Khảo sát mức độ methyl hóa tại đảo cpg thuộc vùng promoter các GEN ABC và p16IN4α trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG
THUỘC VÙNG PROMOTER CÁC GEN APC VÀ p16INK4a
TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ
UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG
SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào
MSSV: 1153010160
Khóa:

2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG
THUỘC VÙNG PROMOTER CÁC GEN APC VÀ p16INK4a
TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ
UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

GVHD ký xác nhận

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào
MSSV: 1153010160
Khóa:

2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015


Khóa Luận Tốt Nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa Công Nghệ
Sinh Học, trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến
thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô Lê Huyền Ái Thúy và Cô
Trương Kim Phượng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài này.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm sinh
học phân tử đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều kiện
tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công
nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày càng gặt
hái được nhiều thành công trong công việc.
Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của
mình và thành công trong cuộc sống.
Xin chân thành cảm ơn.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Anh Đào
Tháng 5/2015

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang i


Khóa Luận Tốt Nghiệp
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii
PHẦN I. TỔNG QUAN ................................................................................................... 3
I.1. Tổng quan về ung thƣ ............................................................................................. 3
I.1.1. Khái niệm ung thƣ............................................................................................ 3
I.1.2. Các yếu tố nguy cơ .......................................................................................... 3
I.1.3. Phân loại ung thƣ ............................................................................................ 4
I.1.4. Ung thƣ cổ tử cung .......................................................................................... 4
I.1.5. Tình hình ung thƣ cổ tử cung trên thế giới ...................................................... 6

I.1.6. Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam ....................................................... 6
I.1.7. Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thƣ cổ tử cung .................................................... 7
I.2. Epigenetics ........................................................................................................... 10
I.2.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................ 10
I.3. Tổng quan về gen APC ......................................................................................... 12
I.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC .................................................... 12
I.3.2. Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC........ 14
I.4. Tổng quan về gen p16INK4a ................................................................................... 15
I.4.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen p16INK4a............................................... 15
I.4.2. Tình hình nghiên cứu về gen p16INK4a............................................................ 16
I.5. Các phƣơng pháp phân tích sự methyl hóa DNA................................................. 17
I.5.1. Phƣơng pháp MSP ......................................................................................... 17

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang ii


Khóa Luận Tốt Nghiệp
I.5.2. Phƣơng pháp Nested MSP ............................................................................. 19
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 20
II.1. Vật liệu ................................................................................................................ 20
II.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................... 20
II.2.1. Khai thác dữ liệu ........................................................................................... 20
II.2.2. Khảo sát in silico .......................................................................................... 20
II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ................................................................................... 21
PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................... 28
III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO GEN APC .................... 28
III.1.1. Kết quả khai thác dữ liệu ............................................................................. 28
III.1.2. Kết quả khảo sát in silico gen APC ............................................................. 34

III.1.2.1. Thu thập trình tự gen ................................................................................ 34
III.1.2.2. Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP........................................................ 35
III.1.3. Đánh giá các thông số vật lý của mồi.......................................................... 36
III.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU GEN p16INK4a......................................................... 42
III.2.1. Kết quả khai thác dữ liệu. ............................................................................ 42
III.2.2. Kết quả khảo sát in silico gen p16INK4a........................................................ 47
III.2.2.1. Thu thập trình tự gen ................................................................................ 47
III.2.2.2. Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP........................................................ 48
III.2.2.3. Đánh giá các thông số vật lý của mồi....................................................... 49
III.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ................................................ 54
III.3.1. Thực hiện phản ứng MSP trên gen APC và p16INK4a .................................. 54
III.3.2. Giải trình tự mẫu đại diện: .......................................................................... 60
SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang iii


Khóa Luận Tốt Nghiệp
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................... 62
IV.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 62
IV.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 64
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 79

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang iv


Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC

Adenoma carcinoma

APC

Adenomatous polyposis Coli

CDK

Cyclin Dependent Kinase

CIN

Cervical intraepithelial neoplasia

CIS

carcinoma in situ

CK1γ

casein kinase 1-γ

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNMT

DNA methyltransferases

FAP

Familial adenomatous polyposis

GSK3b

Glycogen synthase Kinase 3b

HPV

Human Papilloma virus

HSIL

High-grade Squamous Intraepithelial Lesions

LSIL

Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions

MF

Methylated forward primer

MR

Methylated revesre primer

MSP

Methylation-Specific PCR

NCBI

National Center for Biotechnology Information

p16INK4a

Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 4a

p53

tumor suppressor protein

PCR

Polymerase Chain Reaction

Rb

retinoblastoma

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang v

Khóa Luận Tốt Nghiệp
SAM

S-denosylmethionine

SCC

Squamous cell carcinoma

SIL

squamous intraepithelial lesion

Tm

Temperature melt

UF

Unmethylated forward primer

UR

Unmethylated revesre primer

UTCTC

Ung thƣ cổ tử cung

WHO

World Health Organization

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang vi


Khóa Luận Tốt Nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng II. 1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 25
Bảng III. 1.Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thƣ. .................................. 28
Bảng III. 2. Tần suất methyl hóa gen APC ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC và
phƣơng pháp xác định .................................................................................................... 33
Bảng III. 3. Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen APC ............................................ 36
Bảng III. 4 Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen APC.............................................. 37
Bảng III. 5. Tần xuất methyl hóa gen p16INK4a trong các loại ung thƣ ......................... 43
Bảng III. 6.Tần suất methyl hóa gen p16INK4a ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC
và phƣơng pháp xác định ............................................................................................... 46
Bảng III. 7. Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen p16INK4a ...................................... 48
Bảng III. 8. Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen p16INK4a ....................................... 50
Bảng III. 9. Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC .. 56
Bảng III. 10. Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen p16INK4a
........................................................................................................................................ 58
Bảng III. 11. Tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a trong trên bộ mẫu bệnh phẩm
nhiễm/không nhiễm HPV. .............................................................................................. 59

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang vii

Khóa Luận Tốt Nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình I. 1. Diễn tiến của quá trình sinh ung ..................................................................... 3
Hình I. 2. Các giai đoạn phát triển của UTCTC .............................................................. 5
Hình I. 3. Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở nữ giới trên thế giới ........................... 6
Hình I. 4. Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở nữ giới tại Việt Nam ............................ 7
Hình I. 5. Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 ................................................... 9
Hình I. 6. Các cơ chế epigenetic .................................................................................... 10
Hình I. 7. Các con đƣờng methyl hóa DNA .................................................................. 11
Hình I. 9. Vị trí gen APC (GeneCard)............................................................................ 12
Hình I. 8. Sự methyl hóa trong tế ào ình thƣờng và tế ào ung thƣ .......................... 12
Hình I. 10. Con đƣờng tín hiệu Wnt .............................................................................. 13
Hình I. 11. Vị trí gen p16INK4a(GeneCard) ..................................................................... 15
Hình I. 12. Vai trò của protein p16INK4a trong chu kỳ tế bào ......................................... 16
Hình I. 13. Cơ chế chuyển đổi nucleotide từ cytosine thành uracil nhờ vào xử lý với
sodium bisulfite .............................................................................................................. 18
Hình I. 14. Minh họa phƣơng pháp MSP ....................................................................... 18
Hình I. 15. Minh họa phƣơng pháp Nested MSP .......................................................... 19
Hình II. 1. Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite ..................................................................... 24
Hình II. 2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ................................................................. 26
Hình III. 1. Đồ thị mô tả tỉ lệ methyl hóa có trọng số trên vùng promoter gen APC
trong các loại ung thƣ ..................................................................................................... 30
Hình III. 2. Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa
trên trên vùng promoter gen APC .................................................................................. 31
Hình III. 3. Đồ thị mô tả các phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát
mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen APC.......................................................... 32
Hình III. 4. Định vị gen APC trên NST số 9 (NCBI) ..................................................... 35
Hình III. 5. Định vị đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (Methprimer)............. 35

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang viii


Khóa Luận Tốt Nghiệp
Hình III. 6. Kết quả Annhyb cặp mồi APC_MF – APC_MR trên vùng promoter của
gen APC.......................................................................................................................... 39
Hình III. 7. Kết quả Annhyb cặp mồi UR-UF trên vùng promoter của gen APC.......... 40
Hình III. 8. Cấu trúc vùng promoter gen APC ............................................................... 41
Hình III. 9. Vị trí nhận biết của một số nhân tố phiên mã trên đảo CpG của gen APC . 41
Hình III. 10. Đồ thị mô tả tỉ lệ methyl hóa có trọng số trên vùng promoter gen p16INK4a
trong các loại ung thƣ ..................................................................................................... 44
Hình III. 11. Đồ thị mô tả các phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát
mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen p16INK4a .................................................... 44
Hình III. 12. Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa
trên vùng promoter gen p16INK4 ..................................................................................... 45
Hình III. 13. Định vị gen p16INK4a trên NST số 9 (NCBI) ............................................. 47
Hình III. 14. Định vị đảo CpG trên vùng promoter của gen p16INK4a (Methprimer) ..... 48
Hình III. 15. Kết quả Annhyb cặp mồi MF-MR trên vùng promoter của gen p16INK4a . 51
Hình III. 16. Kết quả Annhyb cặp mồi UR-UF trên vùng promoter của gen p16INK4a. . 52
Hình III. 17. Cấu trúc vùng promoter gen p16INK4a........................................................ 53
Hình III. 18. Vị trí nhận biết của một số nhân tố phiên mã trên đảo CpG3 của gen
p16INK4a ........................................................................................................................... 53
Hình III. 19. Kết quả điện di sản phẩm MSP gen APC ở các mẫu CA của bệnh nhân
ung thƣ cổ tử cung .......................................................................................................... 55
Hình III. 20. Kết quả điện di sản phẩm MSP gen p16INK4a ở các mẫu CP của bệnh nhân
ung thƣ cổ tử cung .......................................................................................................... 57
Hình III. 21. Kết quả giải trình tự mẫu CP10 với cặp mồi p16-MF, p16-MR ............... 60

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang ix


Khoá Luận Tốt Nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, World Health Organization)
ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ phổ biến thứ hai gây tử vong ở phụ nữ trên toàn thế
giới (WHO, 2006). Năm 2012, có khoảng 530.000 ca mắc ung thƣ cổ tử cung và có
khoảng 260.000 ca tử vong do ung thƣ cổ tử cung (WHO, 2012). Ở Việt Nam, giai
đoạn 2007-2008, tần suất mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở miền Bắc và miền Nam là
7,7/100.000 ngƣời và 26,8/100.000 ngƣời [103].
Các công bố khoa học ghi nhận tính chất methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng
promoter các gen đè nén u là dấu chứng sinh học tiềm năng trong việc tiên lƣợng, chẩn
đoán các ệnh ung thƣ, điển hình là bệnh ung thƣ cổ tử cung (Guo et al., 2012).
Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) thuộc nhóm gen đè nén u, mã hóa cho
protein APC có vai trò ức chế đƣờng truyền tín hiệu Wnt thông qua phosphoryl hóa βcatein, kiểm soát sự phát triển và phân chia của tế bào (Dimberg et al., 2013). Sự
methyl hóa vƣợt mức trên vùng đảo CpG thuộc promoter gen APC đến bất hoạt chức
năng đè nén u của protein APC, hệ quả là khởi phát và diễn tiến quá trình sinh u
(Hammoud et al., 2013). Công trình nghiên cứu của Reesink-Peters và cộng sự (2004)
ghi nhận tính chất methyl hóa bất thƣờng trên gen APC trong các mẫu vệt cạo cổ tử
cung của các bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung là 54%.
Gen p16INK4a (cyclin-dependent kinase inhibitor 4a) thuộc nhóm gen đè nén u,
nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9p21.3), có kích thƣớc là 26.739bp (GenBank). Sự methyl
hóa vƣợt mức gen p16INK4a dẫn đến bất hoạt chức năng đè nén u của protein p16INK4a, hệ
quả là tế bào tăng sinh không kiểm soát đƣợc và hình thành khối u (Szalmás et al.,
2009). Công trình nghiên cứu của Attalebvà cộng sự (2009) ghi nhận tính chất methyl

hóa bất thƣờng trên gen p16INK4aở các mẫu mô tƣơi của bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung là
59,1%.

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 1


Khoá Luận Tốt Nghiệp
Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này có rất ít công trình nghiên cứu về mức độ
methyl hóa trên vùng promoter của gen APC, p16INK4 trong ung thƣ cổ tử cung. Do
vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Khảo sát mức độ methyl
hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter các gen APC, p16INK4a trên nhóm bệnh
nhân có nguy cơ ung thƣ cổ tử cung”
Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter gen APC,
p16INK4 liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính
chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Thu thập dữ liệu về tính chất methyl hóa vƣợt mức trên gen APC, p16INK4a và
mối tƣơng quan với các loại ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ cổ tử cung.
- Thu thập bộ mồi cho phản ứng Methylation- specific PCR nhằm khảo sát mức
độ methyl hóa vùng promoter gen APC, p16INK4a ở các mẫu bệnh phẩm (mẫu sinh thiết
mô, mẫu máu…) của bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung trong thực nghiệm, để hƣớng đến
mục tiêu tìm ra dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đoán, tiên lƣợng bệnh ung thƣ
cổ tử cung.
- Thực hiện quy trình MSP, Nested MSP xác định tính chất methyl hóa ở gen
APC, p16INK4a trên bộ mẫu bệnh phẩm nhiễm hoặc không nhiễm HPV ở Việt Nam.

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 2


Khoá Luận Tốt Nghiệp
PHẦN I. TỔNG QUAN
I.1. Tổng quan về ung thƣ
I.1.1. Khái niệm ung thƣ
Ung thƣ là một thuật ngữ chung mô tả các dạng bệnh lý phản ánh những sự thay
đổi về sinh sản, tăng trƣởng và chức năng của tế bào, có thể ảnh hƣởng đến bất kì phần
nào của cơ thể, (WHO, World Health Organization). Ung thƣ khởi phát từ một tế bào
ình thƣờng bị biến đổi qua nhiều giai đoạn, điển hình là sự tổn thƣơng tiền ung thƣ và
hình thành, diễn tiến tạo các khối u. Các tế bào phân chia và phát triển không kiểm soát
đƣợc, hình thành các khối u ác tính, có thể di chuyển và xâm lấn các mô ở gần (xâm
lấn cục bộ) hay ở xa (di căn) qua hệ thống bạch huyết hay mạch máu. Đối với các bệnh
ung thƣ, sự di căn là nguyên nhân dẫn đến tử vong [115].

Hình I. 1. Diễn tiến của quá trình sinh ung [83]
I.1.2. Các yếu tố nguy cơ [115]
Các biến đổi trong ung thƣ là kết quả của sự tƣơng tác giữa các yếu tố di truyền
của một ngƣời và các tác nhân bên ngoài, bao gồm:
 Tác nhân vật lý: tia cực tím và ức xạ ion hóa.

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 3


Khoá Luận Tốt Nghiệp
 Tác nhân hóa học: amiăng, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây
nhiễm ẩn thực phẩm) và thạch tín (chất gây nhiễm ẩn nƣớc uống).

 Tác nhân sinh học: sự nhiễm trùng một số virus, vi khuẩn hay ký sinh trùng.
I.1.3. Phân loại ung thƣ [116]
 Ung thƣ iểu mô (carcinoma): ung thƣ khởi phát trong da hoặc trong các mô lót
hay phủ các cơ quan bên trong.
 Ung thƣ mô liên kết (sarcoma): ung thƣ khởi phát trong xƣơng, sụn, mỡ, cơ,
mạch máu hay các mô liên kết khác.
 Bệnh ạch cầu, “ ệnh máu trắng” (leukemia): ung thƣ khởi phát trong mô tạo
máu nhƣ tủy xƣơng và sản xuất ra một số lƣợng lớn các tế bào máu ất thƣờng
tiến vào dòng máu.
 U lympho bào, u tủy (lyphoma, myeloma): ung thƣ khởi phát trong các tế bào
của hệ thống miễn dịch.
 Ung thƣ hệ thần kinh trung ƣơng: ung thƣ khởi phát trong các mô não và tủy
sống.
I.1.4. Ung thƣ cổ tử cung [109]
Ung thƣ cổ tử cung là ung thƣ ác tính, hình thành trong các mô cổ tử cung (cơ
quan kết nối tử cung và âm đạo). Tiến trình hình thành và diễn tiến ung thƣ cổ tử cung
trải qua một khoảng thời gian dài, các tế bào biểu mô cổ tử cung bị biến đổi, chuyển từ
trạng thái tiền sinh ung trở thành ung thƣ. Các dạng biến đổi gồm có: tân sinh trong
biểu mô cổ tử cung (cervical intraepithelial neoplasia, CIN), tổn thƣơng iểu mô vảy
(squamous intraepithelial lesion, SIL) [114].
Các loại ung thƣ cổ tử cung: ung thƣ tế bào biểu mô vảy (Squamous cell
carcinoma) và ung thƣ mô tuyến (Adeno carcinoma) [111]. Ung thƣ iểu mô tế bào vảy
phổ biến nhất, chiếm khoảng 80- 85% trong tất cả các loại ung thƣ cổ tử cung [109].

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 4


Khoá Luận Tốt Nghiệp

 Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung
- Giai đoạn 0 (tiền ung thƣ):
Trong giai đoạn này, sự biến đổi sinh học bất thƣờng diễn ra (loạn sản) ở các lớp
tế bào lót cổ tử cung, giai đoạn này đƣợc gọi là CIN. Dựa vào phƣơng pháp quan sát
dƣới kính hiển vi, CIN đƣợc chia thành các cấp độ:
 CIN1: chứng loạn sản nhẹ biểu hiện có ít tế bào/mô bất thƣờng.
 CIN2: chứng loạn sản trung bình, biểu hiện có nhiều tế bào/mô bất
thƣờng hơn.
 CIN3: chứng loạn sản nặng, là tiền ung thƣ nghiêm trọng nhất, biểu hiện
hầu hết tế bào/mô bất thƣờng.
- Giai đoạn 1: ung thƣ phát triển bên trong cổ tử cung nhƣng chƣa xâm lấn sang
các cơ quan khác.
- Giai đoạn 2: các tế bào ung thƣ di chuyển ra ngoài cổ tử cung, xâm nhập vào
các mô xung quanh nhƣng không lan sang các mô dọc theo xƣơng chậu hoặc phần dƣới
của âm đạo.
- Giai đoạn 3: các tế ào ung thƣ di chuyển, xâm nhập vào phần dƣới của âm đạo
và/hoặc các mô dọc theo xƣơng chậu.
- Giai đoạn 4: các tế ào ung thƣ đã di căn đến các cơ quan khác, di chuyển và
xâm nhập vào hệ ruột, bàng quang hoặc các cơ quan khác (phổi, gan).

Hình I. 2. Các giai đoạn phát triển của UTCTC [106]
SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 5


Khoá Luận Tốt Nghiệp
I.1.5. Tình hình ung thƣ cổ tử cung trên thế giới
Theo số liệu thống kê của Globocan 2012, ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ phổ
biến thứ tƣ ở phụ nữ trên toàn thế giới, ƣớc tính có khoảng 528.000 trƣờng hợp mới

mắc bệnh và 266.000 trƣờng hợp tử vong do ung thƣ cổ tử cung, chiếm 7,5% số ca tử
vong do ung thƣ ở phụ nữ. Trong đó, khoảng 87% trƣờng hợp tử vong do ung thƣ cổ tử
cung xảy ra ở các khu vực chƣa phát triển [105].

Hình I. 3. Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở nữ giới trên thế giới
(Globocan, 2012) [105]
I.1.6. Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam
Theo Globocan 2012, ở Việt Nam ung thƣ cổ tử cung là một trong năm loại ung
thƣ phổ iến ở phụ nữ: vú, phổi, gan, cổ tử cung, dạ dày. Ƣớc tính có khoảng 5.146
trƣờng hợp mắc ung thƣ cổ tử cung, chiếm khoảng 9,4% trong tất cả các loại ung thƣ ở
phụ nữ [113].

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 6


Khoá Luận Tốt Nghiệp

Hình I. 4. Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở nữ giới tại Việt Nam
(Globocan, 2012) [105]
Ở miền Bắc Việt nam, tỷ lệ mắc ung thƣ cổ tử cung là 7,7/100.000 ngƣời, đứng
hàng thứ ba và chiếm 6% trong các loại ung thƣ ở nữ giới sau ung thƣ vú và dạ dày. Ở
miền Nam, tỷ lệ này lên tới 26,8/100.000 ngƣời, đứng đầu và chiếm hơn 20% các ung
thƣ ở nữ [103].
I.1.7. Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thƣ cổ tử cung
I.2.4.1. Hút thuốc lá
Hút thuốc gắn liền với sự phát triển các tổn thƣơng tiền ung thƣ cũng nhƣ
UTCTC. Những chất có hại trong khói thuốc lá đƣợc hấp thu qua phổi và theo máu đi
khắp cơ thể (Szarewski et al., 1998).

Phụ nữ hút thuốc lá có nguy cơ ị ung thƣ cổ tử cung gấp ít nhất 2 lần so với phụ
nữ không hút thuốc (Szarewski et al., 1998). Các sản phẩm phụ của thuốc lá đã đƣợc
tìm thấy trong dịch chất nhày cổ tử cung của các phụ nữ hút thuốc. Các nhà nghiên cứu
ghi nhận rằng các thành phần trong khói thuốc lá làm suy giảm hệ miễn dịch, gây tổn
hại đến DNA bộ gen và góp phần vào sự phát triển của ung thƣ cổ tử cung [112].
I.2.4.2. Mang thai nhiều lần và sử dụng thuốc tránh thai
Phụ nữ đã a, ốn lần sinh con lần lƣợt có nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung cao
gấp 2,6 lần, 3,8 lần so với các phụ nữ chƣa sinh con (Muñoz et al., 2002).

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 7


Khoá Luận Tốt Nghiệp
Hơn nữa, việc sử dụng lâu dài thuốc tránh thai cũng là yếu tố làm tăng nguy cơ
UTCTC ở phụ nữ, có thể tăng gấp ốn lần so với phụ nữ không sử dụng thuốc tránh
thai (Moreno et al., 2002).
I.2.4.3. Virus HPV
HPV là virus gây u nhú ở ngƣời, lan truyền chủ yếu thông qua đƣờng tình dục và
có phạm vi hoạt động rộng (Colón-Lópezet al., 2010). Sự xâm nhiễm mãn tính của
HPV là yếu tố chính gây ra ung thƣ cổ tử cung (Castellsague, 2008). Có hơn 100 type
HPV khác nhau, trong đó, khoảng 40 type HPV xâm nhiễm, tác động đến cơ quan sinh
dục. Các type HPV đƣợc phân loại thành 2 nhóm dựa trên mức độ nguy cơ gây ung
thƣ: (1) nhóm nguy cơ cao (có khả năng tích hợp DNA vào bộ gen của tế ào ngƣời,
làm rối loạn sinh sản ác tính, tạo ra ung thƣ) là HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 68, 82, (2) nhóm nguy cơ thấp (bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ,
thƣờng chỉ gây ra các u lành biểu mô: u nhú gai, mụn cóc...) là HPV 6, 11, 40, 42, 43,
44, 54, 61, 72, 73, 81 (Trung et al., 2008). Nhiễm HPV type 16, HPV type 18 gây ra
khoảng 70% trong tất cả các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung (Munoz et al., 2003). HPV

type 16 thƣờng đƣợc tìm thấy trong ung thƣ iểu mô tế bào vảy và HPV type 18
thƣờng đƣợc tìm thấy trong ung thƣ tuyến (Altekruse et al., 2003).
 Cơ chế gây ung thƣ của HPV
Sau khi xâm nhập vào tế bào, các oncogen E6, E7 của virus HPV thuộc type nguy
cơ cao (đặc biệt là HPV 16, 18) gắn chèn vào bộ gen tế bào chủ và biểu hiện dựa vào
bộ máy phiên mã, dịch mã của tế bào chủ. Oncoprotein E6, E7 ức chế hoạt động đè nén
u và kiểm soát sự phân bào của protein p53 (tumor suppressor protein) và Rb
(retinoblastoma) dẫn đến hình thành khối u (Wong et al., 2005). Đây là sự tƣơng tác
giữa các oncogen và gen ức chế khối u dẫn đến rối loạn chức năng sinh lý của các tế
bào: loạn sản, sinh u (Wong et al., 2005).

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 8


Khoá Luận Tốt Nghiệp
Protein E6 kiềm hãm hoạt động của protein ức chế khối u p53 theo con đƣờng
hình thành phức hợp E6-p53 và enzyme ubiquitin hóa tế bào E6-AP (E6-associate
protein) (Crook et al., 1991) làm suy thoái và phân hủy p53, p53 mất chức năng kiểm
soát chu trình tế bào (tham gia điều khiển điểm dừng “Check point” tại pha G1), sự
chết theo chƣơng trình (apoptosis) cũng nhƣ cơ chế sửa chữa DNA.Vì vậy, các tế bào
tăng sinh một cách bất thƣờng và hình thành khối u (Wong et al., 2005).
Protein E7 liên kết với protein Rb dẫn đến phá vỡ liên kết giữa protein Rb với yếu
tố phiên mã E2F. Khi đó E2F ở trạng thái tự do, tham gia vào cơ chế hoạt hóa quá trình
phiên mã các gen điều hòa hoặc có chức năng cho chu trình tế bào chuyển từ pha G1
sang pha S, kích hoạt sự sao chép và phân chia của tế bào (Chellappan et al., 1992).

Hình I. 5. Cơ chế hoạt động của oncoprotein E6 và E7 [93]

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 9


Khoá Luận Tốt Nghiệp
I.2. Epigenetics
Epigenetics là sự thay đổi di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến thay
đổi trong trình tự DNA. Epigenetics đƣợc di truyền một cách ổn định từ thế hệ này
sang thế hệ khác (Berger et al., 2009). Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, biến
đổi histone và các RNA không mã hóa (Brooks et al., 2009). Công trình nghiên cứu
của Paredes và cộng sự (2011) ghi nhận epigenetics có vai trò quan trọng trong sự hình
thành và diễn tiến của ung thƣ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tập trung vào hiện
tƣợng methyl hóa DNA.

Hình I. 6. Các cơ chế epigenetics [59]
I.2.1. Methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA là quá trình chuyển nhóm CH3 từ S-adenyl methionine (SAM)
vào car on 5’ của cytosine đứng trƣớc guanines (CpG) tạo thành 5-methylcytosine
(Moore et al., 2012). Methyl hóa DNA đƣợc thực hiện bởi họ enzyme DNA
methyltransferases (DNMTs): DNMT1, DNMT3a, DNMT3 . Trong đó, DNMT1 là
enzyme có trong động vật hữu nhũ có vai trò duy trì sự methyl hóa DNA còn
DNMT3a, DNMT3b có vai trò tạo ra các gốc methyl mới hay de novo methylation
(Baylin, 2005; Delpu et al., 2013).

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 10

Khoá Luận Tốt Nghiệp

Hình I. 7. Các con đƣờng methyl hóa DNA [62]
Trong DNA của động vật có vú, 5-methylcytosine đƣợc tìm thấy trong khoảng
4% DNA của bộ gen, chủ yếu tập trung tại các đảo CpGs (Baylin, 2005).
Trong tế ào ình thƣờng, sự methyl hóa DNA có vai trò điều hòa sự biểu hiện
gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X (Herman et al., 2003). Bên cạnh đó, sự methyl hóa DNA
giúp im lặng sự biểu hiện các gen của các tác nhân gây bệnh (Jaenisch et al., 2003).
Sự biến đổi chức năng của các enzym DNMTs dẫn đến sự methyl hóa DNA bất
thƣờng: sự methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) hoặc giải methyl hóa
(hypomethylation) DNA (Laird, 2005). Giải methyl hóa là cơ chế biến đổi epigenetics
đƣợc tìm thấy đầu tiên trong mô ung thƣ ở ngƣời (Feinberg et al., 1983). Giải methyl
hóa có thể dẫn đến sự rối loạn biểu hiện gen, kích hoạt các yếu tố chuyển vị hoặc mất
đi sự in dấu gen (Esteller, 2008). Methyl hóa vƣợt mức trong vùng promoter có thể
“khóa” trực tiếp các vị trí liên kết của các yếu tố phiên mã, dẫn đến im lặng sự biểu
hiện gen (Robert et al., 2002; Nosho et al., 2009).

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 11


Khoá Luận Tốt Nghiệp

Hình I. 8. ự methyl hóa trong tế ào lành và tế ào ung thƣ [8]
 Đảo CpG
Đảo CpG là các đoạn DNA giàu CpG, có kích thƣớc khoảng 200-1000 nucleotide
(Bird et al, 1985). CpG là cặp dinucleotide đƣợc hình thành bởi cytosine tạo liên kết
phosphodiester với guanine (Millis, 2011).Trong bộ gen ngƣời, khoảng 60% vùng
promoter có chứa đảo CpG, tập trung tại các vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã

(Guo et al., 2012).

I.3. Tổng quan về gen APC
I.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC
Gen APC (Adenomatous polyposis coli) nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22),
định vị ở nucleotide 112.707.505 đến 112.846.239. Gen APC có kích thƣớc là 138.734
bp (GenBank).

Hình I. 9. Vị trí gen APC (GeneCard)

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 12


Khoá Luận Tốt Nghiệp
Gen APC là gen ức chế khối u đƣợc Kinzler và cộng sự, Nishisho và cộng sự phát
hiện năm 1991. Gen APC có mối liên quan đến bệnh u tuyến polyp mang tính chất di
truyền FAP (familial adenomatous polyposis), là một dạng rối loạn di truyền đặc trƣng
cho ung thƣ đại trực tràng. Gen APC mã hóa protein APC (300 kDa), là chất đối kháng
của đƣờng truyền tín hiệu Wnt/β-catein (Chen et al., 2005).
Con đƣờng tín hiệu Wnt/β-catein đóng vai trò trong cơ chế kích hoạt sự tăng sinh
và phát triển của tế bào, thông qua hoạt động của β-catein kích thích quá trình phiên
mã của gen (Clevers et al., 2012). Khi có tín hiệu Wnt, β-catein sẽ di chuyển vào trong
nhân, kết hợp với nhân tố phiên mã TCF (T cell factor) để kích hoạt sự phiên mã các
gen có vai trò trong chu trình tế bào (Clevers H., 2006). Con đƣờng truyền tín hiệu Wnt
diễn ra liên tục sẽ dẫn đến tế ào tăng sinh không kiểm soát, gây ra nhiều loại loại ung
thƣ ở ngƣời nhƣ: đại trực tràng, gan, cổ tử cung, buồng trứng (Behrenset al., 1996).
Protein APC có vai trò “gác cổng” cho tế bào, ức chế hoạt động của β-catein
trong chu trình tế bào, kiểm soát sự tăng sinh của tế bào (Kim et al., 2007). Protein

APC hoạt động thông qua sự tƣơng tác với các protein Axin, GSK3b (Glycogen
synthase Kinase 3 ), CK1γ (casein kinase I-γ) tạo phức hợp gây phosphryl hóa βcatein, dẫn đến sự thoái biến β-catein trong proteasome. Khi vắng mặt β-catein, các
Groucho sẽ gắn kết với nhân tố phiên mã TCF, ức chế sự phiên mã của các gen mục
tiêu của tín hiệu Wnt (Clevers H., 2006).

Hình I. 10. Con đƣờng tín hiệu Wnt [20]
SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 13


Khoá Luận Tốt Nghiệp
I.3.2. Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen
APC
Các công bố điển hình của Esteller và cộng sự (2000), Clément và cộng sự
(2004) ghi nhận rằng sự methyl hóa vƣợt mức trên vùng promoter của gen APC có liên
quan đến nhiều loại ung thƣ phổ biến ở ngƣời nhƣ: đại trực tràng, dạ dày , gan ,tuyến
tụy. Công trình nghiên cứu của Kawakami và cộng sự (2000) ghi nhận tính chất methyl
hóa trên gen APC xảy ra trong quá trình hình thành và phát triển của ung thƣ vòm
họng.
Năm 2001, Virmani và cộng sự xác định mức độ methyl hóa trên vùng promoter
của gen APC là 44% đối với các mẫu mô trữ lạnh của bệnh nhân ung thƣ vú, 53% đối
với các mẫu mô trữ lạnh của bệnh nhân ung thƣ phổi. Nhóm tác giả ghi nhận rằng
methyl hóa bất thƣờng trên vùng promoter của gen APC có liên quan đến một vài loại
ung thƣ ở ngƣời (đại trực tràng, dạ dày).
Công trình nghiên cứu của Henrique và cộng sự (2007) xác định sự methyl hóa
trên vùng promoter của gen APC là dấu chứng sinh học tiềm năng để chẩn đoán ung
thƣ đại trực tràng.
Công trình nghiên cứu của Lof-Ohlin và cộng sự (2011) chứng minh tính chất
methyl hóa bất thƣờng trên vùng promoter của gen APC là dấu chứng sinh học cho

việc tiên lƣợng nguy cơ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung.
Một nghiên cứu của Eissa và cộng sự (2011) xác định methyl hóa trên gen APC là
dấu chứng sinh học để chẩn đoán và phát hiện sớm ung thƣ àng quang.

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

Trang 14