Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng v parahaemolyticus phân lập được ở bệnh nhân ngộ độc thực phẩm tại hà nội
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.01 MB, 77 trang )
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
Nguyễn Hoài Thu
Đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng
Vibrio parahaemolyticus phân lập đƣợc ở bệnh nhân
ngộ độc thực phẩm tại Hà Nội
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Bình Minh
Hà Nội - Năm 2010
2
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Lời cảm ơn
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn
Bình Minh, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Công nghệ
Sinh học thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã
dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong phòng thí nghiệm Vi
khuẩn đường ruột, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, đã giúp đỡ và động viên tôi trong
quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa qua.
Và tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố, mẹ, em gái, chồng và con trai
Hoàng Dương đã luôn ở bên tôi, nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập,
nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 10 năm 2010
Nguyễn Hoài Thu
3
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi
kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác; các
số liệu, kết quả của luận văn này chưa từng được công bố.
Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập
và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả. Phần mềm phân tích kết
quả Bio Numeric sử dụng là phần mềm có bản quyền .
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Nguyễn Hoài Thu
4
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Mục lục
Trang phụ bìa .............................................................................................................. 2
Lời cảm ơn .................................................................................................................. 3
Lời cam đoan ............................................................................................................... 4
Mục lục ........................................................................................................................ 5
Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................. 8
Danh mục bảng ........................................................................................................... 9
Danh mục hình minh họa .......................................................................................... 11
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 15
1.1.
Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V. parahaemolyticus ............................ 15
1.1.1.
Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus trên thế giới .......15
1.1.2.
Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus tại Việt nam ......16
1.1.3.
Đặc điểm lâm sàng ...................................................................................16
1.1.4.
Phòng và chống bệnh ...............................................................................17
1.2.
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................................................................ 18
1.2.1.
Định danh .................................................................................................18
1.2.2.
Phân loại ...................................................................................................18
1.2.3.
Hình thái và tính chất hóa sinh .................................................................18
1.2.4.
Đặc điểm sinh thái ....................................................................................21
1.2.5.
Tính chất kháng nguyên ...........................................................................23
1.2.6.
Bộ gen của V. parahaemolyticus ..............................................................24
1.2.7.
Độc tố và cơ chế gây bệnh .......................................................................24
1.2.8.
Chủng V. parahaemolyticus gây dịch type huyết thanh O3:K6 ...............28
1.2.8.1.
Nguồn gốc phát sinh chủng O3:K6 mới ............................................28
1.2.8.2.
Các biến thể của type huyết thanh O3:K6 .........................................29
1.3.
Các phƣơng pháp chẩn đoán ........................................................................... 30
5
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
1.3.1.
Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập ...............................................................30
1.3.2.
Phƣơng pháp sinh học phân tử .................................................................33
1.3.2.1.
Kỹ thuật lai ADN ..............................................................................33
1.3.2.2.
Kỹ thuật PCR.....................................................................................34
1.3.2.3.
Kỹ thuật Real-time PCR ....................................................................34
1.4.
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán V.
parahaemolyticus ...................................................................................................... 35
1.4.1.
Trên thế giới .............................................................................................35
1.4.1.1.
Phƣơng pháp PCR .............................................................................35
1.4.1.2.
Phƣơng pháp xác định genotype .......................................................37
1.4.1.3.
Kỹ thuật Ribotyping ..........................................................................39
1.4.1.4.
Phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn ............................................40
1.4.2.
Tại Việt Nam ............................................................................................40
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 42
2.1.
Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 42
2.2.
Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 42
2.3.
Thiết bị, hóa chất và sinh phẩm ...................................................................... 42
2.3.1.
Trang thiết bị ............................................................................................42
2.3.2.
Hóa chất, sinh phẩm .................................................................................43
2.4.
Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 44
2.4.1.
Thu thập mẫu nghiên cứu .........................................................................44
2.4.2.
Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................44
2.4.3.
Phƣơng pháp PCR xác định các gen ToxR, tdh, trh và GS ....................45
2.4.3.1.
đƣợc
Tách chiết ADN của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập
.................................................................................................45
2.4.3.2.
Phản ứng chuỗi men (PCR) phát hiện gen ToxR ..............................45
2.4.3.3.
PCR phát hiện gen tdh ......................................................................47
2.4.3.4.
PCR phát hiện gen trh ......................................................................48
2.4.3.5.
PCR phát hiện gen GS ......................................................................50
6
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
2.5.
Nguyễn Hoài Thu
So sánh genotype các chủng vi khuẩn Vibiro parahaemolyticus phân lập
đƣợc...........................................................................................................51
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................... 55
3.1.
Tỷ lệ V. parahaemolyticus phân lập từ bệnh nhân ngộ độc thực phẩm ở Hà
Nội
............................................................................................................. 55
3.2.
Xác định type huyết thanh của các chủng V. parahaemolyticus phân lập
đƣợc
3.3.
............................................................................................................ 58
Tỷ lệ phát hiện gen đặc hiệu loài ToxR và các gen độc tố tdh, trh, gen chỉ
điểm chủng gây dịch GS ........................................................................................... 60
3.4.
So sánh kiểu gen của các chủng phân lập đƣợc .............................................. 63
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 68
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 70
7
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Danh mục chữ viết tắt
ADN
axit deoxyribonucleic
ARN
axit ribonucleic
bp
base pair (cặp ba zơ)
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát và phòng bệnh dịch)
CLB
Cell Lysis Buffer (dung dịch đệm ly giải tế bào)
cs
cộng sự
CSB
Cell Solution Buffer (dung dịch đệm hòa tan tế bào)
GS
group specific (đặc hiệu nhóm)
KP
Kanagawa Phenomenon (hiện tƣợng Kanagawa)
LB
Luria Bertani
LDC
Lysine Decarboxylase
PCR
Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi men)
PFGE
Pulse Field Gel Electrophoresis (điện di trƣờng xung)
TBE
Tris Borate EDTA
TCBS
Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar
tdh
thermostable direct hemolysin
(ly giải hồng cầu trực tiếp chịu nhiệt)
TE
Tris EDTA
trh
thermostable related hemolysin
(ly giải hồng cầu có liên quan đến yếu tố chịu nhiệt)
TTSS
Type III Secretion System (hệ thống tiết type III)
UT
Untype (không xác định type)
8
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Tính chất hóa sinh của Vibrio parahaemolyticus .....................................20
Bảng 1.2. Các điều kiện tối ƣu cho giới hạn phát triển của V. parahaemolyticus ....22
Bảng 1.3. Các type huyết thanh của V. parahaemolyticus ........................................23
Bảng 1.4. So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch TCBS .......................32
Bảng 1.5. So sánh đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Chrom ......................33
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi ToxR ..............................................................................45
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen ToxR.............................................46
Bảng 2.3. Chu trình chạy PCR phát hiện gen ToxR ..................................................46
Bảng 2.4. Trình tự cặp mồi tdh .................................................................................47
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng khuếch đại gen tdh ................................................47
Bảng 2.6. Chu trình chạy PCR phát hiện gen tdh .....................................................48
Bảng 2.7. Trình tự cặp mồi trh ..................................................................................48
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng khuếch đại gen trh ................................................49
Bảng 2.9. Chu trình chạy PCR phát hiện gen trh ......................................................49
Bảng 2.10. Trình tự cặp mồi gen GS .........................................................................50
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng khuếch đại gen GS ..............................................50
Bảng 2.12. Chu trình chạy PCR phát hiện gen GS ...................................................51
Bảng 2.13. Thành phần dung dịch đệm trƣớc khi cắt ADN bằng enzyme giới hạn .53
Bảng 2.14. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt ADN bằng NotI ...............................54
Bảng 3.1. Tính chất hóa sinh của 84 chủng V. parahaemolyticus ...........................57
Bảng 3.2. Kết quả xác định type huyết thanh của các chủng V. parahaemolyticus .58
9
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Bảng 3.3. Phân nhóm kiểu gen độc tố.......................................................................62
Bảng 3.4. Mối liên quan giữa type huyết thanh và các kiểu gen của các chủng vi
khuẩn .........................................................................................................................65
10
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Danh mục hình minh họa
Hình 1.1. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dƣới kính hiển vi điện tử ..................19
Hình 1.2. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch TCBS .................30
Hình 1.3. Khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch Chrom ................31
Hình 1.4. Tính chất sinh hóa của V. parahaemolyticus ............................................32
Hình 1.5. Vị trí cặp mồi khuếch đại trình tự ToxRS và vị trí các base khác nhau giữa
dòng O3:K6 cũ và mới ..............................................................................................36
Hình 2.1. Hình ảnh điện di gen ToxR ........................................................................46
Hình 2.2. Hình ảnh điện di gen tdh ...........................................................................48
Hình 2.3. Hình ảnh điện di gen trh ...........................................................................49
Hình 2.4. Hình ảnh điện di gen GS ...........................................................................51
Hình 2.5. Vị trí cắt của enzyme NotI ........................................................................53
Hình 3.1. Phân bố theo giới tính của bệnh nhân nhiễm V. parahaemolyticus ..........55
Hình 3.2. Phân bố theo độ tuổi của bệnh nhân nhiễm V. parahaemolyticus ............56
Hình 3.3. Tỷ lệ các ca nhiễm trùng V. parahaemolyticus theo tháng .......................57
Hình 3.4. Tỷ lệ các type huyết thanh của các chủng V. parahaemolyticus ..............59
Hình 3.5. Tỷ lệ mang gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus .....................61
Hình 3.6. Kết quả kiểu gen PFGE đại diện của 84 chủng V. parahaemolyticus phân
lập ở Hà Nội ..............................................................................................................64
Hình 3.7. Tỷ lệ tƣơng đồng giữa các kiểu gen PFGE ...............................................66
11
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các bệnh liên quan đến ngộ độc thực phẩm đang là một vấn đề
đƣợc quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt ở những nƣớc đang phát triển, trong đó
có Việt Nam. Trong số đó, ngộ độc thực phẩm do Vibrio chiếm tỷ lệ lớn trong cộng
đồng. Số lƣợng các loài trong họ phẩy khuẩn gây bệnh ở ngƣời tăng lên một cách
nhanh chóng và một số loài đã đƣợc biết đến với vai trò gây bệnh đƣờng tiêu hóa.
Các Vibrio gây ngộ độc thực phẩm khác nhau về kiểu hình, tính chất lý hóa, sinh
thái và dịch tễ. Những loài thƣờng gặp gây bệnh đƣờng tiêu hóa ở ngƣời nhƣ Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus. Các phẩy khuẩn khác nhƣ
Vibrio mimicus, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii và Vibrio holliase thƣờng ít gây
bệnh cho ngƣời.
Không nhƣ V. cholerae, thƣờng gây bệnh ở những nƣớc chậm phát triển có
điều kiện vệ sinh thấp kém, nhiễm khuẩn do V. parahaemolyticus thƣờng xảy ra ở
cộng đồng dân cƣ có mức sống cao, ngay cả ở những nƣớc đang phát triển. Nguyên
nhân nhiễm khuẩn V. parahaemolyticus không chỉ do ý thức vệ sinh an toàn thực
phẩm mà còn do tập quán ăn uống. Vi khuẩn này cƣ trú tự nhiên ở nƣớc biển hoặc
cửa sông và truyền bệnh cho ngƣời do ăn các loại hải sản sống, chƣa đƣợc nấu chín
hoặc thực phẩm bị nhiễm trùng. Nhiễm trùng V. parahaemolyticus gây hội chứng
viêm dạ dày ruột bao gồm các triệu chứng: tiêu chảy cấp, đau bụng, nôn, đau đầu,
sốt nhẹ, thỉnh thoảng tiêu chảy có máu. Nhiễm trùng V. parahaemolyticus thƣờng
gây thành dịch lớn ở nhiều nƣớc. Cơ chế gây bệnh do V. parahaemolyticus hiện vẫn
chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Nghiên cứu ở một số nƣớc cho thấy các chủng V.
parahaemolyticus phân lập từ bệnh nhân mang gen ly giải hồng cầu trực tiếp chịu
nhiệt tdh (thermostable direct hemolysin) hoặc gen trh (thermostable related
hemolysin) ly giải hồng cầu liên quan với tdh hoặc cả hai gen.
V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nƣớc
trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tại Việt Nam, V. parahaemolyticus đã đƣợc
12
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
phân lập từ ghẹ, tôm hùm và ốc [61]. Trong một điều tra về bệnh đƣờng ruột ở tỉnh
Khánh Hòa từ năm 1997 đến năm 1999 đã phát hiện ra 548 ca nhiễm trùng có
nguyên nhân do V. parahaemolyticus. Trong đó có hơn 90% bệnh nhân trên 5 tuổi,
53% bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy ra nƣớc và 6% bệnh nhân tiêu chảy có
máu. Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam chƣa có số liệu nghiên cứu về tỷ lệ mắc
cũng nhƣ vai trò gây ngộ độc thực phẩm của V. parahaemolyticus. Tại miền Bắc
Việt Nam, với điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho V.
parahaemolyticus phát triển trong môi trƣờng thực phẩm, cộng thêm ý thức về vệ
sinh an toàn thực phẩm của ngƣời dân chƣa đƣợc đầy đủ, đặc biệt khi đời sống kinh
tế xã hội đƣợc cải thiện kéo theo việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có
nguồn gốc từ hải sản trong bữa ăn, chắc chắn ngộ độc thực phẩm do V.
parahaemolyticus gây ra chiếm tỷ lệ không nhỏ, nhất là các thành phố lớn. Nhằm
hiểu sâu hơn về các đặc tính của các chủng V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực
phẩm tại Hà Nội, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Đặc điểm dịch tễ học
phân tử của các chủng V. parahaemolyticus phân lập đƣợc ở bệnh nhân ngộ
độc thực phẩm tại Hà Nội”.
Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn khách quan nhằm:
-
Từng bƣớc nâng cao năng lực cho cán bộ nghiên cứu, phù hợp với xu thế
phát triển chung của đất nƣớc;
-
Hiểu sâu hơn về ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus;
-
Làm giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực
phẩm do V. parahaemolyticus;
-
Là nâng cao năng lực kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm của các cơ quan
chức năng.
Với những ý nghĩa trên, mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:
1. Phát hiện và định type V. parahaemolyticus từ bệnh nhân tiêu chảy ở Hà
Nội bằng phƣơng pháp nuôi cấy phân lập
13
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
2. Xác định các gen độc tố tdh, trh và GS và so sánh các chủng V.
parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật điện di trƣờng xung
14
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.
Ngộ độc thực phẩm nguyên nhân do V. parahaemolyticus
1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus trên thế giới
V. parahaemolyticus đƣợc Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm
1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu, hến sống làm
272 ngƣời nhập viện và 20 ngƣời chết [13]. Các vụ dịch do vi khuẩn này gây ra đã
đƣợc ghi nhận ở Đông Bắc nƣớc Mỹ [30, 39, 42], Tây Bắc Thái Bình Dƣơng [25,
40, 41], Louisiana [3, 26], Florida [18], và ở vùng Vịnh nƣớc Mỹ [18, 28]; tỉnh
bang cực tây của Canada [14], Bangladesh [21]; Vellore của Ấn Độ [27]; Thái Lan
[57]; Đài Loan [6, 44, 45]; Vladivostok của Nga [52]; Guam [16]; Lima ở Peru [4];
Dakar ở Senegal [53] và lƣu vực Cross River ở Nigeria [11, 34]. Ở Đài Loan, vi
khuẩn này chiếm đến một nửa các vụ dịch ngộ độc thƣờng niên [45]. Một điều tra
trong suốt một năm tại vùng Vịnh của Mỹ và trong suốt khoảng thời gian 13 năm tại
Florida [18, 28] cũng đã cho thấyV. parahaemolyticus là loại phẩy khuẩn hay đƣợc
phân lập thấy nhất trong họ Vibrio. Tại Việt Nam, V. parahaemolyticus đã đƣợc
phân lập từ ghẹ, tôm hùm và ốc [61]. Mặc dù có rất nhiều chủng huyết thanh khác
nhau của vi khuẩn này có thể gây bệnh, tuy nhiên O3:K6 là chủng nổi trội nhất
trong hầu hết các vụ dịch từ năm 1996 trên toàn thế giới [30]. Dịch bệnh do dòng vi
khuẩn này gây ra bắt đầu từ tháng hai năm 1996 và những chủng phân lập đƣợc từ
những ngƣời du lịch Châu Á bắt đầu từ năm 1995 đều thuộc về một dòng duy nhất
có gen tdh, không có gen trh và có cùng các băng ADN giống nhau khi làm APPCR [37]. Trong 227 chủng phân lập ở bệnh viện Bangladesh từ năm 1977 đến
1998, chỉ có 22 chủng phân lập giữa năm 1996 và 1998 là thuộc về dòng O3:K6
mới này (định danh bằng chủng huyết thanh, gen tdh và trh và AP-PCR). Các chủng
O3:K6 phân lập đƣợc từ bệnh phẩm lâm sàng ở Đài Loan, Lào, Nhật Bản, Thái Lan,
Hàn Quốc và Mỹ từ năm 1997 đến 1998 cũng thuộc về chủng O3:K6 mới này.
15
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus tại Việt nam
Tại Việt Nam, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về bệnh đƣờng ruột
ở tỉnh Khánh Hòa và ghi nhận một lƣợng lớn các ca tiêu chảy có liên quan đến
nhiễm trùng có nguyên nhân do V. parahaemolyticus. Từ tháng 1 năm 1997 đến
tháng 11 năm 1999 nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ mắc V. parahaemolylticus trên
1000 ngƣời là 0,15 ca bệnh đối với trẻ nhỏ hơn 6 tuổi, 0,18 ca từ 6-65 tuổi và 0,09
ca lớn hơn 65 tuổi. Mặc dù hải sản vẫn là yếu tố nguy cơ chính gây nhiễm trùng V.
parahaemolyticus nhƣng điều đáng thú vị là khi so sánh điều kiện kinh tế xã hội của
những ngƣời bị ngộ độc thức ăn do vi khuẩn này gây ra, các nhà nghiên cứu đã thấy
rằng càng những ngƣời có mức sống cao trong xã hội lại càng dễ nhiễm V.
parahaemolyticus. Nguyên nhân đƣợc cho là tại Khánh Hòa, do giá hải sản tƣơi
tƣơng đối cao nên những gia đình có điều kiện kinh tế eo hẹp thƣờng khó có thể sử
dụng thƣờng xuyên nguồn dinh dƣỡng này [58].
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng
Có tất cả ba dạng bệnh cảnh lâm sàng khi bị nhiễm V. parahaemolyticus:
nhiễm trùng vết thƣơng, nhiễm trùng máu thứ cấp và bệnh đƣờng ruột. Khi xâm
nhiễm vào cơ thể, V. parahaemolyticus sẽ gây ra tình trạng tiêu chảy với các triệu
chứng buồn nôn, nôn và sốt. Thông thƣờng những triệu chứng này xảy ra trong
vòng 24 tiếng sau khi bị phơi nhiễm. Các triệu chứng trên tƣơng tự nhƣ do
Salmonella nhƣng trầm trọng hơn. Salmonella tác động lên vùng bụng trong khi V.
parahaemolyticus tác động lên bao tử ngƣời bệnh [1].
Thông thƣờng, bệnh sẽ tự khỏi trong vòng 3 ngày, tuy nhiên với những
trƣờng hợp nặng, thƣờng hay xảy ra với những ngƣời có hệ miễn dịch yếu, bệnh có
thể kéo dài lâu hơn.
16
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
1.1.4. Phòng và chống bệnh
Phòng bệnh
Do V. parahaemolyticus có đặc điểm ƣa mặn nên hải sản tƣơi đƣợc coi là ổ
chứa vi khuẩn này và là nguyên nhân chính cho các vụ ngộ độc thực phẩm. Ở
những tháng ấm áp trong năm, cá tƣơi và động vật có vỏ có thể chứa đến 106 cfu/g
vi khuẩn này [46]. Các loại thực phẩm khác cũng có thể lây nhiễm chéo thông qua
các quá trình chế biến.
Số lƣợng của V. parahaemolyticus trong các thực phẩm nhiễm khuẩn thƣờng
thấp, xấp xỉ 102 cfu/g nhƣng có thể tăng lên gấp 10 lần vào mùa hè [9] và có thể gây
bệnh cho ngƣời khỏe mạnh. Việc làm sạch hải sản không có hiệu quả trong việc loại
bỏ V. parahaemolyticus và không thể sử dụng làm công cụ để kiểm soát chất lƣợng
động vật có vỏ [12] mà phải dựa vào kiểm soát quy trình chế biến, không để lây
nhiễm chéo xảy ra giữa thức ăn sống với thức ăn chín và phải kiểm soát quá trình
phát triển của vi khuẩn trên thức ăn đã chế biến.
Chính vì vậy, để phòng bệnh cần phải thực hiện các biện pháp:
-
Giữ gìn nơi chế biến thức ăn sạch sẽ
-
Bảo quản lạnh và riêng biệt hải sản tƣơi sống, không để tiếp xúc với các
thức ăn khác
-
Rửa tay sạch sẽ, vệ sinh dao, thớt trƣớc và sau khi chế biến hải sản
-
Nấu chín hải sản
Điều trị
Ngộ độc thức ăn do V. parahaemolyticus gây ra thƣờng không cần phải điều
trị. Cho đến nay, vẫn chƣa có bằng chứng nào cho thấy việc điều trị bằng kháng
sinh sẽ làm giảm tính dữ dội của ca bệnh hay nhanh khỏi bệnh. Để điều trị, chủ yếu
bệnh nhân nên uống thật nhiều nƣớc để thay thế lƣợng nƣớc đã mất khi bị tiêu chảy.
Tuy nhiên, đối với những ca bệnh nặng kéo dài có thể sử dụng các kháng sinh nhƣ
Tetracycline, Ampicillin hoặc Ciprofloxacin nhƣng việc lựa chọn loại kháng sinh
nào cần phải dựa trên kháng sinh đồ của vi khuẩn gây bệnh.
17
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
1.2.
Nguyễn Hoài Thu
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.2.1. Định danh
Chi Vibrio nằm trong họ Vibrionaceae. Ngoài chi Vibrio, họ này còn bao
gồm các chi Aeromonas, Plesiomonas, và Photobacterium. Do có đặc tính ƣa mặn
nên tất cả loài Vibrio đều hiện diện trong môi trƣờng nƣớc biển. Trong 30 loài thuộc
chi Vibrio có 13 loài có khả năng gây bệnh cho con ngƣời, bao gồm V. cholerae, V.
mimicus, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. algiolyticus, V. cincinnatiensis, V.
hollisae , V. vulnificus, V. furnissii, V. damsela, V. metshnikovii và V. carchariae.
Tất cả các phẩy khuẩn trên đều gây bệnh thông qua con đƣờng thực phẩm, tuy nhiên
V. cholerae O1, V. parahaemolyticus và V. vulnificus là những vi khuẩn gây bệnh
chủ yếu [54].
1.2.2. Phân loại
Giới :
Vi khuẩn
Ngành :
Proteobacteria
Lớp
:
Gamma Proteobacteria
Bộ
:
Vibrionales
Họ
:
Vibrionaceae
Chi
:
Vibrio
Loài :
Vibrio parahaemolyticus
1.2.3. Hình thái và tính chất hóa sinh
Hình thái
Vibrio parahaemolyticus là trực khuẩn Gram âm, không có nha bào, kích
thƣớc rộng 0,5 đến 0,8 m và dài 1,4 đến 2,6 m. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm, chúng thƣờng mọc ở dạng thẳng hình que. Các phẩy khuẩn
thƣờng di dộng nhờ một lông dài ở đầu và thuộc dạng hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.
18
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Hầu hết các loài đều sinh oxidase, catalase và lên men đƣờng glucose mà không
sinh hơi. Đặc biệt V. vulnificus có kiểu hình tƣơng đối giống V. parahaemolytic.
Tuy nhiên có thể phân biệt hai loài này dựa vào đặc tính lên men đƣờng lactose và
khả năng sản sinh -D-galactosidase của V. vulnificus để phân biệt với V.
parahaemolyticus [54].
Tính chất khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng TCBS: khuẩn
lạc tròn, có đƣờng kính từ 3-5 mm, màu xanh dƣơng (do không lên men đƣờng
saccharose) [1].
Trên môi trƣờng Chrom: khuẩn lạc V. parahaemolyticus tròn, bóng, màu hoa
cà, đƣờng kính 3-5 mm.
Hình 1.1. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dƣới kính hiển vi điện tử
Tính chất hóa sinh
Tính chất sinh hóa quan trọng của Vibrio parahaemolyticus nhƣ bảng 1.1.
19
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Bảng 1.1. Tính chất hóa sinh của Vibrio parahaemolyticus
Oxidase
+
Glucose/Hơi
+/-
Lactose/H2S
-/-
Urease
-
Indole
+
Methyl Red (MR)
+
Voges-Proskauer (VP)
-
LDC (Lysine decarboxylase)
+
ADH (Arginin decarboxylase)
-
ODC (Ornithine decarboxylase)
+
Saccharose
-
Cellobiose
-
Salicin
-
Citrate
+
NaCl 0%
-*
NaCl 1%
+
NaCl 8%
+
NaCl 11%
-
*0-10% +
20
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
1.2.4. Đặc điểm sinh thái
V. parahaemolyticus thƣờng gặp ở thủy sản loại nhuyễn thể và giáp xác
trong nƣớc biển lẫn nƣớc ngọt, tuy nhiên vi khuẩn này thƣờng không lây truyền từ
ngƣời qua ngƣời. Các trƣờng hợp nhiễm Vibrio parahaemolyticus thƣờng xảy ra
vào mùa hè. Nguyên nhân là do các vi khuẩn này thƣờng đƣợc tìm thấy trên bề mặt
nƣớc ở các vùng duyên hải, trên cá và các động vật giáp xác vào mùa hè ấm áp, còn
trong những tháng mùa đông lạnh, V. parahaemolyticus lại có xu hƣớng nằm ở
trong lớp phù sa hoặc bùn ở đáy nƣớc nên khả năng gây nhiễm giảm. V.
parahaemolyticus có mặt ở khắp các vùng nƣớc ven biển mặc dù thể sinh bệnh
không thể hồi phục từ nƣớc ở vùng cửa biển trong suốt mùa đông ở nhiệt độ thấp
[65]. Chủng V. parahaemolyticus cũng đƣợc tìm thấy ở rất nhiều món ăn chế biến
từ hải sản ở Thái Lan, Hồng Kông, Indonesia và Việt Nam [61]. Trong suốt các
tháng mùa hè những năm 1960, ngộ độc thực phẩm do V. parahaemolyticus gây ra
chiếm gần một nửa các ca ngộ độc thức ăn ở Nhật Bản nơi có tập quán ăn hải sản
sống do vi khuẩn này có rất nhiều trên bề mặt nƣớc biển [65].
Vibrio parahaemolyticus có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-430C, nhiệt độ tối
ƣu là 370C, pH tối ƣu từ 7,8 đến 8,6. Vi khuẩn này có thể phát triển ở nồng độ muối
từ 0,5-10%, nồng độ muối tối ƣu là 3%. Có khả năng sống ở nƣớc đá, tuy nhiên số
lƣợng vi khuẩn giảm từ 10-100 lần [1]. Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt ở 650C
trong 10 phút và chết ở 0-50C.
Giới hạn phát triển của V. parahaemolyticus đƣợc tổng kết trong bảng 1.2
[46].
21
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Bảng 1.2. Các điều kiện tối ƣu
cho giới hạn phát triển của V. parahaemolyticus
Điều kiện phát triển tối ƣu
Giới hạn phát triển
37
5-43
pH
7,8-8,6
4,8-11
awc
0,981
0,940-0,996
3
0,5-10
Nhiệt độ (0C)
NaCl (%)
awc: hoạt độ nƣớc
Giới hạn nhiệt độ cho sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus là từ 5-430C
nên việc làm lạnh hải sản có ý nghĩa trong việc bảo vệ thực phẩm khỏi sự phát triển
của vi khuẩn và là biện pháp ƣu tiên hàng đầu trong việc bảo quản thực phẩm trƣớc
khi chế biến. Nếu để ở nhiệt độ thƣờng từ 20-350C trong 2-3 giờ, lƣợng vi khuẩn ít
ỏi 102 cfu/g ban đầu trong hải sản có thể tăng đến 105 cfu/g [46]. Gooch và cs [15]
đã chứng minh rằng tại vùng Vịnh ở Mỹ, tại nhiệt độ 260C, vi khuẩn này tăng sinh
một cách nhanh chóng ở hàu sống (1,7 log cfu/g trong 10h và 2,9 log trong 24 giờ).
Trong khi đó, nếu để ở tủ lạnh, con số này chỉ là 0,8 log cfu/g trong 14 giờ [15]. V.
parahaemolyticus sẽ chết dần ở nhiệt độ 470C, tốc độ chết này sẽ tăng nhanh hơn ở
nhiệt độ 600C nên nấu hải sản ở nhiệt độ trên 650C là cách hiệu quả để loại bỏ vi
khuẩn. Trong quá trình bảo quản lạnh, số lƣợng vi khuẩn ban đầu cũng sẽ giảm dần
tới một mức độ và duy trì ổn định trong một thời gian dài trong hải sản [46].
V. parahaemolyticus nhạy cảm với môi trƣờng axít và không phát triển ở pH
dƣới 4,8. V. parahaemolyticus cần phải có ion kiềm để tồn tại và phát triển và có thể
chịu đƣợc độ mặn lên tới 8% NaCl. Trong khi đó sức chịu đựng hoạt độ nƣớc tối
thiểu lại phụ thuộc vào lƣợng chất hòa tan trong dung dịch [59].
22
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
1.2.5. Tính chất kháng nguyên
Bảng 1.3. Các type huyết thanh của V. parahaemolyticus
O
K
1
1,25,26,32,38,41,56,58,64,69
2
3,28
3
4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65,72,73,75
4
4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67
5
5,15,17,30,47,60,61,68
6
6,18,46
7
7,19
8
8,20,21,22,39,70,74
9
9,23,44
10
19,24,52,66,71
11
36,40,50,51,61
12
52
13
72
Nhóm kháng nguyên K 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 19 có thể kết hợp với hai nhóm O
Vibrio parahaemolyticus có ba loại kháng nguyên H, O và K. Kháng nguyên
H có ở tất cả các chủng nhƣng ít có giá trị trong phân loại type huyết thanh. Kháng
nguyên K (kháng nguyên vỏ) bị hủy ở nhiệt độ 1000C trong 1 hoặc 2 giờ. Kháng
nguyên O (kháng nguyên thân) rất bền với nhiệt độ. Có tất cả 13 nhóm kháng
nguyên O và hơn 70 nhóm kháng nguyên K. Tuy nhiên do 7 kháng nguyên K có thể
kết hợp với 2 nhóm kháng nguyên O nên có tổng cộng 81 type huyết thanh (bảng
1.3). Định danh bằng huyết thanh học thƣờng không đƣợc dùng để phân lập V.
parahaemolyticus vì thử nghiệm này có thể xảy ra phản ứng chéo với rất nhiều các
vi khuẩn ƣa mặn khác. Tuy nhiên, trong quá trình điều tra vụ dịch, thử nghiệm này
vẫn có thể đƣợc sử dụng làm công cụ điều tra dịch tễ. Mặc dù có rất nhiều chủng
23
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
huyết thanh khác nhau của vi khuẩn này có thể gây bệnh, tuy nhiên O3:K6 là chủng
nổi trội nhất trong hầu hết các vụ dịch từ năm 1996 trên toàn thế giới [27].
1.2.6. Bộ gen của V. parahaemolyticus
Bộ gen của V. parahaemolyticus chứa hai chromosome bao gồm 3288558 bp
và 1877212 bp. Hai chromosome này có tổng cộng 4832 gen. Khi so sánh bộ gen
của V. parahaemolyticus với V. cholerae, các nhà khoa học đã nhận thấy có sự cấu
trúc lại ở bên trong mỗi chromosome và giữa hai chromosome này. Điều đặc biệt là
gen cho hệ thống tiết type III (TTSS) đã đƣợc tìm thấy ở bộ gen của V.
parahaemolyticus; đây là gen thƣờng thấy ở những vi khuẩn gây tiêu chảy nhƣ
Shigenlla, Salmonella và E. coli nhƣng V. cholerae không có những gen này. Gen
gây độc tdh có trọng lƣợng phân tử 42 000 bao gồm hai dƣới đơn vị 21 000 chủ yếu
nằm trên chromosome. Tuy nhiên, có một vài trƣờng hợp lại tìm thấy gen này nằm
trên plasmid. tdh mã hóa cho 189 axít amin, đây là các axít amin có chức năng ly
giải hồng cầu và một số các hoạt động sinh hóa khác. Gen gây độc trh khác gen tdh
ở sự thay đổi các base, tuy nhiên hai gen này có sự tƣơng đồng về tỷ lệ G-C khá
giống nhau. Cũng giống tdh, trh mã hóa một đoạn polypeptide dài 189 axit amin.
trh đƣợc tạo bởi hai dƣới đơn vị và có trọng lƣợng phân tử là 23 000 .
1.2.7. Độc tố và cơ chế gây bệnh
Có rất nhiều yếu tố gây độc đƣợc cho là có vai trò trong khả năng gây bệnh
của V. parahaemolyticus bao gồm: mối liên quan với ly giải hồng cầu beta, các
nhân tố bám dính, các loại enzyme và khả năng sản sinh độc tố của các gen tdh, trh
và ure. Trƣớc đây, khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus đƣợc cho là có liên
quan tới kiểu hình Kangawa (KP) [54]. Kato và cs [24] đã tiến hành nghiên cứu và
thấy rằng các chủng V. parahaemolyticus phân lập đƣợc từ phân của bệnh nhân
nhiễm trùng đƣờng ruột có khả năng ly giải hồng cầu trên môi trƣờng thạch máu có
nồng độ muối đặc biệt. Trong khi đó, các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ
hải sản hoặc môi trƣờng nƣớc mặn lại không có khả năng này. Wagatsuma [60] sau
24
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
đó đã thay đổi môi trƣờng thạch máu này để tránh việc nhầm lẫn với khả năng ly
giải hồng cầu của V. parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch 5% máu truyền thống.
Hầu nhƣ các chủng lâm sàng của V. parahaemolyticus phân lập đƣợc đều là KP
dƣơng tính, trong khi đó chỉ 1 đến 2% các chủng phân lập từ ngoại cảnh có kiểu
hình này [32, 33, 47, 48, 50]. Các nghiên cứu cho thấy khả năng ly giải hồng cầu có
thể do yếu tố ly giải hồng cầu trực tiếp chịu nhiệt TDH (thermostable direct
haemolysin) gây ra. Sở dĩ protein này đƣợc đặt tên nhƣ vậy vì nó không bị bất hoạt
bởi nhiệt độ (1000C trong 10 phút) và có khả năng trực tiếp ly giải hồng cầu bởi
hoạt tính ly giải của nó không đƣợc tăng cƣờng khi bổ sung lecithin. Kapper và cs
(1984) là những ngƣời đầu tiên tách dòng đƣợc gen mã hóa hóa cho protein TDH
(đƣợc định danh là tdh 1) từ chủng lâm sàng V. parahaemolyticus WP1. Các nhà
khoa học này sau đó đã sử dụng các đầu dò thu đƣợc từ gen này để tìm các gen tdh
ở các chủng V. parahaemolyticus khác. Tiếp theo sau, Hida và Yamamoto (1990) đã
phát hiện ra rằng V. parahaemolyticus WP1 còn có chứa một gen tdh thứ 2 riêng
biệt đƣợc định danh là tdh 2. Một nghiên cứu đƣợc thực hiện bởi Nishibuchi và
Kaper (1990) đã chỉ ra rằng tất cả các chủng V. parahaemolyticus KP dƣơng tính
(chủng lâm sàng) đều chứa 2 gen tdh [54]. Mặc dù hai gen này không tƣơng đồng
và các trình tự axít amin của gen sinh ra cũng khác nhau, nhƣng chúng lại có đặc
tính miễn dịch giống nhau [37]. TDH là yếu tố đƣợc nghiên cứu tập trung nhất và là
một yếu tố ly giải hồng cầu, gây độc, có khả năng làm chết chuột, gây ngộ độc
đƣờng ruột, gây hại cho tim và là độc tố gây phá vỡ màng tế bào [19].Trong khi đó,
các chủng V. parahaemolyticus lâm sàng hoặc ngoại cảnh có phản ứng ly giải hồng
cầu yếu hoặc trung bình trên thạch Wagatsuma chỉ có duy nhất 1 gen tdh. Khi xem
xét các chủng KP âm tính (hầu hết phân lập đƣợc từ môi trƣờng ngoại cảnh), 16%
các chủng này chứa 1 phiên bản gen tdh, các chủng còn lại không có gen này. Điều
này cho thấy, hầu hết các chủng KP âm tính không có khả năng sản xuất protein
TDH [35, 37]. Đôi khi, các chủng Vibrio khác nhƣ V. holisae, V. cholerae non O1
và V. mimicus cũng sở hữu gen tdh [37].
25
Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học
Nguyễn Hoài Thu
Tuy tầm quan trọng của phản ứng Kanagawa và protein TDH ở các chủng V.
parahaemolyticus đã đƣợc nghiên cứu chứng minh, các chủng V. parahaemolyticus
KP âm tính đôi khi vẫn gây ra các vụ tiêu chảy. Honda và cs (1987,1988) đã đƣa ra
báo cáo về một số chủng V. parahaemolyticus KP âm tính vẫn gây bệnh cho ngƣời.
Những chủng này có khả năng sản sinh ra một loại protein ly giải hồng cầu có liên
quan đến TDH và đƣợc định danh là TRH. Protein này gần giống nhƣng không
tƣơng đồng với protein TDH và đƣợc tìm thấy đầu tiên ở chủng V.
parahaemolyticus O3:K6 [54]. Thêm vào đó, protein ly giải hồng cầu mới này lại có
ở hầu hết các chủng ngoại cảnh phân lập đƣợc và có khả năng gây chết chuột thí
nghiệm khi tiêm vào màng bụng chuột [49]. Gen chỉ đạo việc tổng hợp ra protein
này đƣợc định danh là trh. Gen này cũng có hải biến thể là trh 1 và trh 2. Khi so
sánh tdh và trh, ngƣời ta nhận thấy trình tự nucleotid của hai gen này tƣơng đồng
tới 69%, điều này dẫn đến giả thuyết có thể hai gen này bắt nguồn từ một gen
chung [39]. Một số chủng lâm sàng chứa cả hai gen tdh và trh, trong khi đó các
chủng ngoại cảnh hầu hết đều không có hai gen này [62]. Trong một loạt các thí
nghiệm đột biến mất đoạn, các nhà khoa học đã làm mất một phần hoặc toàn bộ gen
trh và quan sát thấy hoạt tính ly giải hồng cầu của protein này không còn nữa. Tuy
nhiên, một cách nào đó, những đột biến này vẫn còn có khả năng gây độc tế bào
trên thực nghiệm và là nguyên nhân gây ra tình trạng tích nƣớc cục bộ ở đoạn thắt
của ruột non thỏ. Điều này cho thấy có những nhân tố gây độc khác ngoài TDH và
TRH có liên quan đến khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus. Tuy nhiên theo
khuyến cáo của CDC gần đây, các chủng V. parahaemolyticus không có cả hai gen
này vẫn có liên quan đến những ca nhiễm trùng với triệu chứng trầm trọng mà bệnh
nhân cần phải nhập viện [64].
Trƣớc kia, một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng “các nhân tố bám dính” đóng
một vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus. Hackney
và cs (1980) đã tìm ra các chủng V. parahaemolyticus lâm sàng và ngoại cảnh mà
họ tiến hành làm thí nghiệm có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột non của
thai nhi dù mức độ bám dính khác nhau. Các chủng phân lập đƣợc từ bệnh nhân có
26
