Các phương pháp nghiên cứu gen bệnh ĐH KHTN Cao Học chú thích rõ ràng

NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI
1. Bệnh di truyền đơn gen (monogenic disorder)
Cystic fibrosis, thalassemia, hemophilia, Duchene dystrophy syndrome..
1 gen thay đổi là bệnh liền

2. Bệnh di truyền đa gen (polygenic disorder)
Cao huyết áp, bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson….

1


Bệnh di truyền đơn gen (monogenic disorder)
-Chỉ cần một thay đổi trên một gen gây ra triệu chứng bệnh
Cả 2 cặp allele mới gây bệnh

-Có thể ở dạng lặn hoặc trội.

Chỉ càn 1 bên là đc

-Gen có thể ở dạng tự dưỡng hoặc liên kết với giới tính
-OMIM: database về các bệnh di truyền ở người
-Đa số bệnh di truyền đơn gen thuộc loại bệnh hiếm gặp
-Nghiên cứu bệnh di truyền đơn gen là cơ sở để nghiên cứu bệnh di
truyền đa gen
2


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DI TRUYỂN
ĐƠN GEN Ở NGƯỜI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

1.Xác định vị trí gen trên bộ gen
2.Nghiên cứu gen bệnh in vitro

3.Nghiên cứu gen bệnh in vivo

3


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI
1. Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen

-Phương pháp độc lập bản đồ gen
-Phương pháp phụ thuộc bản đồ gen

4


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI
1. Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen

Phương pháp độc lập bản đồ gen
Các nguyên tắc

Dựa vào protein đã biết của bệnh
Dựa vào chức năng đã biết của bệnh
Dòng hóa loại trừ. Coi coi gen chịu trách nhiệm của bệnh đó là gì

Subtraction cloning

5

SUBTRACTION CLONING

DNA NGƯỜI BT

BẸNH

Cất nhỏ, trộn lẫn bằng ez cắt giới hạn
cắt cơ học
nhiều

biến tinh rồi hồi tính

DNA ng bt

-Phát hiện đột biến mất gen
-Số trường hợp phát hiện gen bệnh bằng subtraction cloning không lớn

6


SUBTRACTION CLONING ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN GÂY BỆNH DMD

-Bộ gen người bình thường được phân cắt với enzyme MboI để tạo thành các
Cắt thường xuyên hơn -> cắt thành nhiều đoạn nhỏ
đoạn nhỏ.
-Bộ gen người mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchene (với hàm lượng cao gấp 500 lần
hàm lượng bộ gen người bình thường) được phân nhỏ bằng lực cơ học
-Biến tính hai loại DNA bộ gen này và cho tái bắt cặp với nhau.

Chỉ cắt 1 chỗ, và tương thích đầu với Mbo1

-Nối các DNA vào vector được cắt trước bằng BamHI  chỉ có các DNA từ bộ gen
người bình thường không có bản sao trên DNA bộ gen bệnh được nối vào vector
 tập hợp các dòng DNA chứa vùng bị đột biến mất gen
-các bước kế tiếp là lai các dòng DNA này với người bệnh và người binh thường
để xác định vị trí trên bộ gen  xác định NST X là nơi chứa vùng gen đột biến 
phân lập được vùng DNA khoảng 200 kb và sử dụng các kỹ thuật đi bộ trên NST,
zoo blot để xác định gen

7


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI
1. Xác định vị trí gen bệnh trên bộ gen
khi không làm được phương pháp độc lập gen

Phương pháp phụ thuộc bản đồ gen

Phân tích phả
hệ

Sàng lọc
Markers liên
kết

Định vị gene

Định vị
Markers

là chỉ thị di truyền như gen biểu
hiện kiểu hình, VNTR, SNP...

8


Ý NGHĨA CỦA VIỆC LẬP BẢN ĐỒ GEN
1. Nghiên cứu cấu trúc và cách tổ chức bộ gen thông qua các thành phần nhiễm
sắc thể
2. Nghiên cứu sự tiến hóa của bộ gen
xem đoạn nào bảo tồn, biến động để biết sự tiến hóa giữa các loài

3. Nghiên cứu phát hiện gen gây bệnh ở người

?
*Định vị gen trên bộ gen
*Phân tích kiểu gen
*Phân tích kiểu hình gây bệnh

?
Gen
bệnh

?

9


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI

Các loại bản đồ gen: tập hợp các kỹ thuật sinh học nhằm cung cấp
các thông tin để xác định vi trí của gen trên bộ gen
Bản đồ di truyền tế bào
Bản đồ di truyền liên kết

xem gen nằm trên nst nào

xem liên kết bao nhiêu %, bao nhiêu cmorgan

Bản đồ vật l{
Trình tự nucleotide bộ gen người

10


QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU GEN BỆNH Ở NGƯỜI
Chức năng các loại bản đồ trong phát hiện gen bệnh:

Bản đồ di truyền tế bào: xác định NST chứa gen bệnh
các kỹ thuật cho phép biết được gen mục tiêu nằm trên NST nào, có ý nghĩa: xem NST đó có chỉ thị di truyền nào, có di truyền liên kết với bệnh hay không?

Bản đồ di truyền liên kết: xác định khoảng cách di truyền giữa
gen bệnh và các marker
như vậy mình biết được sự liên kết và khoảng cách giữa chỉ thị di truyền và gen mục tiêu, biết được khoảng cách là nhờ bản đồ vật lý.

Bản đồ vật l{: xác định vị trí vật l{ của gen bệnh trên bộ gen

11

CÁC LOẠI BẢN ĐỒ DI TRUYỀN TẾ BÀO
Trên tế bào

1. Xác định gen nằm trên NST
-Bản đồ lai sinh dưỡng (somatic cell hybridization)

2. So sánh các NST để tìm sự bất thường
-Nhuộm NST (Chromosome banding)
-Tô màu NST (Chromosome painting)
-Bản đồ CGH (Comparative Genomic Hybridization)
-Digital karyotyping

3. Xác định vị trí gen trên NST
-Lai tại chỗ huznh quang (FISH)
12


lai tế bào sinh dưỡng

SOMATIC CELL HYBRIDIZATION
tăng cường 2 tb hòa màng vào nhau

nguyên bào sợi người

HGPRT-

TK-

tạo tb lai, chứa nst của chuột và ng. NST ng bị mất đi 1 cách ngẫu
nhiên, còn chuột thì vẫn giữ lại nguyên vẹn.

Bổ sung sản phẩm cho tb sinh
trưởng

tb chuột bị loại enzyme TK
Không bổ sung nữa -> chỉ có tb lai mới sống

tb ng cũng bị loại HGPRT; cả 2 ez này chịu trách nhiệm
tổng hợp nên DNA cho tb sinh trưởng.

NST ng và ch phân biệt rất rõ ràng, -> phát hiện được NST còn sót lại là NST số mấy mà không bị lẫn với chuột

13


phải có tính chất gì đó đặc trưng để phát hiện, ví dụ gen tạo ánh sáng...

gen mục tiêu nằm trên NST số 4

14


BẢN ĐỒ DI TRUYỀN – BẢN ĐỒ LIÊN KẾT
Xác định khoảng cách di truyền giữa gen mục tiêu với các chỉ thị di truyền

15


NGUYÊN LÝ CỦA BẢN ĐỒ DI TRUYỀN LIÊN KẾT
-Được dùng để xác định khoảng cách giữa các gen trên NST.

-Sử dụng một chỉ thị di truyền với vị trí đã biết để xác định vị trí gen
quan tâm.
-Sử dụng tần số tái tổ hợp để tính khoảng cách giữa các gen: 1%
TTH = 1 cM
-Không cho biết vị trí chính xác (đến nucleotide) của gen đích trên
bộ gen

-Tần số TTH = số lượng cá thể con TTH/Tổng số cá thể con x 100
Nếu khoảng cách đủ xa thì sẽ xảy ra hiện tượng hoán vị or tái tổ hợp (tth là bố và mẹ không có kiểu hình đó).

16


NGUYÊN LÝ CỦA BẢN ĐỒ DI TRUYỀN LIÊN KẾT
Kỹ thuật thống kê
Cách tính tần số TTH khác nhau ở các loại sinh vật khoác nhau

Ở sinh vật bậc thấp đơn bội:
Phân tích trực tiếp các sản phẩm giảm phân  tính tần số TTH
giữa các gen/marker di truyền  khoảng cách di truyền giữa
chúng
Ở sinh vật bậc thấp nhị bội:
Sử dụng phép lai phân tích  tính tần số TTH giữa các gen/marker
di truyền  khoảng cách di truyền giữa chúng
Ở sinh vật bậc cao:
Sử dụng các phương pháp thống kê (lod score) tính tần số TTH
giữa các gen/marker di truyền  khoảng cách di truyền giữa
chúng
17

PHƯƠNG PHÁP TÍNH TẦN SỐ TTH Ở NGƯỜI
PHƯƠNG PHÁP LOD SCORE

cho phép tính tần số TTH ở ng mà không cần dùng lai phân tích ( ng thì sao mà lai phan tích được)

dễ bị sai số, do đó nhiều nhóm cùng công bố 1 kết quả thì mới tinh cậy cao hơn.

18
18


MỘT VÍ DỤ TÍNH LOD SCORE Ở NGƯỜI

kiểu hình không tái tổ hợp

-Kiểu hình TTH: 1 (R)  Tần số TTH: 0,125 ()
-Kiểu hình không TTH: 7 (NR)
-Vậy trị số lod score là: log10((1-0,125)7 x 0,1251)/0,58
= log10(12,566) = 1,099
-Lặp lại cách tính này với các trị số  khác nhau như
Tần số TTH
Lod score
0,05
0,951
0,10
1,088
0,125
1,099

0,15
1,090
0,20
1,031
0,25
0,932
-Chọn giá trị  cho trị số lod score cao nhất đó chính là 0,125 
khoảng cách giữa hai gen, tính bằng cM  12,5% = 12,5 cM
liên kết với nhóm máu. đã biết nằm trên 1 NST rồi, giờ xem xem chúng cách nhau cM

19


20


CÁC KIỂU BẢN ĐỒ VẬT LÝ
Là các kỹ thuật SHPT

1. Kỹ thuật lập bản đồ cắt giới hạn (Restriction map)
2. Kỹ thuật chromosome walking/jumping

21


TÌM VỊ TRÍ GEN ĐÍCH BẰNG KỸ THUẬT CHROMOSOME WALKING
Gen đích liên kết với 1 hay nhiều chỉ thị di truyền  khoảng cách giữa chúng
được xác định  từ vị trí của chỉ thị di truyền trên bộ gen để “đi bộ trên NST”
tới gen đích.
Tiến hành:

1.Lập thư viện bộ gen
2.Dùng chỉ thị di truyền làm mẫu dò  phát hiện dòng DNA trong thư viện bộ gen có
chứa trình tự nucleotide của chỉ thị di truyền  giải trình tự nucleotide hoặc phân tích
bằng enzyme cắt giới hạn dòng DNA này để tìm ra gen đích.
3.Nếu chưa tìm thấy gen đích trong dòng DNA đầu tiên  sử dụng một đoạn DNA
ngắn ở đầu 3’ của dòng DNA đầu tiên làm mẫu dò thứ hai  phát hiện dòng DNA
trong thư viện bộ gen có chứa trình tự nucleotide của mẫu dò thứ hai  giải trình tự
nucleotide hoặc phân tích bằng enzyme cắt giới hạn dòng DNA thứ hai này để tìm ra
gen đích.
4.Nếu vẫn chưa tìm ra gen đích trong dòng DNA thứ hai thì lặp lại các bước như trên
cho đến khi tìm ra gen đích.
22


KỸ THUẬT ĐI BỘ TRÊN NST – CHROMOSOME WALKING
Chỉ thị di truyền 1

Chỉ thị di truyền 2

Khi đi hết mình thu được trình tự của đoạn lai

23


XÁC ĐỊNH GEN TRONG VÙNG ĐI BỘ/NHẢY
Nhảy bằng cách đóng vòng nó lại, rồi phân tích tiếp theo Như vậy sẽ bỏ qua được 1 đoạn rất lớn mà không phải đi bộ từ từ.

1. Zooblot
Ở động vật bậc cao có những vùng vô cùng bảo tồn giữa các loài

2. Đảo CpG

3. Xác định các exon
Xem có phải là exon hay không

4. Phân tích các EST
EST là những đoạn DNA ngắn, đến từ các cDNA ở trong cơ thể người.

5. Phục hồi kiểu hình

6. In silico
24


LIÊN KẾT CÁC LOẠI BẢN ĐỒ: DI TRUYỀN TẾ BÀO + LIÊN KẾT + VẬT LÝ
TRONG XÁC ĐỊNH GEN BỆNH

Bản đồ di truyền tế bào

Xác định gen bệnh
thuộc NST nào

Gen bệnh

Bản đồ liên kết

Vị trí gen bệnh
trên bộ gen

Bản đồ vật l{

Khoảng cách gen bệnh và chỉ
thị di truyền trên NST

25