngày tiếp theo của quá trình phát triển ấu trùng [34,
45]. Số lượng và sự phân bố các tế bào sắc tố ở cá ngựa vằn là tương đối khác nhau
giữa giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành. Trước khi biến thái, sắc tố
xanthophore bao phủ hai bên sườn và melanophore tập hợp thành bốn dải sọc riêng
biệt: một dải ở phần lưng kéo dài từ đầu tới đuôi dọc theo đỉnh của các đốt cơ, một
dải ở phần bên nằm ngang các vách cơ, một dải ở mặt bụng xuất phát từ mắt kéo
qua phần lưng noãn hoàng và tới tận chóp đuôi, dải cuối cùng chạy qua phần bụng
noãn hoàng [29, 34].
Trong quá trình biến thái, bốn dải melanophore của phôi dần dần biến thành
các dải sắc tố của con trưởng thành [27, 40]. Lúc bắt đầu biến thái (khoảng 2 tuần

sau thụ tinh), xuất hiện các melanophore mới phân tán ở hai bên sườn và các tế bào
này dần dần tăng số lượng. Khoảng một tuần sau, số lượng các tế bào melanophore
tăng nhanh đột ngột, các sọc tối và sáng của con trưởng thành trở nên rõ rệt. Ban
đầu, hai sọc tối sơ cấp tạo thành hai sọc nằm ngang vách cơ ở mặt lưng và mặt bụng
với một sọc sáng nằm giữa, các sọc tối bao gồm melanophore và iridophore, các sọc
sáng chứa xanthophore và iridophore. Trong quá trình phát triển sau này, khoảng
vài tuần và vài tháng, các sọc sáng tối thứ cấp được thêm vào ở mặt lưng và mặt
bụng theo sự phát triển của cá, với 4-5 sọc tối ở mỗi con cá trưởng thành.
Cuối cùng, mặc dù sự xuất hiện các sọc sáng tối là kết quả của sự hình thành
các tế bào sắc tố nằm sâu trong lớp hạ bì, kề các đốt cơ nhưng sắc tố đen vẫn phổ
biến ở bề mặt lưng do các tế bào melanophore liên kết với các vảy da [23].
Quá trình phát triển của melanocyte ở cá ngựa vằn về cơ bản là tương tự các
động vật có vú, tuy nhiên vẫn có một số điểm khác biệt. Trong khi động vật có vú
chỉ có duy nhất một loại tế bào sắc tố là melanocyte thì ở cá lại có nhiều loại như đã
nhắc đến ở trên. Bắt nguồn từ mào thần kinh, các nguyên bào hắc tố (melanoblast) ở
phôi động vật có vú di chuyển qua màng đáy tới lớp biểu bì, tại đây, một số tế bào
bị phân tán và nhiều tế bào còn lại tập trung vào nang tóc. Ngược lại, ở cá, các
melanocyte lại nằm dưới màng đáy, trừ trường hợp chúng bị đẩy qua da trong quá

15


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

trình apotosis của tế bào [40, 50]. Các melanoblast ở động vật có vú không biểu
hiện sắc tố melanin cho tới khi sự di cư của các tế bào xảy ra, còn đối với cá ngựa
vằn, loại tế bào này đã biểu hiện melanin từ rất sớm (24h sau khi thụ tinh) [38, 49].
Ngoài ra, ở động vật có vú, melanin được đóng gói trong các hạt

melanosome và được vận chuyển từ các tế bào melanocyte sang các tế bào khác như
keratinocyte trong quá trình phát triển của tóc hay các tế bào thuộc lớp biểu bì lân
cận. Trong khi đó, các hạt melanosome được các tế bào melanocyte của cá giữ lại
và chúng có thể được tái phân bố khắp tế bào nhờ mạng lưới vi ống [26].
Sự điều hòa sinh tổng hợp melanin trong tế bào melanocyte ở cá ngựa vằn về
cơ bản cũng giống như ở động vật có vú, đều thông qua các con đường tín hiệu αMSH/Mc1r/Mitf, Wnt (β-catenin/Mitf), Ras/Erk/Mitf. Quá trình melanogenesis cho
dù được điều khiển bởi con đường nào cũng đều thông qua hai phân tử mấu chốt, đó
là mitf và tyrosinase [45]. Do đó, có thể phân tích sự biểu hiện phân tử này để từ đó
đánh giá gián tiếp mức độ biểu hiện melanin ở cá ngựa vằn.

16


Luận văn Thạc sĩ

Lê Thị Liên

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thực vật: rễ cây Hà thủ ô đỏ (dạng khô) được cung cấp từ Viện Dược
liệu. Sau đó được nghiền nhỏ thành bột mịn để dễ dàng sử dụng.
Mẫu động vật:
- Phôi cá thu được từ cá ngựa vằn trưởng thành thuộc Phòng Công nghệ tế
bào động vật, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
- Các dòng tế bào melanoma: SK-MEL-28 từ người được cung cấp bởi công
ty ATCC.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Nơi sản xuất

Tên hóa chất
DMEM

Hoa Kì

DMSO

Hoa Kì

Trypsin

Hoa Kì

Penicilin/Sterptomycin

Hoa Kì

Methanol

Trung Quốc

Ethyl acetate

Trung Quốc

n-hexan

Trung Quốc

FBS

Hoa Kì

Formalin

Trung Quốc

Tím tinh thể

17