Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI

ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH VÀ SAU SINH
BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS. TS. Đặng Thị Thu
2. BS. Ngô Diễm Ngọc

Hà Nội - 2011


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Giáo sư Tiến sỹ Đặng Thị Thu và
Thạc sỹ Bác sỹ Ngô Diễm Ngọc, những người thầy đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ,
động viên tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa
Hà Nội, các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, các cán bộ, nhân viên Viện Đào tạo
Sau đại học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dành cho tôi sự động viên và hỗ
trợ vô cùng quý báu trong quá trình học tập và làm luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi trung
ương, Khoa Nội Tiết- Chuyển hoá- Di truyền và các phòng ban chức năng Bệnh

viện Nhi trung ương đã cổ vũ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các đồng nghiệp khoa Di truyền và
Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các bệnh nhi và các gia đình bệnh nhi, những
người đã góp phần lớn nhất cho sự thành công trong đề tài của tôi.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn sự chăm sóc, động viên của cha mẹ, chồng
con, sự quan tâm giúp đỡ và những tình cảm quý báu của người thân, bạn bè đã
dành cho tôi.

Nguyễn Thị Phương Mai


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Nguyễn Thị Phương Mai


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACTH

Adrenocorticotropic hormone

CRH

Corticotropin- releasing hormone

DNA

Desoxyribonucleic acid

DNAts

DNA tổng số

DHEA

Dehydroepiandrosteron

DOC

Deoxycorticosteron

FSH

Follicule stimulating hormone

GC

Glucocorticoid

MC

Mineralocorticoid

MM

Mất muối

NHĐT

Nam hoá đơn thuần

NST

Nhiễm sắc thể

NTCHDT

Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền

PCR

Polymerase chain reaction

TSTTBS

Tăng sản thượng thận bẩm sinh

TT

Thượng thận

11β-OH

11β- hydroxylase

17-OHP

17- hydroxycorticosteroid

21-OH

21- hydrozyprogesteron

8bpEx3

8 base pairs exon 3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. Lịch sử nghiên cứu...............................................................................................3
1.1.1. Thế giới .........................................................................................................3
1.1.2. Việt Nam .......................................................................................................4
1.2. Tuyến TT và hormone vỏ TT...............................................................................6
1.2.1. Bào thai học...................................................................................................6
1.2.2. Cấu tạo của tuyến TT ....................................................................................6
1.2.3. Cấu tạo vỏ thượng thận .................................................................................6
1.2.4. Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT ............................................................7
1.2.5. Tác dụng của các hormone vỏ TT.................................................................8
1.2.5.1. Tác dụng của cortisol .............................................................................8
1.2.5.2. Tác dụng aldosteron ...............................................................................8
1.2.3.3. Tác dụng của hormone sinh dục nam androgen.....................................9
1.3. Các enzym tham gia vào sự tổng hợp corticoid.................................................10
1.4. Hội chứng TSTTBS ...........................................................................................11

1.4.1. TSTTBS do thiếu hụt enzym 21 hydroxylase.............................................12
1.4.1.1. Sinh bệnh học.......................................................................................12
1.4.1.2. Biểu hiện lâm sàng ..............................................................................12
1.4.2. TSTTBS do thiếu các enzym khác..............................................................13
1.4.2.1. TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase ................................13
1.4.2.2. TSTTBS do thiếu enzym 17α- hydroxylase (17- OH).........................14
1.4.2.3. TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase.......14
1.4.2.4. TSTTBS do thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase ..................................14
1.4.2.5. TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase ................................14
1.5. Cơ sở di truyền trong TSTTBS do thiếu hụt 21- OH.........................................15
1.6. Những tiến bộ trong chẩn đoán..........................................................................16


1.7. Chẩn đoán và điều trị trước sinh ........................................................................17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................19
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................19
2.2. Hoá chất sử dụng................................................................................................19
2.3. Trang thiết bị ......................................................................................................19
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................20
2.1.1. Quy trình tách chiết DNA ...........................................................................20
2.4.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi ...........................................20
2.4.1.2. Tách chiết DNA tổng số từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy ............20
2.4.1.3. Xác định nồng độ DNA tổng số..........................................................21
2.4.2. Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gen CYP21A2.....21
2.4.2.1. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến PRO 30 LEU (Exon 1) ....................22
2.4.2.2. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide (Exon 3)...............22
2.4.2.3. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến ILE172ASP (Exon 4) ......................23
2.4.2.4. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên exon 6 (Exon 6 Cluster) ...24
2.4.2.5. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L (Exon 7) ..............................24
2.4.3. Phương pháp điện di trên Agarose..............................................................25

2.4.4. Phương pháp Multiplex Ligation- dependent probe amplification.............26
2.4.5. Phương pháp giải trình tự gen.....................................................................28
2.4.5.1. Phản ứng PCR khuếch đại gen CYP21A2: ..........................................28
2.4.5.2. Tinh sạch sản phẩm PCR .....................................................................30
2.4.5.3. PCR mồi đơn........................................................................................30
2.4.5.4. Kết tủa cồn ...........................................................................................32
2.4.5.5. Phân tích trình tự gen ...........................................................................32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................33
3.1. Lựa chọn phương pháp SHPT phát hiện các đột biến trên gen CYP21A2.........33
3.1.1. Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến điểm...............................................33
3.1.1.1. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L (Exon 1).................................34
3.1.1.2. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide ..............................35


3.1.1.3. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N (Exon 4) ...............................36
3.1.1.4. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên exon 6...............................37
3.1.1.5. Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L .............................................39
3.1.3. Phương pháp Multiplex Ligation- dependent Probes amplification...........40
3.1.4. Phương pháp giải trình tự gen.....................................................................44
3.2. Chẩn đoán sau sinh và trước sinh cho bệnh TSTTBS .......................................46
3.2.1. Nghiên cứu quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS...........................46
3.2.2. Nghiên cứu quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS........................50
3.2.2.1. Gia đình 1.............................................................................................50
3.2.2.2. Gia đình 2.............................................................................................51
KẾT LUẬN ...............................................................................................................54
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tên các enzym và tên gen tương ứng .......................................................10
Bảng 3.1. Độ lớn và vị trí các probes trong phản ứng MLPA ..................................40
Bảng 3.2. Thứ tự các peak sau khi được phân tích bằng phần mềm Coffalyser.......42
Bảng 3.3. Tỷ lệ tín hiệu với các dạng đột biến .........................................................43
Bảng 3.4. Đột biến được tìm thấy trên các gia đình TSTTBS ..................................47
Bảng 3.5. Tỷ lệ các kiểu đột biến trên gen CYP21A2...............................................48
Bảng 3.6. So sánh tỷ lệ các đột biến với các nghiên cứu trên thế giới .....................49


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí tuyến TT và cấu tạo vỏ TT ................................................................6
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT ..........................................................7
Hình 1.3. Sinh tổng hợp hormone vỏ thượng thận....................................................11
Hình 1.4. Vị trí gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6.............................................15
Hình 1.5. Các đột biến thường gặp có liên quan đến kiểu hình................................16
Hình 2.1. Trình tự mẫu dò MLPA.............................................................................26
Hình 2.2. Sơ đồ vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 .............................................................27
Hình 2.3. Lai các đầu dò ...........................................................................................27
Hình 2.4. Ghép nối các đầu dò..................................................................................27
Hình 2.5. Khuếch đại ................................................................................................28
Hình 2.6. Phương pháp giải trình tự gen CYP21A2 ..................................................28
Hình 3.1. Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L. ..................................34
Hình 3.2. Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến mất 8 nucleotide. ................35
Hình 3.3. Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N..................................36
Hình 3.4. Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm trên Exon 6 .................38
Hình 3.5. Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L.................................39
Hình 3.6. Kết quả MLPA của mẫu không mang đột biến.........................................42
Hình 3.7. Điện đi đồ sản phẩm PCR 1 trên agarose 1% ...........................................44

Hình 3.8. Điện đi đồ sản phẩm PCR 2 trên agarose 1% ...........................................45
Hình 3.9. Quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS............................................49
Hình 3.10. Kết quả MLPA sàng lọc các đột biến thường gặp của thai nhi ..............51
Hình 3.11. Trình tự vùng promotor của gen giả CYP21A2.......................................51
Hình 3.12. Kết quả MLPA sàng lọc các đột biến thường gặp của thai nhi ..............52
Hình 3.13. Thai nhi Dị hợp tử đột biến P30L, dị hợp với đột biến Intron 2G..........52
Hình 3.14. Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS ......................................53


MỞ ĐẦU
Bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn trên
NST thường (26). Cơ chế bệnh sinh là do sự rối loạn tổng hợp hormone vỏ thượng
thận do thiếu hụt các enzym tổng hợp corticosteroid (4), (8), (9), (24).
Bệnh TSTTBS là bệnh di truyền không thể chữa khỏi với các dấu hiệu suy
thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện
nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến sự
phát triển chiều cao, chắc năng sinh dục, sinh sản và tâm lý (5), (27), (29).
Trẻ mắc bệnh phụ thuộc vào điều trị bổ sung hydrocortisol suốt đời, ảnh
hưởng lớn đến quá trình phát triển tâm lý và thể chất, cũng như phải chịu nhiều biến
chứng của bệnh và của thuốc trong quá trình điều trị (3), (6), (7), (12).
Việc phòng bệnh tốt nhất là chẩn đoán trước sinh cho những gia đình có tiền
sử sinh con đầu tiên mắc TSTTBS (4). Vì vậy, muốn chẩn đoán trước sinh cho thai
nhi thì việc đầu tiên là xác định được kiểu gen đột biến di truyền của gia đình.
Chẩn đoán xác định bệnh TSTTBS là phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử để xác định kiểu đột biến trên gen CYP21A2 của gia đình người bệnh,
từ đó giúp xác định kiểu đột biến trên gen CYP21A2 của thai nhi.
Hiện nay, tại Khoa Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền, Bệnh viện Nhi trung
ương đang quản lý khoảng hơn 500 gia đình có con đầu mắc bệnh TSTTBS, và tiếp
nhận khoảng 30 trường hợp mắc mới mỗi năm. Hầu hết các gia đình này đều ở
trong độ tuổi sinh đẻ, do dó nhu cầu tiếp tục sinh con khoẻ mạnh của họ là rất lớn.

Khoa Di truyền và Sinh học Phân Tử - Bệnh Viện Nhi TƯ, từ đầu năm 2009,
là đơn vị đầu tiên nghiên cứu triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn
đoán trước và sau sinh bệnh TSTTBS.


Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Áp dụng các kỹ
thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh”
Mục tiêu nghiên cứu:
1.

Lựa chọn kỹ thuật sinh học phân tử để nhận biết các đột biến trên gen

CYP21A2.
2.

Chẩn đoán trước và sau sinh cho bệnh TSTTBS.

3.

Đề xuất quy trình chẩn đoán trước sinh và sau sinh cho bệnh TSTTBS.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử nghiên cứu
1.1.1. Thế giới
Cách đây hơn hai nghìn năm, Hyppocrate đã mô tả một phụ nữ có xuất hiện
các đặc tính giống như nam giới như: không có kinh nguyệt, cơ bắp phát triển,
giọng trầm, rậm lông tóc và mọc râu (13), (25), (28). Thế kỷ thứ nhất trước công

nguyên, Ovid cũng mô tả một trẻ gái người Hy lạp có dung mạo ngày càng giống
trẻ trai. Có thể đây là bệnh sau này được gọi là bệnh TSTTBS (29).
Trong những thế kỷ tiếp theo, các trường hợp nam hoá gây chuyển giới ở trẻ
gái vẫn tiếp tục được phát hiện. Trẻ trai mắc hiện tượng này được mô tả như những
Heraclex (một nhân vật có sức mạnh phi thường trong truyện thần thoại Hy Lạp)
hoặc Samson (một nhân vật quật chết sư tử trong Kinh thánh) (4), (25).
Năm 1865, Crecchio- nhà giải phẫu học người Italia- đã mô tả một trường hợp
rất đặc biệt về một người phụ nữ lúc mới sinh ra là trẻ gái, nhưng sau này đã trưởng
thành và sống như một người nam giới. Sau khi giải phẫu Crecchio đã phát hiện ra
người phụ nữ này có bộ phận sinh dục bên ngoài giống của nam giới, nhưng bộ
phận sinh dục bên trong là của nữ giới và có tuyến thượng thận lớn (4).
Sau nhiều thập kỷ, thuật ngữ “hội chứng sinh dục thượng thận” đã ra đời để
mô tả chi tiết hơn về những bệnh nhân có tuyến thượng thận lớn và có hiện tượng
nam hoá bộ phận sinh dục ngoài. Vào đầu những năm 50 của thế kỷ XX, bệnh
TSTTBS chỉ là một phần trong Hội chứng sinh dục thượng thận. Hội chứng này
được định nghĩa là do cường androgen gây nam tính hoá (7).
Trường hợp TSTTBS thể mất muối đầu tiên đã được Wilkins và Butler mô tả
năm 1939 - 1940. Sau đó, đến năm 1950 - 1951, Wilkins, Butler và cộng sự đã thấy
việc dùng thuốc cortison có thể gây ức chế được quá trình tổng hợp thừa androgen
trong HCSDTT do TSTTBS (7), (14).
Từ năm 1950 đến năm 1960, TSTTBS được cho là một trường hợp đặc biệt do
hàm lượng hormone steroid tăng cao trong máu và nước tiểu. Hai thập kỷ sau, mối

3


liên hệ di truyền giữa kháng nguyên bạch cầu người (Human leukocyte antigensHLA) và TSTTBS đã được xác lập, và tìm ra được gen có liên quan đến bệnh
TSTTBS, mã hoá cho enzym 21 hydroxylase nằm ở gần vùng phức hợp gen HLA.
Ngay sau đó, vào năm 1984, White và cộng sự đã phát hiện ra các ảnh hưởng di
truyền của gen 21 hydroxylase và đã chứng minh nó là nguyên nhân gây bệnh

TSTTBS (10), (13).
Kể từ đó, Hội chứng sinh dục thượng thận (HCSDTT) do TSTTBS được
nghiên cứu sâu rộng, từ các thể lâm sàng đến các rối loạn tổng hợp hormone do
thiếu hụt enzym và các gen mã hoá tổng hợp các enzym vỏ TT. Dựa trên những
hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của bệnh, người ta đã không còn dùng tên chung là
HCSDTT, mà đã sử dụng danh từ TSTTBS cho nhóm bệnh rối loạn tổng hợp
hormone vỏ TT do thiếu hụt enzym này (17), (18), (26).
Ngày nay, trên thế giới đã phát hiện được trên 100 loại đột biến khác nhau trên
gen CYP21A2. Tỷ lệ các đột biến này thay đổi tuỳ thuộc vào chủng tộc (11), (15),
(22).
1.1.2. Việt Nam
Năm 1974, trong “Hội chứng dậy thì sinh dục sớm ở trẻ em”, N.T. Nhạn đã
mô tả một bệnh nhân 26 tháng tuổi với các dấu hiệu dậy thì sớm kèm theo các thay
đổi sinh hoá phù hợp với HCSDTT (8).
Năm 1990, N.T. Nhạn và cộng sự đã tổng kết có 36 bệnh nhân mắc “hội
chứng sinh dục thượng thận” trong giai đoạn từ năm 1981- 1990, chiếm tỷ lệ 1.9%
tổng số bệnh nhân mắc các bệnh nội tiết, với tỷ lệ tử vong là 5.5% (2/36 bệnh nhân
TSTTBS) (8).
Năm 1994, N.T. Nhạn và cộng sự đã tổng kết các dấu hiệu lâm sàng và thay
đổi sinh hoá của 55 bệnh nhân TSTTBS được điều trị tại khoa NTCHDT - Viện
BVSKTE từ năm 1976 - 1993. Báo cáo này cho thấy, bệnh TSTTBS được chẩn
đoán dựa vào lâm sàng và các xét nghiệm sinh hoá như: progesteron, testosteron,
cortisol, FSH, LH, điện giải đồ và glucose trong máu, 17-CS và 17-OHCS trong
nước tiểu…

4


Mặc dù đã tổng kết các dấu hiệu lâm sàng, các thay đổi sinh hoá và nêu lên
các kết quả điều trị cấp cứu suy thượng thận, góp phần nâng cao khả năng nhận biết

và xử trí HCSDTT tại viện Nhi, các báo cáo trên chưa đề cập đến các xét nghiệm
chẩn đoán xác định đặc hiệu. Việc đưa ra các chẩn đoán xác định đặc hiệu sẽ góp
phần giảm chi phí và rút ngắn thời gian chẩn đoán bệnh.
Năm 1996, N. T. Phượng và cộng sự đã nghiên cứu phương diện di truyền trên
31 bệnh nhân mắc HCSDTT. Tác giả nhận xét thấy các bệnh nhân mang đủ đặc tính
của một bệnh di truyền lặn trên NST thường như không phân biệt giới tính và bệnh
gặp trong một thế hệ, không liên tục qua các thế hệ trong dòng họ. Tác giả còn nhận
xét thấy bệnh nhân có rải rác ở khắp các địa phương, tuy nhiên chưa có điều kiện
phát hiện dị hợp tử.
Năm 2000, V. T. Lan và cộng sự đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật sinh học
phân tử trong sàng lọc một số đột biến thường gặp của gen CYP21A2 ở bệnh nhân
nghi ngờ mắc TSTTBS. Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR và RFLP để sàng lọc 3 đột
biến: 8bpEx3, Exon 6 cluster và V281L trên 8 bệnh nhân. Có 1/8 bệnh nhân mang
đột biến đồng hợp tử 8bpEx3. Tỷ lệ đột biến được tìm thấy thấp do số lượng bệnh
nhân còn ít và chỉ sàng lọc 3 đột biến (6).
Năm 2003, N.N. Dao và cộng sự nghiên cứu đột biến trên 1 gia đình có con
mắc bệnh TSTTBS. Tác giả đã tìm thấy người mẹ mang dị hợp tử đột biến
654A/C→G, người bố mang dị hợp tử đột biến P30L, người con mắc bệnh TSTTBS
mang cả hai đột biến trên và có kiểu hình TSTTBS thể mất muối (2).
Đây là những nghiên cứu ban đầu phát hiện các đột biến trên gen CYP21A2
cho bệnh TSTTBS tại Việt Nam. Tuy nhiên, những nghiên cứu trên có hạn chế là
chỉ tìm những đột biến đã biết, vì vậy tỷ lệ tìm thấy đột biến trên gen CYP21A2 còn
thấp.
Lần đầu tiên tại Khoa Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương, chúng tôi đã áp
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến trên toàn bộ gen
CYP21A2. Xét nghiệm này sẽ làm tăng độ chính xác trong chẩn đoán TSTTBS, từ
đó bệnh nhân được đưa ra phác đồ điều trị sớm và kịp thời.

5

1.2. Tuyến TT và hormone vỏ TT
1.2.1. Bào thai học
Ở những thai nhi bình thường, vỏ thượng thận được hình thành khi được bốn
tuần tuổi. Sang tuần thứ sáu, hormone steroid thượng thận bắt đầu tiết ra và tuyến
sinh dục bắt đầu được hình thành. Từ tuần thứ sáu đến tuần thứ tám, bắt đầu hình
thành bộ phần sinh dục ngoài của trẻ nam.
1.2.2. Cấu tạo của tuyến TT

Hình 1.1. Vị trí tuyến TT và cấu tạo vỏ TT (35)
Tuyến TT gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm ở cực trên hai thận. Mỗi
tuyến nặng khoảng từ 3,5 – 4,5 gram (9). Tuyến thượng thận gồm hai phần riêng
biệt, mỗi phần sản xuất ra những hormone riêng:
− Phần vỏ ngoài gọi là vỏ thượng thận gồm những tế bào tuyến. Vỏ thượng
thận chứa lipid và sản xuất ra những hormone steroid.
− Phần ở trong gọi là phần tuỷ gồm những tế bào thần kinh. Tuỷ thượng thận
sản xuất ra adrenalin và noradrenalin và một lượng nhỏ dopamin.
1.2.3. Cấu tạo vỏ thượng thận
Vỏ thượng thận được chia thành ba lớp khác nhau, mỗi lớp sản xuất ra những
hormone khác nhau (9):

6


− Lớp ngoài cùng là vùng cầu (zona glomerulosa) sản xuất ra nhóm
hormone chuyển hoá muối khoáng, tiêu biểu là aldosteron.
− Lớp giữa có tên là vùng bó (zona fasciculata) sản xuất ra hormone
chuyển hoá glucose, chủ yếu là cortisol.
− Lớp trong cùng có tên là vùng lưới (zona reticularis) sản xuất ra một
lượng nhỏ androgen và một lượng không đáng kể estrogen.

Do được tổng hợp từ cholesterol, các hormone vỏ TT đều có bản chất là
steroid và được gọi là corticosteroid hay corticoid (xuất phát từ chữ cortex nghĩa là
vỏ). Mặc dù có cùng nguồn gốc và bản chất, những thay đổi về cấu trúc hoá học
gồm thay đổi các gốc hoá học và các vị trí liên kết carbon đã tạo nên các nhóm
corticoid có tác dụng sinh học khác nhau. Người ta đã chiết xuất được trên 50 dẫn
xuất corticoid và chia làm ba nhóm:
- Hormone chuyển hoá muối (Mineralocorticoid - MC), tổng hợp ở vùng cầu.
- Hormone chuyển hoá đường (Glucocorticoid - GC), tổng hợp ở vùng bó.
- Hormone sinh dục nam (androgen), tổng hợp ở vùng lưới.
1.2.4. Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của hormone vỏ TT qua hoạt hoá hệ gen tổng hợp
protein (38)
Hormone vỏ TT đến tế bào, khuếch tán thụ động qua màng tế bào, vào bào
tương và gắn với thụ thể đặc hiệu trong bào tương. Phức hợp hormone - thụ thể

7


khuếch tán vào nhân, hoạt hoá các gen đặc hiệu để sao mã hình thành mRNA. Sau
đó, các mRNA lại khuếch tán vào bào tương, tiến hành dịch mã tại ribosom, sinh
tổng hợp protein mới. Các protein mới này có chức năng enzym hoặc có chức năng
vận chuyển hoặc cấu trúc. Ví dụ: tác dụng của hormone chuyển hoá đường là tạo
các protein - enzym tham gia vào quá trình chuyển hoá, đồng hoá hoặc dị hoá các
chất như glucid, protid, lipid hoặc tác dụng của hormone chuyển hoá muối là tạo
các protein vận chuyển, tham gia vào tái hấp thu natri và thải kali trong ống thận
(9).
1.2.5. Tác dụng của các hormone vỏ TT
1.2.5.1. Tác dụng của cortisol
Cortisol là hormone tiêu biểu của nhóm hormone chuyển hoá đường

(Glucocorticoid- GC). Cortisol có tác dụng lên các chuyển hoá glucid, lipid và
protein. Một sự sản xuất quá thừa cortisol dẫn đến tăng glucose máu, tăng lipid
máu.
Cortisol ở gan có tác dụng làm tăng cường quá trình tổng hợp, còn cortisol ở
cơ xương và mô mỡ có tác dụng làm tăng cường sự thoái hoá, do sự thu nhận
glucose ở các mô trên bị ức chế bởi cortisol. Với chuyển hoá protein, cortisol có tác
dụng kìm hãm sự tổng hợp protein và kích thích sự thoái hoá protein. Với chuyển
hoá lipid, cortisol kích thích sự phân huỷ lipid ở mô mỡ làm tăng nồng độ glycerol
và acid béo tự do trong máu.
Trong trường hợp nồng độ GC giảm, bệnh nhân sẽ bị hạ glucose máu, hạ huyết
áp và rối loạn điện giải, dẫn đến cơn suy thượng thận cấp. Ngược lại, khi nồng độ
hormone này tăng kéo dài, bệnh nhân sẽ xuất hiện hội chứng giả Curshing như béo
phì (chủ yếu ở mặt và thân), chậm lớn, cao huyết áp và có thể loét dạ dày.
1.2.5.2. Tác dụng aldosteron
Hormone đặc trưng của nhóm hormone chuyển hoá muối (MineralocorticoidMC) là aldosteron, có chức năng chính trong chuyển hoá nước và điện giải. Vị trí

8


tác dụng chủ yếu của hormone chuyển hoá muối là thận, dạ dày- ruột, tuyến nước
bọt và tuyến mồ hôi.
Các hormone chuyển hoá muối có tác dụng tăng tái hấp thu ion Na+ và bài
xuất K+ ở ống thận, từ đó gián tiếp làm tăng tái hấp thu nước, tăng thể tích tuần
hoàn và tăng huyết áp.
Trong các hormone chuyển hoá muối, aldosteron có 95% tiềm năng giữ muối,
Deoxycorticosteron (DOC) chỉ có 15% tiềm năng này so với aldosteron.
Trong trường hợp nồng độ aldosteron giảm, bệnh nhân sẽ mất natri và tăng
kali, nếu không điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ truỵ mạch và tử vong.
1.2.3.3. Tác dụng của hormone sinh dục nam androgen
Hai hormone sinh dục thượng thận là Dehydroepiandrosteron (DHEA) và

androstenedion được bài tiết vào máu và được biến đổi thành dạng có hoạt tính sinh
học là testosteron và estrogen. Tuy nhiên, người ta cho rằng DHEA và
androstenedion có thể có một số tác dụng trực tiếp như làm phát triển lông nách và
lông mu ở tuổi dạy thì.
Testosteron có các tác dụng sau:
ƒ

Trong thời kỳ bào thai: thúc đẩy biệt hoá trung tâm hướng sinh dục vùng đồi thị,
tạo phương thức điều hoà chức năng sinh dục nam và biệt hoá mầm sinh dục
thành cơ quan sinh dục nam như hình thành dương vật và bìu. Vì vậy, trong
trường hợp bệnh lý, nồng độ aldrogen tăng từ trong bào thai có thể gây chuyẻn
giới bộ phận sinh dục ngoài ở thai nhi nữ hoặc gây to dương vật ở thai nhi nam.

ƒ

Trong tuổi dậy thì: làm phát triển và hoàn thiện cơ quan sinh dục gồm làm to
dương vật và bìu, làm xuất hiện các đặc tính sinh dục phụ theo kiểu nam như
phát triển và phân bố lông, tóc mang đặc thù nam, giọng trầm và tăng tiết chất
bã gây mọc trứng cá.
Trong trường hợp bệnh lý tăng nồng độ testosteron, trẻ trai có biểu hiện dậy thì
sớm và trẻ gái có biểu hiện nam tính hoá.

ƒ

Tác dụng lên chuyển hoá: làm tăng tổng hợp protein và phát triển hệ cơ, tăng
tổng hợp khung protein của xương, phát triển cốt hoá sụn liên hợp ở đầu xương

9

dài, tăng hoạt động các tế bào tạo xương, tăng chiều dày của xương và tăng lắng
đọng canxi trong xương.
Trong trường hợp tăng nồng độ testosteron kéo dài, sự cốt hoá các đầu xương
dài xảy ra nhanh chóng dẫn đến đóng sớm các đầu xương, làm cho bệnh nhân
ngừng lớn và trở thành lùn.
1.3. Các enzym tham gia vào sự tổng hợp corticoid
Hormone steroid, trong đó có hormone vỏ TT, được tổng hợp nhờ sự tham gia
trực tiếp của một chuỗi các enzym (1), (9).
Phản ứng hydroxyl hoá giữ vai trò quan trọng trong sự tổng hợp cholesterol
cũng như quá trình chuyển hoá cholesterol thành hormone steroid và muối mật. Vì
vậy, các enzym tham gia tổng hợp hormone vỏ TT là những enzym xúc tác quá
trình hydroxyl hoá, gọi chung là các hydroxylase.
Trừ enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), các enzym tổng hợp
corticoid đều thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt là CYP.
Các enzym CYP được phân bố trong các microsom hoặc trong các ty thể của
tế bào vỏ TT và sinh dục. Trong quá trình xúc tác tổng hợp hormone, các CYP ty
thể cần protein chứa sắt (Adrenodoxin) và flavoprotein làm trung gian vận chuyển
điện tử, còn các CYP microsom chỉ cần flavoprotein. Cả hai loại enzym này đều cần
điện tử khử từ NADPH (chất cho điện tử).
Các gen mã hoá tổng hợp các enzym được gọi theo tên của enzym nên có chữ
đầu chung là CYP.
Bảng 1.1. Tên các enzym và tên gen tương ứng
Tên đơn giản
(gọi theo chức năng)

Enzym

Vị trí trong
tế bào

Cholesterol desmolase

P450cc

(side- chain cleavage)

(CYP11A1)

3β-hydroxysteroid

3β- HSD

Lưới nội

dehydrogenase

(3β-

chất

Ty thể

10

Gen

Vị trí gen
trên NST

CYP11A1

15q23-q24

HSD3B2

1p13.1


HSDII)
17α- hydroxylase/ 17, 20 P450c17

Lưới nội

lyase

chất

(CYP17)

21α - Hydroxylase
11β- hydroxylase

P450c21
P450c11

CYP17

10q24.3

CYP21A2

6p21.3

Ty thể

CYP11B1

8q21-22

Ty thể

CYP11B2

8q21-22

Lưới nội
chất

Aldosterone synthase
(corticosterone 18-

P450c18

methylcorticosteroneoxi

(CYP11B2)

dase/lyase)
1.4. Hội chứng TSTTBS

Hình 1.3. Sinh tổng hợp hormone vỏ thượng thận (21)
TSTTBS là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi
sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzym cần thiết để tổng hợp cortisol từ
cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase (21-OH), 11β-hydroxylase (11-

11


OH), 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD) và
20/22 Desmolase (16), (19), (20).
Khi thiếu một trong các enzym trên, một hoặc nhiều con đường tổng hợp
hormone bị gián đoạn làm cho hormone tương ứng không được sản xuất đủ, đặc
biệt là cortisol. Nồng độ cortisol thấp, qua cơ chế điều hoà ngược âm tính, kích tích
tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH gây nên (9), (23) :
- Tăng sản tuyến yên (tên bệnh được gọi theo cơ chế này)
- Kích thích các tế bào chứa melanin tạo sắc tố đen và làm phân tán sắc tố
này trên biểu bì da, vì trong phân tử ACTH có 13 acid amin đầu giống với
hormone kích thích tế bào sắc tố (melanocyte stimulating hormone- MSH).
- Tăng ứ đọng các hormone và các tiền chất trước chỗ gián đoạn dẫn đến
tăng sản xuất các hormone ở đường tổng hợp không bị gián đoạn khác.
1.4.1. TSTTBS do thiếu hụt enzym 21 hydroxylase
1.4.1.1. Sinh bệnh học
90- 95% trường hợp TSTTBS là do thiếu hụt hoạt động của enzym 21-OH
(29). Enzym 21-OH tham gia vào đường tổng hợp MC và GC.
- Trong đường tổng hợp MC, enzym 21-OH có tác dụng chuyển progesteron
thành DOC. Sau đó, với sự tham gia của enzym 11β-OH và 18-OH, DOC
chuyển thành corticosteron và aldosteron.
- Trong đường tổng hợp GC, enzym 21-OH có tác dụng chuyển 17-OHP
thành 11- deoxycortisol. Sau đó với sự tham gia của enzym 11β-OH, 11deoxycortisol chuyển thành cortisol.
Sự ứ đọng các hormone và các tiền chất trước chỗ gián đoạn là 17-OHP và

progesteron, cùng với sự tăng bài tiết ACTH làm tăng sản xuất androgen.
1.4.1.2. Biểu hiện lâm sàng
Sự thiếu hụt hoạt động của 21-OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/ hoặc thiếu
hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận (8), (29). Biểu hiện lâm sàng
của TSTTBS tuỳ thuộc vào mức độ thiếu hụt hoạt động của enzym, bao gồm:

12


- Thể nam hoá đơn thuần: trong thể này, enzym 21-OH thiếu không hoàn
toàn nên sự tăng ACTH đủ làm cho nồng độ cortisol trở về bình thường.
Tuy nhiên, do ACTH tăng tối đa và không có dự trữ cortisol ở vỏ TT nên
trong trường hợp có stress thì bệnh nhân không có khả năng tăng bài tiết
cortisol để chống lại. Trẻ gái có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài
và tình trạng giả dạy thì sớm ở trẻ trai
- Thể mất muối: Enzym 21-OH không có hoặc rất ít, nên nồng độ cortisol
và aldosteron không thể quay về bình thường theo cơ chế bù trừ dù nồng
độ ACTH và hoạt tính renin luôn tăng cao. Dưới tác dụng của ACTH, sự
tổng hợp các tiền chất trước chỗ gián đoạn dẫn đến tăng tổng hợp
androgen. Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng tương tự như thể nam
hoá đơn thuần, và có kèm theo thiếu hụt aldosterone ở trẻ sơ sinh. Nếu
không được điều trị sớm, bệnh nhân có thể tử vong do cơn suy thượng thận
cấp.
- Thể không cổ điển hoặc khởi phát muộn: Trong thể này, nồng độ của
enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ. Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng như
giả dậy thì sớm ở trẻ gái, hội chứng rậm lông, buồng trứng đa nang và
giảm khả năng thụ tinh (6, 8).
1.4.2. TSTTBS do thiếu các enzym khác
1.4.2.1. TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase
TSTTBS do thiếu enzym cholesteron desmolase còn được gọi là hội chứng

Prader Gurtner. Trong hội chứng này, do thiếu enzym desmolase, cholesterol không
chuyển được thành pregnenolon nên sự tổng hợp của cả ba loại steroid là MC, GC
và androgen đều giảm.
Sau khi ra đời, trẻ bị suy thượng thận với biểu hiện mất muối, mất nước và
truỵ mạch. Trẻ trai có bộ phận sinh dục ngoài giống như trẻ gái. Đây là bệnh hiếm
gặp, có tỷ lệ tử vong cao.

13


1.4.2.2. TSTTBS do thiếu enzym 17α- hydroxylase (17- OH)
TSTTBS do thiếu enzye 17α- hydroxylase còn được gọi là hội chứng Biglieri.
Trong hội chứng này, do thiếu enzym 17- OH, pregnenolon không chuyển được
thành 17- hydroxypregnenolon và progesteron không chuyển được thành 17
hydroxyprogesteron nên sự tổng hợp GC và androgen giảm. Trong khi đó đường
sinh tổng hợp MC không bị gián đoạn nên sự sản xuất các steroid trong đường đó
tăng lên.
Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng cao huyết áp và giả ái nam ái nữ ở trẻ trai.
Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone GC.
1.4.2.3. TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase
TSTTBS do thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase còn được gọi
là hội chứng Bongiovani. Do thiếu enzym này, sự tổng hợp các steroid có liên kết
đôi Delta 4 giảm gây giảm tổng hợp GC, MC và androgen, trong khi đó, sản xuất
DHA và androstendiol delta 5 tăng.
Trẻ trai có biểu hiện dị dạng bộ phận sinh dục ngoài như tật lỗ đái thấp và
không có bìu. Trẻ gái có thể phì đại âm vật và môi lớn dính giống bìu. Đôi khi có
trường hợp có kèm theo biểu hiện mất muối. Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị
được bằng hormone GC.
1.4.2.4. TSTTBS do thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase
Đây là loại TSTTBS gặp phổ biến sau TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH.

Do thiếu enzym 11β, DOC không chuyển được thành corticosteron và 11deoxycortisol không chuyển thành cortisol gây thiếu GC, tăng DOC và androgen.
Bệnh nhân có biểu hiện tăng huyết áp, dậy thì sớm ở trẻ trai và giả ái nam ái nữ ở
trẻ gái. Bệnh có thể điều trị được bằng hormone GC.
1.4.2.5. TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase
TSTTBS do thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase còn được gọi là hội chứng
Olick. Do thiếu enzym này, corticosteron không chuyển được thành aldosteron gây

14


hội chứng mất muối trên lâm sàng. Đây là bệnh hiếm gặp và có thể điều trị được
bằng hormone MC.
1.5. Cơ sở di truyền trong TSTTBS do thiếu hụt 21- OH
TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH là bệnh di truyền lặn do đột biến gen trên
NST thường. Khả năng sinh con bị bệnh là 25% và sinh con dị hợp tử mang gen
bệnh lặn là 50%. Những người dị hợp tử này rất khó phát hiện và là người truyền
gen bệnh cho các thế hệ tiếp theo. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau. Bệnh xảy ra
không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ (30), (31).
Tần suất người mang gen bệnh TSTTBS do thiếu hụt enzym 21- OH là 1/60.
Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con
bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể.

Hình 1.4. Vị trí gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6 (Wilkins, 1994)
Sự phát triển của di truyền phân tử trong những năm 90 của thế kỉ 20 đã cho
phép hiểu sâu hơn về cơ chế của bệnh. Người ta đã xác định được vùng gen mã hoá
cho enzym 21- OH nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (6p2.1-3) có độ lớn
xấp xỉ 30kb. Vùng gen này gồm hai gen: gen CYP21A2 và gen giả CYP21A1Pnằm giữa vùng phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (Major Histiocompatibility ComplexMHC- cạnh gen HLA) (13).
. Gen CYP21A2 và CYP21A1P nằm xen kẽ với hai gen mã hoá cho bổ thể
C4A và C4B. Gen CYP21A2 là thành viên của nhóm P450 mà đặc hiệu bởi C21

15


trong tiền chất steroid vỏ thượng thận. Gen CYP21A1P là gen bất hoạt, gen
CYP21A2 mã hoá cho enzym 21-OH (5, 7). Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A1P có
độ lớn xấp xỉ 3kb gồm 10 exon, hai gen này có trình tự tương đồng giống nhau đến
98%. Trình tự của giả gen CYP21A1P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh
nhân TSTTBS. Qua quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều
giữa các cặp nhiễm sắc thể sẽ dẫn tới việc các trình tự ở vùng giả gen sẽ chuyển
sang gen CYP21A2 gây nên đột biến trên gen (7, 8). 95% các đột biến trên gen
CYP21A2 là do đột biến chuyển đoạn từ giả gen CYP21A1P, 5% còn lại là do tự
gen CYP21A2 bị đột biến. Kiểu đột biến có liên quan chặt chẽ đến kiểu hình của
bệnh TSTTBS (11).

Hình 1.5. Các đột biến thường gặp có liên quan đến kiểu hình (21)
1.6. Những tiến bộ trong chẩn đoán
Trong TSTTBS do thiếu hụt enzym 21-OH, nồng độ aldosteron, cortisol và
các sản phẩm chuyển hoá của chúng thường giảm. Ngược lại, nồng độ các hormone
và các tiền chất trước chỗ gián đoạn là progesteron, 17-OHP, các hormone theo con
đường tổng hợp không tắc là androgen và các sản phẩm chuyển hoá thường tăng.
Tuy nhiên, thay đổi sinh hoá còn phụ thuộc vào mức độ rối loạn tổng hợp
hormone. Ví dụ: nồng độ aldosteron thay đổi không rõ trong thể NHĐT và thể
không cổ điển, nhưng lại giảm rất rõ trong thể mất muối.
Trong các thập kỷ 50, 60 của thế kỷ XX, để chẩn đoán bệnh TSTTBS, về mặt
sinh hoá, người ta dựa chủ yếu vào định lượng trong máu ba sản phẩm cuối của ba
đường tổng hợp hormone vỏ TT là aldosteron, cortisol và testosteron cùng các chất
chuyển hoá tương ứng trong nước tiểu. Nhưng sự thay đổi ba loại hormone này còn

16