Bài giảng thực hành công nghệ enzyme
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.51 MB, 45 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CNSH- KTMT
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG THỰC HÀNH
CÔNG NGHỆ ENZYME
Hệ đại học
TP. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014
Lưu hành nội bộ
MỤC LỤC
BÀI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3
1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC ...................................................................................................... 3
2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG .................................................................................................... 3
3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM.................................................................. 4
4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME ................. 8
BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME ........................................................... 11
XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE ....................................................... 11
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 11
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 11
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 12
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 14
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 14
BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE ................................................. 15
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 15
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 15
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 17
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 21
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 21
BÀI 3. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN ........................................................... 22
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON ....................................................................................... 22
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 22
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 22
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 23
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 26
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 26
BÀI 4. NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE .................................................... 27
ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE .................................................................................. 27
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 27
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - H A CHẤT- MẪU VẬT............................................................ 27
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 28
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 30
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 30
BÀI 5. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE TÁCH TỪ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE ......................................................................................... 31
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 31
Bộ môn Công nghệ sinh học
1
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 31
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 32
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 35
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 35
BÀI 6. SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO ................................... 36
1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 36
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 36
3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 37
4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 41
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 42
TÀI LIỆU MÔN HỌC .......................................................................................................... 43
PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH .................................................................. 44
Bộ môn Công nghệ sinh học
2
BÀI MỞ ĐẦU
1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC
Sau khi học xong môn học sinh viên có khả năng:
- Chứng minh, củng cố lý thuyết, áp dụng kiến thức vào thực tế.
-
Có kỹ năng thao tác, sử dụng các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm.
-
Thực hiện nghiêm túc nội quy phòng thí nghiệm.
-
Hoàn thành bài thực hành theo thời gian quy định.
2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG
1. Sinh viên đọc và tóm tắt bài trước khi đến lớp. Tự soạn bài để tham khảo
trong lúc làm thí nghiệm. Không được đem bài giảng vào (PTN.
2. Có phiếu điểm danh theo buổi quên, không mang bị trừ điểm và phải viết đơn để
giáo viên xác nhận có đi buổi học đó.
3. Nghỉ phải có đơn xin phép GV dạy và xác nhận của GV dạy học bù. Phải viết bài
báo cáo riêng buổi bù nộp cho GV mà sinh viên đó đăng ký môn học.
4. Viết báo cáo theo tổ, nộp file word cho nhóm trưởng. GV nhận được bài báo cáo
sau 1 tuần của buổi học từ nhóm trưởng qua mail trước 0h của buổi kế tiếp.
5. Kết thúc môn học 1 tuần các nhóm gộp 6 bài lại thành 1 file gửi lại cho giáo viên.
Sau đó in toàn bộ bài trên giấy A4 nộp lại. (SV có thể cập nhật lại bài nếu phát hiện
ra lỗi so với bài đã gửi cho GV)
6. Địa chỉ mail: , ,
7. SV phải xem kỹ bài thực hành trước khi vào PTN. Đầu buổi có kiểm tra bài trắc
nghiệm, điền khuyết, câu hỏi nhỏ....(Lớp bỏ quỹ trả tiền photo đề trong các buổi
kiểm tra). Nếu kiểm tra đầu giờ không đạt sẽ phải ra về ngay. Sau đó xin giấy vào
lớp của phòng Công tác học sinh – Sinh viên với lý do không chuẩn bị bài. Rồi bố
trí đi bù buổi thực hành khác. Phải có đơn đồng ý của GV dạy chính và GV dạy bù.
8. SV phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí
nghiệm cho bài thực tập của mình.
9. SV phải có mặt ở phòng thí nghiệm (PTN) đúng giờ qui định: Sáng 7h, chiều 12h30
và phải có mặt tại PTN suốt thời gian thực hành. Đến trễ 10 phút không được vào
lớp. Mặc áo blouse khi vào phòng thí nghiệm.
10. Mỗi nhóm cử một đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ
(thiếu, hỏng, bể) báo cáo ngay cho GVHD. SV phải rửa dụng cụ sạch sẽ trước và
sau khi thí nghiệm. Kết thúc buổi thực tập mỗi nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ
nhóm làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát, hư hỏng phải báo ngay GVHD và
mua đền vào buổi học tuần kế tiếp.
Bộ môn Công nghệ sinh học
3
11. Mỗi buổi thực hành, các nhóm làm theo phân công trong bảng. Nhóm trực nhật có
nhiệm vụ: dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước và cửa trước khi ra về. Không hoàn
thành nhiệm vụ kết quả bài thực hành đó đạt điểm 0
Công việc
Buổi 1
Buổi 2
Buổi 3
Buổi 4
Buổi 4
Buổi 6
Dụng cụ
1
5
9
3
7
1,2
Hóa chất
2
6
10
4
8
3,4
Thiết bị
3
7
1
5
9
5,6
Vệ sinh
4
8
2
6
10
7,8,9,10
12. Nhóm sinh viên làm phúc trình theo yêu cầu của từng bài, nộp cho giáo viên vào buổi
thực hành kế tiếp. Kết thúc môn có thi kiểm tra theo yêu cầu giáo viên.
13. Tiêu chuẩn đánh giá bài tập – thí nghiệm thực hành
- Điểm môn học là điểm trung bình cộng của 6 bài
- Nhóm trưởng sẽ được cộng 0,3 điểm thưởng/ điểm tổng kết môn học.
STT
1
Tiêu chí đánh giá
Nội dung
Điểm tối đa
Nguyên tắc
0.5 điểm
Tiến trình thí nghiệm
2 điểm
Giải thích thí nghiệm
2 điểm
Kết quả
1 điểm
Kết luận - Kiến nghị
0.5 điểm
Trả lời câu hỏi cuối bài
1 điểm
2
An toàn, tổ chức
1 điểm
3
Thời gian
1 điểm
4
Kỹ năng thao tác
1 điểm
3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM
Enzyme là một phân tử sinh học rất nhạy với sự thay đổi pH của môi trường,
nên vấn đề pha và sử dụng dung dịch đệm trong chiết tách Enzyme là rất quan
trọng. Vì giới hạn chương trình, nên chỉ trình bày cách pha và sử dụng những dung
dịch đệm cần thiết.
3.1 Định nghĩa pH
Giá trị của pH của một dung dịch được tính theo công thức:
pH = - log aH+
Trong đó:
- a H+ biểu thị hoạt động của ion có trong dung dịch và được tính theo biểu thức:
aH = f. CH+
- Với:
Bộ môn Công nghệ sinh học
4
CH+ là nồng độ H + trong dung dịch được tính theo đơn vị ion gam /l.
f là hoạt độ H+, f ≥ 1.
Khi nồng độ H+ trong dung dịch tăng thì f giảm và ngược lại khi nồng độ của H+ rất
nhỏ (dung dịch loãng) thì f = 1, lúc đó ta sẽ có:
CH+ = aH+
Vì thế, trong các dung dịch loãng có thể tính pH gần đúng theo công thức:
pH = -log CH+
Sự phát triển, diễn tiến của nhiều quá trình hóa học, sinh học, sinh hóa…. đòi
hỏi phải ở những giá trị pH nhất định không đổi hoặc có thay đổi chỉ là trong mức độ
rất nhỏ không đáng kể. Vì thế cần phải có các dung dịch đệm cho pH.
3.2. Định nghĩa dung dịch đệm
Dung dịch đệm pH là dung dịch chứa các chất có tác dụng giữ giá trị pH trong
giới hạn nhất định khi thêm acid mạnh hay kiềm mạnh vào dung dịch đó.
Các dung dịch có tính chất này thường là dung dịch hỗn hợp của một cặp acid
và base liên hợp, ví dụ: CH3COOH và CH3COONa, NH4+ và NH3, H2PO4- và
HPO42-…. Nhưng phổ biến là các dung dịch hỗn hợp của acid yếu và base liên hợp với
nó hay ngược lại.
Vì thế tác dụng đệm chỉ có hiệu lực lớn hơn trong một phạm vi nhất định tùy
thuộc vào bản chất của từng acid yếu và vùng đệm hiệu lực.
Tính theo công thức: pH = pKa 1.
Trong đó: pKa = - logKa với Ka là hằng số phân ly H+ của acid trong nước.
Vì thế mỗi một hỗn hợp đệm chỉ có tác dụng trên từng thang đo pH. Do đó
muốn đệm cho vùng pH rộng phải có dung dịch đệm của hỗn hợp nhiều hệ acid và
base liên hợp. Ví dụ, dung dịch đệm gồm CH3COOH và CH3COONa có tác dụng tốt
trong khoảng pH = 3,7 5,7. Trong khi đó dung dịch đệm gồm NH4+ và NH3 lại có tác
dụng đệm tốt trong vùng pH = 8 11. Với hỗn hợp đệm gồm acid H3PO4 và muối của
nó thường có tác dụng đệm tốt trong hai vùng pH, tương ứng với hai hằng số phân ly
acid Ka1 và Ka2 vùng I có pH = 1 3,6 và vùng II pH = 6 8,3.
3.3. Hiệu ứng pha loãng dung dịch đệm
Theo công thức pH của dung dịch đệm :
pH = pKa – log (Ca/Cb)
Ca: là nồng độ acid
Cb: là nồng độ của base liên hợp
Khi pha loãng, số lần pha loãng nồng độ Ca và Cb là như nhau nên tỷ số Ca/Cb
không thay đổi, nhưng hằng số điện ly ra H+ của acid và hoạt độ của các ion trong
dung dịch thay đổi. Vì thế khi pha loãng sẽ làm thay đổi một ít pH của dung dịch đệm.
Bộ môn Công nghệ sinh học
5
Sự thay đổi pH này được gọi là hiệu ứng pha loãng của dung dịch đệm. Hiệu ứng này
rất khác nhau đối với mỗi loại dung dịch đệm. Đặc trưng cho hiệu ứng này là pH1/2.
pH1/2 là giá trị pH thay đổi của dung dịch đệm khi pha loãng gấp đôi bằng nước cất.
Nếu khi pha loãng pH của dung dịch tăng, ta có hiệu ứng dương. Còn nếu pH
giảm ta có hiệu ứng âm. Ví dụ khi pha loãng dung dịch đệm ta có pH1/2 = -0.05, tức
là pH của dung dịch đệm này đã giảm 0.05 đơn vị pH khi pha loãng gấp đôi nó.
3.4. Cách pha chế các dung dịch đệm
Các hoá chất khi sử dụng cho pha dung dịch đệm đòi hỏi phải tinh khiết. Nước cất
dùng để pha chế phải đun sôi, đuổi hết khí CO2 trước khi dùng, đồng thời phải đậy kín
tránh khí CO2 từ không khí hòa tan vào khi để nguội.
Nồng độ đặc trưng của các dung dịch đệm phải chính xác, nên hạn chế việc sử
dụng các dung dịch quá loãng hoặc quá đậm so với nồng độ đặc trưng vì sẽ gây sai số.
Các dung dịch đệm sau pha tốt nhất nên được sử dụng trong vòng một tháng.
Có nhiều dung dịch đệm được pha với nhiều hóa chất khác nhau, tuy nhiên trong
chiết tách Enzyme, những dung dịch đệm sau đây thường được dùng:
3.4.1. Hỗn hợp đệm KCl và HCl
Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch KCl 0,2 M (14.9 g/l) và dung
dịch HCl 0,2 M (18 ml HCl đặc 36%). Hỗn hợp đệm này chứa 25 ml dd KCl 0,2 M và
x ml HCl 0,2 M theo bảng sau:
pH ở 25oC
X ml HCl 0.2 M
pH1/2
1,00
67,00
+0,04
1,10
1,20
1,30
52,80
42,50
33,60
1,40
1,50
1,60
1,70
1,80
1,90
2,00
2,10
2,20
26,60
20,70
16,20
13,00
10,20
8,10
6,50
5,10
3,90
+0,13
+0,27
3.4.2. Hỗn hợp đệm K2HPO4 – HCl
Bộ môn Công nghệ sinh học
6
Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l)và
dung dịch HCl 0,1 M (9 ml HCl đặc 36%). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K2HPO4
0,1 M và X ml HCl 0,1 M theo bảng sau:
pH ở 25oC
X ml HCl 0.1 M
pH1/2
2,20
2,30
49,50
45,80
+0,14
2,40
2,50
42,20
38,80
2,60
2,70
35,40
32,10
2,80
2,90
3,00
28,90
25,70
22,30
3,10
3,20
3,30
3,40
3,50
18,80
15,70
12,90
10,40
8,20
3,60
3,70
3,80
3,90
4,00
6,30
4,50
2,90
1,40
1,10
+0,08
+0,09
+0,04
3.4.3. Hỗn hợp đệm K2HPO4- NaOH
Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K2HPO4 0,1 M (20,42 g/l) và
dung dịch NaOH 0,1M (4 gam NaOH/lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K2HPO4
0,1 M và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau:
pH ở 25oC
X ml NaOH 0,1 M
pH1/2
4.10
4.20
4.30
1.30
3.00
4.70
+ 0.05
4.40
4.50
4.60
6.60
8.70
11.10
Bộ môn Công nghệ sinh học
7
4.70
13.60
4.80
4.90
5.00
5.10
16.50
19.40
22.60
25.50
5.20
5.30
28.80
31.60
5.40
5.50
34.10
36.60
5.60
5.70
38.80
40.60
5.80
5.90
42.30
43.70
+ 0.06
+ 0.06
+ 0.14
3.4.4. Hỗn hợp đệm KH2PO4 – NaOH
Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch KH2PO4 0,1 M (12,61 g/l) và
dung dịch NaOH 0,1 M (4.00 g/ lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd KH2PO4 0,1 M
và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau:
pH ở 25oC
X ml NaOH
0.1 M
5,80
5,90
6,00
6,10
6,20
3,60
4,60
5,60
6,80
8,10
6,30
6,40
6,50
6,60
6,70
6,80
6,90
9,70
11,60
13,90
16,40
19,30
22,40
25,90
pH1/2
pH ở 25oC
X ml NaOH
0.1 M
+0,07
7,00
7,10
7,20
7,30
7,40
29,10
32,10
34,70
37,00
39,10
7,50
7,60
7,70
7,80
7,90
8,00
40,90
42,40
43,50
44,50
45,30
46,10
+0,05
pH1/2
+0,08
+0,06
4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME
Tùy theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương
pháp làm sạch cho thích hợp. Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dù trình tự và các
thủ thuật ở các bước có thể thay đổi, song vẫn có những nguyên tắc chung.
Bộ môn Công nghệ sinh học
8
Phá vỡ tế bào
Enzyme có trong tế bào chất của sinh vật và các cấu tử (nhân, lạp thể, ty thể,
lysosome...) của tế bào. Nhưng các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng
của tế bào và màng của các cấu tử. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước
đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào
dung dịch.
Tác nhân cơ học
Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với
bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Để
việc phá vỡ có hiệu quả ở mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu
để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô
của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.
Tác nhân vật lý, hóa học
Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng
các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dung môi hữu cơ (butanol,
aceton, glycerin, ethyl acetate..) và chất detergent (chất tẩy). Các hóa chất có tác dụng
tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Chiết
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất,
bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút:
- Nhiệt độ: Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến
hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (30C ÷ 50C). Các thao tác phải nhanh.
- Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2,
CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
Khử màu: Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật, có
trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt
độ enzyme. Trong trường hợp này người ta còn cho thêm vào chất khử để loại màu. Ở
các mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu. Người ta thường loại màu trên cột
nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu
bị giữ lại và enzyme không bị giữ. Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH. Sau
khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme.
Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử
-
khác nhau như polysaccharid, nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường
monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện
pháp khác nhau.
Kết tủa
Bộ môn Công nghệ sinh học
9
Cồn nồng độ cao (960 – 980 ) với tỉ lệ về thể tích 1 E : 3 cồn hay 1 E : 4 cồn.
Các dung môi như isopropanol, aceton với tỉ lệ dung dịch Enzyme : dung môi
là 1:1,5 hay 1: 2. Chú ý khi tủa E bằng các dung môi trên tốt nhất là nên ở nhiệt độ
thấp từ 30C ÷ 50C, khuấy đều khi cho dung môi từ từ vào.
Các dung dịch muối trung tính như NaCl, (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4…là tác
nhân tủa tích cực. Thông thường hay dùng dung dịch (NH4)2SO4 vì độ hòa tan muối
này cao (chiếm từ 50 – 60 % so với dịch enzyme) không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ,
không làm biến tính enzyme. Với pepsin người ta hay dùng NaCl (20 – 25%) vì muối
này rẻ, dễ tìm, không ảnh hưởng đến hoạt tính của E….
Tinh sạch
Sau khi kết tủa E, ly tâm, phần E tủa lúc này còn chứa nhiều tạp chất như protein,
muối, các chất có trọng lượng phân tử thấp khác, chất màu…. Nên ta cần tiến hành
tinh sạch theo các biện pháp sau:
- Tách chất có trọng lượng phân tử thấp (như muối..) bằng phương pháp thẩm tích
qua màng bán thấm.
- Tách một phần các chất tạp bằng nồng độ rượu thấp (40 – 45%) khi đó E chủ yếu
nằm trong dung dịch.
- Có thể hòa tan E bằng lượng nước tối thiểu, lọc bỏ chất không tan, rồi kết tủa lại
bằng rượu cao độ.
- Hiện nay việc chiết tách, tinh sạch E đã được tiến hành với hiệu suất tương đối cao
bằng các kỹ thuật hiện đại như lọc gel, hấp phụ chọn lọc, sắc ký trao đổi ion….
Bộ môn Công nghệ sinh học
10
BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME
XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE
1. MỤC ĐÍCH
- Xây dựng phương trình động học Michaelis-Menten.
- Xác định thông số động học Vm, Kmax.
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT
Dụng cụ, hóa chất, thiết bị sử dụng cho bài thực hành được kê theo bảng 1.1.
ảng 1.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành
(cho
nhóm g m
sinh viên
A. HÓA CHẤT:
STT
TÊN HÓA CHẤT
QUY CÁCH
SL/ĐVT
Lít
1
1
Nước cất 2 lần
2
Casein
g
3
3
Enzyme Savinase
ml
200
4
Folin
ml
50
5
Tyrosine
g
1
6
Giấy lọc
Hộp
1
7
ml
200
8
Đệm photphat pH =8
Dung dịch casein 12mM/
đệm photphat pH = 8
ml
200
9
TCA 5%
ml
500
10
NaOH 0,5N
ml
500
11
HCl 0,2N
12
ml
500
0
ml
600
TÊN DỤNG CỤ
QUY CÁCH
SL/ĐVT
Cồn 70
GHI CHÚ
PTN, cả lớp
B. DỤNG CỤ:
STT
1
Ống nghiệm Ф 18
cái
18
2
Pipet 10
cái
1
3
Pipet 1
cái
1
4
Pipet 5
cái
1
5
Quả bóp
cái
1
6
Bình tia
cái
1
7
Đũa thủy tinh
cái
1
8
Cốc 100
cái
1
9
Cốc 250
cái
1
Bộ môn Công nghệ sinh học
GHI CHÚ
1 tổ
11
10
Phễu Ф 60
cái
3
11
Bình định mức 250
Cái
1
QUY CÁCH
SL/ĐVT
C.THIẾT BỊ:
STT
TÊN THIẾT BỊ
1
Máy đo quang phổ
Cái
2
2
Cân 2 số
Cái
2
3
Máy ổn nhiệt
Cái
1
4
Máy khuấy từ
Cái
1
5
Máy Votex
Cái
2
GHI CHÚ
Cả lớp
Tổ 1: Pha dung dịch casein 12 mM: Cân 2g casein vào cốc pha, thêm vào khoảng
20-30 ml dung dịch NaOH 0,5N, đặt lên máy khuấy từ ở 50-600C khuấy cho casein
tan hết, vẫn để dung dịch trên máy khuấy từ, tiếp tục khuấy nhưng không gia nhiệt
nữa; dùng HCl có nồng độ tương ứng nhỏ vào từ từ đến khi pH đạt từ 7,5-8 (nhớ
nhỏ HCl vào từ từ để tránh casein bị tủa và pH tăng quá nhanh), dùng đệm
phosphate pH = 8 định mức đến 200 ml.
Tổ 2: Pha dung dịch đệm phosphate:
- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 23,9 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ
1000 ml.
- Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 9,07 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 1000
ml.
Trộn 969 ml Na2HPO4 1/15M với 31 ml KH2PO4 1/15M thu được 1000 ml dung
dịch đệm phosphate pH = 8
Tổ 3: Pha dung dịch chuẩn Tyrosine (1mM): 181,19 mg Tyrosine hòa tan trong
HCl 0,2N đủ 1 lít.
Tổ 4: Pha dung dịch savinase 2%: Hút 8 ml enzyme Savinase thương mại hòa tan
trong 392 ml nước cất.
3. NỘI DUNG
Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis
Km. Tốc độ của phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có
trong môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ
lệ thuận với nồng độ cơ chất.
Do đó chúng tôi khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thuỷ phân casein của
savinase bằng cách thay đổi nồng độ casein từ 2.4 – 12 mM để tìm khoảng nồng độ
casein mà trong đó enzym chưa bị bão hoà bởi cơ chất.
Bộ môn Công nghệ sinh học
12
Xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thuỷ phân của enzym và nồng
độ cơ chất theo phương trình Lineweaver – Burk
1
1
K 1
M.
v v max v max S
Enzyme Savinase được sản xuất bởi quá trình lên men của các vi sinh vật biến
đổi gen (Bacillus amyloliquefaciens). Sau khi kết thúc quá trình lên men, savinase
được tách chiết và tinh sạch từ các sản phẩm lên men. Enzyme này được ứng dụng
trong việc sản xuất bột giặt, nước rửa chén vì chúng giúp tẩy sạch các vết bẩn trên
quần áo có nguồn gốc từ thức ăn: trứng, thịt...hoặc vết máu, bùn...Savinase có tác
dụng thủy phân protein thành các peptide ngắn, tan trong nước.
Enzyme Savinase hoạt động trong môi trường kiềm cao, pH dao động từ 8 – 12
(tối ưu pH = 10), nhiệt độ hoạt động của nó từ 20-600C (tối ưu ở 550C), được bảo
quản ở nhiệt độ từ 3 – 50C.
3.1. Lập đƣờng chuẩn Tyrosine
Nhóm cử 1 tổ chẵn, 1 tổ lẻ làm đường chuẩn
Ống nghiệm
0
1
2
3
4
5
Dd tyrosine chuẩn (ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Tyrosine tương ứng (µmol)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
HCl 0.2N (ml)
5
4.8
4.6
4.4
4.2
4
?
?
?
NaOH 0.5N
10
Folin pha loãng 3 lần
1
Lắc mạnh, để yên trong 10 phút
Đo OD (Abs) tại λ =660 nm
0
?
?
Dựng đường chuẩn tyrosine biểu diễn sự tương quan giữa lượng tyrosine và OD.
Ống 0 là ống mẫu, các ống khác là ống thí nghiệm.
3.2. Xác định thông số động học của enzyme savinase
Tiến hành thí nghiệm
Ống nghiệm
0
1
2
3
4
5
Casein 12 mM (ml)
0
1
2
3
4
5
Đệm phosphate (ml)
5
4
3
2
1
0
Nồng độ Casein (mM)
0
2.4
4.8
7.2
9.6
12
Savinase 2% (ml)
5
Để yên ở 50-550C trong 2 phút
TCA 5% (ml)
Bộ môn Công nghệ sinh học
5
Để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới
13
Ống nghiệm
0
1
2
3
Dịch lọc
5
NaOH 0.5N (ml)
10
Folin pha loãng 3 lần
(ml)
1
4
5
?
?
Lắc mạnh, sau đó để yên trong 10 phút
Đo OD (Abs)
0
tại λ =660 nm
?
?
?
Dựa vào đồ thị chuẩn ta suy ra lượng Tyrosine tương ứng.
Ống nghiệm
1
2
3
4
5
OD (y)
Lượng tyrosine (x)
Tính vận tốc phản ứng (V) ở các nồng độ cơ chất tương ứng:
V = d(P)/dt = Lượng tyrosine/thời gian.
Lập đồ thị thể hiện mối tương quan giữa 1/S và 1/V dựa vào bản sau:
Ống nghiệm
1
2
3
4
Lƣợng casein (S)
1/S
V
1/V
5
Sử dụng phần mềm Excel hoặc áp dụng phương pháp bình phương cực tiểu để
xây dựng đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng.
Tham khảo bài 10 trang 66 sách Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Trần Bích
Lam NXB ĐHQG TP HCM
4. BÁO CÁO
1. Vẽ đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V dựa trên kết quả thực nghiệm.
2. Xác định thông số động học Km và Vmax.
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ
Theo yêu cầu chung môn học.
Bộ môn Công nghệ sinh học
14
BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE
1. MỤC ĐÍCH
Sau khi học xong bài sinh viên có khả năng:
-
Viết quy trình tách chiết, thu nhận dung dịch enzyme bromeline thô.
Xác định hoạt tính enzyme bromeline.
-
Viết quy trình thu nhận enzyme bromeline ở dạng paste.
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT
ảng 2.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành
(cho nhóm g m sinh viên
A. HÓA CHẤT
TÊN HÓA CHẤT
STT
1
SL/ĐVT
gam
100
2 Cồn 90o
lit
3
3 Thơm (dứa) xanh
trái
5
4 Vải lọc
m
1
5 DD NaOH 0.5 N
ml
250
6 DD NaOH 1.0 N
ml
100
7 DD HCl 0.2 N
ml
300
8 DD HCl 2 N
ml
100
9 Folin Ciocaltue
ml
80
Acid tricloacetic TCA
10 (Cl3COOH) 5%
ml
200
11 KH2PO4 1M
ml
100
12 Hemoglobin
gam
5,0
13 Tyrosine
gam
3
14 Urê
gam
80
Túi colodion hoặc
15 cellophane
túi
10
Đệm phosphate có pH = 7,
16 nồng độ 0,01M
lit
3
17 Nước cất 2 lần
lit
3
Hộp
1
18
(NH4)2SO4
QUY CÁCH
Giấy lọc
GHI CHÚ
PTN
HS mua
B. DỤNG CỤ
STT
TÊN DỤNG CỤ
Bộ môn Công nghệ sinh học
QUY CÁCH
SL/ĐVT
GHI CHÚ
15
1
Ống đong 50ml
Cái
1
2
Ống nghiệm phi 18
Cái
10
3
Giá ống nghiệm
Cái
1
4
Pipep man 100 -1000µl
Cái
1
5
Pipep 1ml
Cái
1
6
Pipep 2ml
Cái
1
7
Pipep 5ml
Cái
1
8
Phễu thủy tinh
Cái
1
9
Bình tia nước cất
Cái
1
10
Dao inox
Cái
1
11
Quả bóp
Cái
1
12
Bình định mức 100
Cái
1
13
Cốc 100
cái
3
14
Bình tam giác nút mài 100
cái
1
15
Đũa thủy tinh
cái
10
16
Cốc thủy tinh 500ml
Cái
2
17
Cồn kế 50-100
Cái
1
18
Cốc thủy tinh 1000ml
Cái
10
1 tổ
cả lớp
C.THIẾT BỊ
STT
TÊN THIẾT BỊ
QUY CÁCH
SL/ĐVT
1 Máy đo quang phổ
Cái
2
2 Cân 2 số
Cái
1
3 Máy ly tâm 6000v/p
Cái
1
4 Máy xay sinh tố
Cái
1
5 Máy khấy từ
Cái
2
GHI CHÚ
cả lớp
Chuẩn bị hóa chất:
Tổ 5: Pha dung dịch acid Trichloroacetic 5%: Cân 5 g pha với nước cất thành
100ml.
Tổ 6: Pha Dung dịch đệm KH2PO4 1M: Cân 13.6 g pha với nước cất thành
100ml.
Tổ 7: Pha dung dịch Tyrosine 1/400N mẫu: Cân 45 mg Tyrosine pha trong
100ml HCl 0.2N.
Tổ 8: Pha dung dịch Hemoglobin 2%: Cân 2g Hb + 36g Ure + 8 ml dung dịch
NaOH 1N hòa trong 40 ml nước cất. Để ở 25oC trong 60 phút. Thêm 10 ml dung dịch
Bộ môn Công nghệ sinh học
16
đệm KH2PO4 1M, điều chỉnh lại pH =6 với dung dịch HCl 2N. Thêm nước đầy tới
vạch mức 100ml. Bảo quản trong tủ lạnh.
3. NỘI DUNG
3.1. Nguyên tắc
Bromeline là một enzyme thuộc nhóm protease có nhiều trong trái thơm. Chúng ta
tiến hành khảo sát bromeline qua khả năng thủy phân các cơ chất protein
(Hemoglobin, Casein, Albumin….) tạo ra các sản phẩm tan trong dung dịch TCA là
các peptide có chứa Tyrosine. Việc định lượng Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc
thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân của enzyme.
3.2. Chiết dịch thơm có chứa Enzyme
Nguyên liệu: ngọn (đỉnh sinh trưởng), vỏ quả, thịt và lõi thơm.
Tổ 3: Dứa gọt vỏ, bỏ lõi, cân khối lượng m (g), xay nhỏ bằng máy xay sinh tố
lọc qua vải màn 2 lớp 1 lần, qua bông 1 lần, bỏ cặn, thu dịch ly tâm 4500 vòng /10
phút thu V ml dịch lọc thô có chứa bromeline. Chia về các tổ, mỗi tổ 50 ml thực
hiện thí nghiệm: 10ml dành cho thử hoạt tính, 20ml dành cho tủa bằng Ethanol, 20ml
dành cho tủa bằng muối (NH4)2SO4.
Quy trình trích ly và thu nhận bromeline dạng thô
Dứa
Làm sạch
Nghiền ép, xay nhuyễn
Lọc
Bã
Ly tâm 4500 v/ 10ph
Bã
Dịch enzyme thô
3.3. Phƣơng pháp tủa bromeline
a. Phƣơng pháp tủa bằng dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton)
Bộ môn Công nghệ sinh học
17
Cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích
điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự
hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ
(ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu). Tiến hành ở nhiệt độ thấp
(≤ 50C), có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme. Khi kết tủa, chú ý lấy nhanh kết
tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy li tâm. Phương pháp này lợi thế là không
cần loại muối, nhưng nhược điểm là hay có màu.
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong
số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có
hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa
chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein
trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol)
ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của
những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện
hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong
nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có
nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm
gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách
bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Quy trình kết tủa enzym Bromeline bằng cồn 80%
Cồn 80%, 40C
Dịch enzyme thô
Tủa cồn 4oC / 1 giờ
Ly tâm 4500 v/p
10 phút
Thu tủa
Bỏ dịch
trong
Sấy khô
Bromeline
Bộ môn Công nghệ sinh học
18
Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn).
Phƣơng pháp tủa bằng muối:
Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này
vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu),
vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa
với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi
hỗn hợp của chúng.
Quy trình thu nhận enzym Bromeline bằng muối (NH4)2SO4
Ammonium sulfate
70% bão hòa
Dịch enzyme thô
Để yên, ở nhiệt độ
phòng 30 phút
Ly tâm 4500 v/p, trong
10 phút
Thu tủa
Bỏ dịch
trong
Thẩm tích
Sấy khô
Bromeline
Lưu ý: Để có muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối
trong 100ml nước thơm.
Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.
Phƣơng pháp thẩm tích
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng
thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các
dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc
cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào
Bộ môn Công nghệ sinh học
19
nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ
0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất
có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch
tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn.
Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy trộn cơ học hay
máy trộn từ hoặc là quay chậm túi nhờ động cơ không lớn. Khi thẩm tích các protein
thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh.
Hình 1. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein
3.3. Khảo sát hoạt tính enzyme
Thực hiện 3 ống nghiệm theo như bảng sau:
Dung dịch
Dung dịch Hb 2% trong đệm
phosphate
Ống Tyrosin
(ml)
Ống mẫu
(ml)
Ống không
(ml)
2.5
2.5
2.5
Để yên ở 35,50C trong 5 phút
Acid Trichlororacetic 5%
5
0
5
Dung dịch HCl 0.2N
0
0.5
0.5
Dung dịch Tyrosine 1/400N
0.5
0
0
Dịch thơm có chứa enzyme
Bromeline
0
0.5
0
Lắc đều. Để yên ở 35o5C trong 10 phút
Dd Acid Trichlororacetic 5%
0
5
0
Dịch thơm có chứa Enzyme
0.5
0
0.5
Bộ môn Công nghệ sinh học
20
Bromeline
Lắc đều, để yên 10 phút ở 250C,
Lọc
Dịch lọc (ml)
2.5
2.5
NaOH 0.5N (ml)
5
Folin (ml)
1
2.5
Lắc đều, để yên 15 phút
Đo OD (λ=578 hoặc 660nm)
ODT =?
ODM=?
ODC=?
3.3 Kết quả
Hoạt tính enzyme Bromeline được biểu thị là số g Tyrosine sinh ra do sự thủy
phân Hb của enzym có trong 1 ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa Bromeline trong
1 phút.
Hoạt tính này đựơc tính theo công thức :
X = 450 ODM 1 X1 (UI/ ml).
OD T
10
X2
Với : X1: ml dung dịch Tyrosine chuẩn
X2: ml dung dịch chứa enzyme
OD T = OD T - ODC
OD M = ODM - ODC
(Tham khảo trang 63 Thực tập lớn sinh hóa – Lâm Thị Kim Châu)
4. BÁO CÁO
1. Nêu nguyên tắc khảo sát hoạt tính Bromeline dựa vào mật độ quang?
2. Giải thích các bước tiến hành thí nghiệm trong bài ?
3. Xây dựng công thức tính và giải thích ý nghĩa của các đơn vị ?
5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ
Theo yêu cầu chung môn học
Bộ môn Công nghệ sinh học
21
BÀI 3. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ANSSON
1. MỤC ĐÍCH
- Tách enzyme pepsin từ dạ dày heo.
- Xác định hoạt độ enzyme thô.
2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- H A CHẤT- MẪU VẬT
ảng 3.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành
(cho nhóm g m sinh viên
A. HÓA CHẤT
STT
TÊN HÓA CHẤT
QUY CÁCH
SL/ĐVT
1
HCl 0,5%
Lít
1
2
Acetone
Lít
1
3
NaCl 25%
Lít
1
4
Thuốc thử Folin
ml
100
5
TCA 5%
ml
200
Hemoglobin 2% trong HCl
ml
200
6
0.06N
7
Dung dịch chuẩn tyrosine
ml
50
8
Dd NaOH 0,5 N
ml
500
9
HCl 0,2N
ml
500
10
Vải lọc
m
1
11
Dạ dày heo (bò)
Kg
1
12
Sữa đặc ông thọ vỉ
Vỉ
1
13
Nước cất 2 lần
Lít
4
14
Giấy lọc
Hộp
1
15
Giấy nhôm
Quận
1
16
CaCl2 0,01M
ml
150
GHI CHÚ
HS mua
Cả lớp
B. DỤNG CỤ
STT
TÊN DỤNG CỤ
QUY CÁCH
1
Dao inox + thớt
Cái
1
2
Kéo
Cái
1
3
Tam giác 250 nút mài
cái
1
4
Ống đong 25ml
Cái
1
5
Cốc thủy tinh 100ml
Cái
2
6
Ống nghiệm Ф18
Cái
12
Bộ môn Công nghệ sinh học
SL/ĐVT
GHI CHÚ
Mượn trước 24h
1 tổ
22
7
Phễu thủy tinh
Cái
1
8
Pipet 1ml
Cái
1
9
Pipet 2ml
Cái
1
10
Pipet 5ml
Cái
1
11
Pipet 10ml
Cái
1
12
Giá ống nghiệm
Cái
1
13
Quả bóp cao su
Cái
1
14
Kẹp ống nghiệm
Cái
1
15
Bình tia
Cái
1
16
Đũa thuỷ tinh
Cái
1
17
Cốc thủy tinh 500ml
Cái
1
18
Cốc thủy tinh 1000ml
Cái
2
19
Bình định mức 100ml
Cái
1
20
Chậu thủy tinh
Cái
1
Cả lớp
Mượn trước 2 ngày
C.THIẾT BỊ
STT
TÊN THIẾT BỊ
QUY CÁCH
SL/ĐVT
1
Máy đo quang phổ
cái
2
2
Cân 2 số
cái
1
3
Tủ ấm
cái
1
4
Máy xay sinh tố có cối xay
thịt
cái
1
GHI CHÚ
Mượn trước 2 ngày
Tổ 9: Pha thuốc thử Folin: pha loãng 3 lần bằng nước.
Tổ 10: Dung dịch chuẩn Tyrosine 1mM: 181,19mg Tyrosine hòa tan / HCl 0,2N đủ
1 lít.
3. NỘI DUNG
3.1. Nguyên tắc:
Pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật do sự tự phân trong môi
trường acid loãng. Dung dịch sau tự phân có chứa pepsin dạng hòa tan và các thành
phần protein khác. Sự tinh sạch enzyme có thể thực hiện sau khi đã thu nhận đựơc chế
phẩm enzyme thô nhờ vào các tác nhân gây tủa.
Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.4.23.1) phân giải được
Hemoglobin thành Tyrosine và Tryptophane hòa tan trong TCA. Xác định hàm lượng
tryosine và triptophane nhờ vào thuốc thử Folin – Ciocalteu.
3.2. Thu nhận dung dịch enzyme
+ Chuẩn bị nguyên liệu:
Bộ môn Công nghệ sinh học
23
Dạ dày bò (hoặc heo) mới giết mổ, xử lý thô sau đó được bảo quản trong điều kiện
nhiệt độ thấp với sự có mặt chloroform 5%. Thời gian tối đa cho quá trình bảo quản là
48 giờ. Cân khối lượng niêm mạc m1 (g).
+ Tự phân enzyme:
Tách lớp niêm mạc thô từ dạ dày, xay nhỏ với máy xay sinh tố trong dung dịch
HCl 0.5% (tỉ lệ 1:2 theo khối lượng). Sau đó cho vào chậu thuỷ tinh lớn, đậy kín, để
yên ở nhiệt độ 40 – 420C trong bể ổn nhiệt với thời gian 24 - 28 giờ.
Tiến hành lọc dung dịch qua vải lọc (từ 2- 4 lần), loại bỏ tạp chất bằng cách lọc
qua bông. Thu được dung dịch có enzyme thô được dùng tiến hành thử hoạt tính.
+ Thu chế phẩm pepsin thô:
Tiến hành thu kết tủa pepsin bằng dung dịch muối NaCl 25% (hoặc dung môi
aceton lạnh) với tỷ lệ 1:4, cho từ từ dung dịch muối vào kết hợp với khuấy đảo liên tục
để tránh sinh nhiệt trong hỗn hợp. Thời gian từ 5 – 10 phút, nhiệt độ khoảng 50C.
Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000/phút trong 15 phút.
Với tác nhân tủa là muối trung tính cần qua thẩm tích để giải phóng bớt lượng
muối trong hỗn hợp. Sau đó tiến hành sấy khô bằng máy sấy không khí, nhiệt độ 30 –
400C khoảng 1 –2 giờ. Đối với tác nhân tủa là aceton thì để khô tự nhiên dưới quạt gió
từ 3-4 giờ. Cân khối lượng chế phẩm m2 (g).
Chế phẩm tự nhiên có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, vô định hình và có mùi
nước thịt, vị hơi chua. Người ta có thể thêm vào chế phẩm chất nền như tinh bột hay
dextrin để bảo quản. Điều kiện giữ chế phẩm cần khô, kín (trong lọ màu) và ở nhiệt độ
50C.
+ Hiệu suất chiết tách đựơc tính bằng công thức:
H
=
Khối lượng chế phẩm (m2) . 100%
Khối lượng niêm mạc thu nhận (m1)
(
3.3. Lập đƣờng chuẩn
Tyrosine
H
Lập 6 ống nghiệm theo tuần tự sau:
=
= (ml)
Tyrosine chuẩn 1mM
=
HCl 0,2 N (ml)
=
Ống
0
1
2
3
4
5
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
5
4,8
4,6
4,4
4,2
4
0,6
0,8
1
?
?
?
NaOH 0,5 N (ml)
10
= (ml)
Folin pha loãng 3 lần
3
Lượng tyrosine (mol )
0
0,2
0,4
Lắc mạnh sau 5-10 phút
OD660nm
0
?
?
(1mol =103mmol = 106mol)
Bộ môn Công nghệ sinh học
24
