Nghiên cứu hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Phan Văn
Chi, Viện Công Nghệ Sinh Học, người thầy hướng dẫn chính trong nghiên cứu
của tôi. Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận GS đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo, định hướng và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn cũng như niềm đam
mê khoa học. Xin chân thành cảm ơn ông!
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Bích Nhi, TS. Lê Thị Bích Thảo
vì những góp ý quý báu cho quá trình làm luận văn cũng như những chia sẻ về
chuyên môn và kinh nghiệm sống. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ
phòng Hoá Sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh động viên
chia sẻ và ủng hộ tôi trong suốt thời gian làm việc tại phòng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trƣơng Quốc Phong cùng các thầy cô trong
Viện Công nghệ Sinh học và Thực Phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt
tình dạy bảo và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành được luận văn này. Xin chân
thành cảm ơn các anh, chị, em và các bạn lớp cao học CNSH 2010B đã luôn bên
cạnh giúp đỡ tôi.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân - những người đã luôn
động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2012
Học viên

Phạm Đức Đan

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Bản luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dựa trên cơ sở
nghiên cứu lý thuyết và khảo sát thực tế

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chính xác. Một phần số liệu
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của đồng tác giả.

Hà nội, ngày 29 tháng 3 năm 2012.
Học Viên

Phạm Đức Đan

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii
THUẬT NGỮ VIẾT TẮT .............................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ..................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ........................................ ix
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
1.1. GHÉP THẬN VÀ BIẾN CHỨNG THẢI GHÉP ..................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về ghép thận.................................................................................. 3
1.1.2. Thải ghép- phân loại và chẩn đoán ........................................................................... 4
1.1.2.1. Nguyên nhân và cơ chế thải ghép. ......................................................................... 4
1.1.2.2. Phân loại thải ghép ............................................................................................... 5
1.1.2.3. Thải ghép cấp tính ................................................................................................ 6
1.1.2.4. Chẩn đoán thải ghép ............................................................................................. 9
1.2. NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU ........................................................ 10
1.2.1. Vai trò của nước tiểu trong y học ........................................................................... 10

1.2.2. Tính chất và thành phần của nước tiểu .................................................................. 11
1.2.3. Ưu và nhược điểm trong nghiên cứu nươc tiểu ....................................................... 12
1.2.4.1. Ưu điểm của nước tiểu ........................................................................................ 12
1.2.4.2. Nhược điểm của nước tiểu .................................................................................. 13
1.2.4. Hệ protein nước tiểu .............................................................................................. 13
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU.............. 14
1.3.1. Các kỹ thuật nghiên cứu proteomics ...................................................................... 14
1.3.1.1. Các kỹ thuật phân tách protein ........................................................................... 14
1.3.1.2. Khối phổ - Trung tâm của proteomics ................................................................ 16
1.3.1.3. Các phần mềm tin sinh học ................................................................................ 18
1.3.1.4. Các cơ sở dữ liệu về trình tự gen và protein ....................................................... 19
1.3.2. Tiếp cận proteomis trong chẩn đoán bệnh thận ....................................................... 19
1.3.2.1. Xu hướng nghiên cứu .......................................................................................... 19
1.3.2.2. Proteomics trong nghiên cứu thải ghép thận cấp tính.......................................... 20
1.3.2.3. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................................... 22

iii


1. 4. MỤC ĐÍCH CỦA NGHIÊN CỨU ........................................................................ 23
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................................. 25
2.1. VẬT LIỆU .............................................................................................................. 25
2.1.1 Hóa chất ................................................................................................................. 25
2.1.2. Trang thiết bị chính ................................................................................................ 25
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 26
2.2.1. Thu thập mẫu nước tiểu ......................................................................................... 26
2.2.2. Thu nhận hệ protein nước tiểu bằng ProteoSpinTM Urine Protein Concentration
Micro Kit ........................................................................................................................ 27
2.2.3. Xác định hàm lượng protein ................................................................................... 27
2.2.4. Điện di SDS-PAGE ............................................................................................... 28

2.2.5. Điện di 2-DE protein nước tiểu. ............................................................................. 29
2.2.6. Thủy phân protein bằng enzym trypsin trong gel.................................................... 30
2.2.7. Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ .................................................................... 30
2.2.8. Nhận diện protein trên cơ sở dữ liệu SwissProt bằng phần mềm Mascot v1.8 ......... 33
2.2.9. Phân loại protein nước tiểu bằng các công cụ tin sinh học. .................................... 34
2.3. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................................................... 35
Chƣơng III. KẾT QUẢ ................................................................................................. 36
3.1. XỬ LÝ MẪU........................................................................................................... 36
3.2. ĐIỆN DI HAI CHIỀU VÀ NHẬN DIỆN HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU .............. 37
3.2.1. Điện di 2-DE hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp
tính .................................................................................................................................. 37
3.2.2. Nhận diện các vùng điểm protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải
ghép cấp tính bằng hệ 1D nanoLC MS/MS ...................................................................... 39
3.3. PHÂN TÍCH TỔNG THỂ HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU BỆNH NHÂN GHÉP
THẬN CÓ BIẾN CHỨNG THẢI GHÉP CẤP TÍNH .................................................. 40
3.3.1. Phân đoạn hệ protein nước tiểu bằng điện di SDS-PAGE ....................................... 40
3.3.2. Nhận diện hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp
tính .................................................................................................................................. 41
3.3.3. Phân tích hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính
nhận diện được ................................................................................................................ 43
3.3.3.1. Protein có nồng độ cao trong nước tiểu .............................................................. 43
3.3.3.2. Protein có nồng độ thấp trong nước tiểu ............................................................. 46

iv


3.4. XÁC ĐỊNH MỘT VÀI PROTIEN LIÊN QUAN ĐẾN THẢI GHÉP THẬN CẤP
TÍNH .............................................................................................................................. 49
3.4.1. Beta-2-microglobulin ............................................................................................. 49
3.4.2. Uromodulin ........................................................................................................... 50

3.4.3. Zinc-alpha-2-glycoprotein...................................................................................... 51
Chƣơng IV. THẢO LUẬN ............................................................................................ 53
4.1. LỰA CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 53
4.2. XỬ LÝ MẪU........................................................................................................... 53
4.3. VAI TRÕ CỦA CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC .......................................................... 54
4.4. NƢỚC TIỂU- NGUỒN TÌM KIẾM CHỈ THỊ KHÔNG XÂM LẤN ................... 55
4.5. KỸ THUẬT ĐIỆN DI MỘT CHIỀU, HAI CHIỀU KẾT HỢP KHỐI PHỔ (ESIMS/MS) .......................................................................................................................... 56
4.6. XÂY DỰNG BẢN ĐỒ HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU BỆNH NHÂN THẢI GHÉP
THẬN CẤP TÍNH ......................................................................................................... 57
4.7. MỘT VÀI PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN THẢI GHÉP THẬN CẤP TÍNH ....... 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 62
Kết luận........................................................................................................................... 62
Kiến nghị ........................................................................................................................ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 63
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 75

v


THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
1-DE

One-dimensional electrophoresis

Điện di một chiều

2-DE

Two-dimensional electrophoresis

Điện di hai chiều

2DnanoLC

Two-dimensional nano liquid
chromatography

ACN

Acetonitrile

ai chiều
Acetonitrile

amu

Atomic mass unit

Đơn vị khối lượng nguyên tử

APC

Antigen- presenting cells

APS

Ammonium persulfate

Các tế bào trình diện kháng
nguyên

Ammonium persulfate

Da

Dalton

Dalton

DTT

Dithiothreitol

Dithiothreitol

EBI

European Bioinformatics Institute

Viện Tin sinh học Châu Âu

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa bằng phương pháp phun
điện

FA

Formic acid

Acid formic

HLA

Human Leucocyte Antigen

Kháng nguyên bạch cầu người

HPLC

High performent liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HUPO

Human Proteome Organization

Tổ chức hệ protein người

IAA

Iodoacetamide

Iodoacetamide

ICAM-1

Intercellular adhesion molecule 1

Phân tử adhesion gian bào 1

IEF

Isoelectric focusing

Điện di đẳng điện

IPG

immobilized pH gradient

Gradien pH cố định

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

vi

Sắc kỷ lỏng nano hai chiều


kV

Kilo Volt

Kilo Volt

m/z

Mass to charge ratio

Tỷ lệ khối lượng/điện tích

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

MS/MS

Tandem mass spectrometry

Khối phổ liên tục

NanoLC

Nano liquid chromatography

Sắc ký lỏng nano

NCBI

National Center for Biotechnology Trung tâm quốc gia về thông tin

Information
Công nghệ sinh học

PDB

Protein data bank

Ngân hàng dữ liệu protein

pI

Isoelectric point

Điểm đẳng điện

RP

Reversed phase

Ngược pha

SCX

Strong cation exchange
chromatography

Sắc ký trao đổi cation mạnh

SDSPAGE

Sodium dodecyl sulphate
Điện di biến tính trên gel
polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide

TCR

T cell receptor

Thụ thể tế bào T

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

TFA

Trifluoroacetic acid

Axít trifluoroacetic

TOF

Time-of-Flight

Thời gian bay

w/v

Weight/volumn

Khối lượng/thể tích

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1: Bảng phân loại thải ghép ...................................................................................... 5
Bảng 2: Hàm lượng một số chất trong máu và trong nước tiểu ........................................ 11
Bảng 3: Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE .................................................. 28
Bảng 4. Các thông số của hệ sắc ký lỏng nano ................................................................. 32
Bảng 5. Danh sách các protein được nhận diện trong nước tiểu bệnh nhân ghép thận có
biến chứng thải ghép cấp tính. ......................................................................................... 39
Bảng 6. Danh sách protein nồng độ cao trong nước tiểu bệnh nhân thải ghép thận cấp tính.44
Bảng 7. Danh sách 132 protein được nhận diện trong nước tiểu bệnh nhân ghép thận có
biến chứng thải ghép cấp tính. ......................................................................................... 75

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình 1: Thận mới được ghép cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối ................................. 4
Hình 2. Các phân tử co-stimulatory trong APC và phối tử của chúng trong tế bào T .......... 7
Hình 3. Các phân tử adhesion gian bào và phân tử adhesion tế bào mạch máu ................... 8
Hình 4 . Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE ........................................................ 15
Hình 5. Hệ thống sắc ký lỏng nanoLC (Dionex) .............................................................. 16
Hình 6. Sơ đồ cấu tạo đơn giản của hệ thống khối phổ ..................................................... 17
Hình 7. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS.................................................... 18
Hình 8. Hệ sắc ký lỏng nano đa chiều kết nối trực tuyến khối phổ QSTAR XL................ 26

Hình 9. Sơ đồ hoạt động của hệ sắc ký lỏng nano da chiều .............................................. 31
Hình 10. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 ................................... 33
Hình 11. Dự đoán chức năng, vị trí protein trên cơ sở dữ liệu với GO .............................. 34
Hình 12. Quy trình phân tích hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải
ghép cấp tính ................................................................................................................... 35
Hình 13. Điện di đồ kết quả tinh sạch hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến
chứng thải ghép cấp tính bằng proteospinTM Urine protein Concentration Micro kit. ...... 36
Hình 14 : Ảnh điện di 2 chiều hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải
ghép cấp tính. .................................................................................................................. 38
Hình 15: Điện di đồ và phân đoạn cắt gel ........................................................................ 41
Hình 16. Điểm số của các protein theo thuật toán Mowse với mức ý nghĩa P<0,05 .......... 42
Hình 17. Minh họa kết quả nhận dạng protein trong nước tiểu bệnh nhân thải ghép thận cấp
tính bằng phần mềm Mascot v1.8 ................................................................................... 43

ix


Hình 18. Biểu đồ phân loại proteome nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải
ghép cấp tính có nồng độ thấp ......................................................................................... 47
Hình 19. Kết quả nhận diện Beta-2-microglobulin trên cơ sở dữ liệu Swiss-Prot............. 50
Hình 20. Trình tự amino acid của Beta-2-microglobulin với số đăng ký B2MG_HUMAN50
Hình 21. Kết quả nhận diện Uromodulin trên cơ sở dữ liệu Swiss-Prot ............................ 51
Hình 22. Trình tự amino acid của Uromodulin với số đăng ký UROM_HUMAN ............ 51
Hình 23. Kết quả nhận diện Zinc-alpha-2-glycoprotein trên cơ sở dữ liệu Swiss-Prot ...... 52
Hình 24. Trình tự amino acid của Zinc-alpha-2-glycoprotein với số đăng ký
ZA2G_HUMAN ............................................................................................................. 52

x

Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

MỞ ĐẦU
Ghép thận là một trong những phương pháp điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân
suy thận giai đoạn cuối. Tuy nhiên ghép thận cũng luôn đi kèm với những rủi ro
đáng kể như nhiễm trùng, thải ghép… Trong đó thải ghép cấp tính là mối đe dọa lớn
với thận mới được ghép, điều này đồng nghĩa với việc sẽ ảnh hưởng đến sự sống
còn của bệnh nhân. Nếu được phát hiện và điều kịp thời thì thải ghép cấp tính có thể
dần ổn định. Ngày nay, với sự tiến bộ của các ngành khoa học kỹ thuật y tế đã phát
triển nhiều phương pháp xét nghiệm hiệu quả như xác định Creatinine huyết thanh,
tốc độ lọc cầu thận và đặc biệt kỹ thuật sinh thiết mô đã đem lại những hiệu quả
nhất định cho việc theo dõi diễn biến của thận ghép. Tuy nhiên phương pháp này
cũng bộc lộ những nhược điểm lớn như xác định ở giai đoạn muộn, xâm lấn vào cơ
thể bệnh nhân. Do đó cần phát triển một phương pháp có độ nhạy cao, đặc hiệu và
đặc biệt không xâm lấn để xác định sớm dấu hiệu thải ghép.
Trong những thập niên gần đây, proteomics nổi lên như một phương pháp tìm kiếm
chỉ thị sinh học hiệu quả. Với lợi thể có thể xác định được những thay đổi về mặt
sinh lý, sinh hóa của đối tượng nghiên cứu thông qua hệ protein trong dịch cơ thể
thì phương pháp này hứa hẹn đạt được nhiều thành tựu to lớn. Nghiên cứu sự biểu
hiện của hệ protein trong dịch của cơ thể như huyết thanh, nước mắt, nước bọt,
nước tiểu sẽ đem lại những hiểu biết nhất định về cơ chế bệnh sinh. Trong số đó
nước tiểu được coi là mẫu nghiên cứu hấp dẫn do một số lợi thế mà các mẫu khác
không có. Trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng proteomics
trong nghiên cứu hệ protein nước tiểu để phát hiện thải ghép, tuy nhiên những kết
quả này còn tồn tại những hạn chế nhất định. Tại Việt Nam hiện chưa có công trình
nào nghiên cứu về lĩnh vực này. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu hệ
protein nƣớc tiểu bệnh nhân ghép thận có biến chứng thải ghép cấp tính” nhằm
xác định, phân loại, tìm hiểu được hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận có biến

chứng thải ghép cấp tính. Nhận dạng những protein liên quan đến thải ghép cấp tính
và tìm hiểu biểu hiện cũng như mối liên quan của những protein này.

1


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Nội dung nghiên cứu:
 Xây dựng phương pháp và áp dụng các kỹ thuật proteomics trong nghiên cứu
 Biểu hiện hệ protein nước tiểu bệnh nhân ghép thận bị thải ghép cấp tính bằng
điện di hai chiều.
 Phân tích tổng thể, phân loại và phát hiện các protein liên quan đến bệnh.

2


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GHÉP THẬN VÀ BIẾN CHỨNG THẢI GHÉP
1.1.1. Giới thiệu chung về ghép thận
Theo thống kê của Hội Thận học Quốc tế trên thế giới hiện nay có đến trên 500
triệu người (tức khoảng 1/10 người trưởng thành) có tổn thương thận ở một mức độ
nào đó ( Bệnh thận mạn tính trở thành một
gánh nặng cho xã hội và gia đình người bệnh do nhu cầu về dịch vụ y tế ngày càng

tăng. Kết quả thu được từ nghiên cứu khảo sát về tình hình sức khoẻ và dinh dưỡng
toàn dân tiến hành ở Hoa Kỳ cho thấy trong giai đoạn từ 1999 đến 2006 tần suất
hiện mắc bệnh thận mạn tính giai đoạn 1 đến 4 là 26 triệu người trên tổng số khoảng
200 triệu người ở độ tuổi từ 20 trở lên; trong số này 65,3% là bị bệnh ở giai đoạn 34. Tần suất hiện mắc bệnh thận mạn tính trong cộng đồng cũng tăng thêm 30% từ
1994 đến 2006 [68]. Tại Việt nam, mặc dù chưa có thống kê đầy đủ trên toàn quốc
về tình hình bệnh thận mạn tính, theo Niên Giám 2003 của Bộ Y tế ước tính tần suất
hiện mắc suy thận giai đoạn cuối ở Việt nam là khoảng 206,5 người trên 1 triệu dân,
có nghĩa là có khoảng trên 18000 người bị suy thận giai đoạn cuối có nhu cầu điều
trị thay thế thận một năm. Ngày nay, nhiều phương pháp điều trị khác nhau được áp
dụng cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối như thẩm phân phúc mạc hay lọc máu
nhưng ghép thận được coi là phương pháp điều trị tối ưu.
Ghép thận là một trong những thành tựu to lớn của nền y học hiện đại. Nó cần đến
sự hiểu biết sâu sắc của liên ngành khoa học y học như phẫu thuật học, bệnh thận
học và miễn dịch học. Không có liệu pháp chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân
suy thận giai đoạn cuối cho đến khi Joseph Muray thành công trong việc cấy ghép
thận người đầu tiên năm 1954 và phương pháp lọc máu bằng chạy thận nhân tạo
cũng được phát triển cùng thời [54]. Kể từ đó, nhiều khám phá quan trọng trong
miễn dịch học và sự cải tiến các phương pháp phẫu thuật đã mở đường cho những
thành công trong lĩnh vực cấy ghép thận ngày nay.

3


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 1: Thận mới đƣợc ghép cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối [99]

Tuy nhiên, một trở ngại lớn trong ghép thận đó là các biến chứng hậu ghép. Thải

ghép là một biến chứng nguy hiểm và ảnh hưởng trực tiếp đến sự tồn tại của mô
ghép cũng như sự sống còn của bệnh nhân.
1.1.2. Thải ghép- phân loại và chẩn đoán
1.1.2.1. Nguyên nhân và cơ chế thải ghép.
Thải ghép là hiện tượng đáp ứng miễn dịch của người nhận chống lại mô ghép mà
cơ thể coi là mô ngoại lai. Cơ chế phân tử của thải ghép rất phức tạp và cho đến nay
sự hiểu biết của các nhà khoa học vẫn còn nhiều hạn chế. Thải ghép do hai cơ chế
đáp ứng miễn dịch gây ra là cơ chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian thể dịch và cơ
chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Thải ghép do đáp ứng miễn dịch qua
trung gian thể dịch tế bào B dựa trên cơ sở có sẵn kháng thể chống lại phân tử HLA
của thể cho được biểu hiện qua cấy ghép và bản thân nó có những hoạt động bất
thường với độ rủi ro cao có thể làm hỏng mô ghép [59]. Thải ghép do đáp ứng miễn
dịch qua trung gian tế bào tế bào T được mô tả tả bởi quá trình thâm nhiễm gây
viêm của mô ghép bởi tế bào đơn nhân.
Thận ghép bị lỗi ngay trong năm đầu của quá trình cấy ghép được gọi là thải ghép
cấp tính. Ngày nay, nguyên nhân của thận ghép bị lỗi trong năm đầu tiên có liên
quan đến quá trình hình thành vết sẹo tiến tới mãn tính của mô thận được gọi là ―
Bệnh thận mãn tính sau ghép‖ hoặc ― thải ghép mãn tính‖ [86]. Các nguyên nhân

4


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

ảnh hưởng đến sự tồn tại của thận ghép bao gồm: tổn thương ống thận, ảnh hưởng
độc tố của thuốc điều trị đặc biệt từ các nhân tố ức chế calcineurin, mô ghép nhiễm
virut, và các nhân tố liên quan đến chất lượng thận ghép như thời gian thiếu máu
lạnh đông kéo dài [38] tuổi của người cho lớn, hoặc mô ghép của người cho đã tử

vong. Do đóng vai trò lớn trong việc tồn tại của thận ghép nên việc xác định các
triệu chứng và điều trị kịp thời là nhiệm vụ vô cùng quan trọng đối với những bệnh
nhân ghép thận. Việc phát hiện sớm và chính xác thải ghép là một phần quan trọng
trong những nỗ lực để các bệnh nhân ghép thận hạn chế thấp nhất việc sử dụng
thuốc ức chế miễn dịch.
1.1.2.2. Phân loại thải ghép
Thải ghép được phân loại lâm sàng trên cơ sở thời gian biểu hiện thành tối cấp, diễn
tiến nhanh, cấp và thải ghép mãn tính. Phân loại này không dựa trên cơ sở miễn
dịch hay cơ chế bệnh lý [16].
Bảng 1: Bảng phân loại thải ghép

Loại thải ghép
Thải ghép tối cấp

Thời gian

Nguyên nhân

Sau vài phút hoặc vài giờ Có sẵn kháng thể IgG và
kháng thể kháng HLA lớp I

Thải ghép cấp diễn

Sau 24 giờ đến 4 ngày

tiến nhanh

Tạo kháng thể do đáp ứng trí
nhớ miễn dịch

Thải ghép cấp
Dịch thể

Ngay tuần đầu

Do kháng thể

Tế bào

Từ tuần thứ hai

Do tế bào

Thải ghép mãn tính

Nhiều tháng đến nhiều

Cơ chế miễn dịch và không

năm sau

miễn dịch

Thải ghép cấp tính cao (tối cấp): Xảy ra vài phút hoặc vài giờ sau phãu thuật cấy
ghép. Nó gây ra bởi kháng thể có sẵn chống lại HLA của thể cho hoặc kháng
nguyên ABO bám vào màng trong mạch máu của thận ghép.

5

Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Thải ghép diễn tiến nhanh: Xảy ra trong khoảng từ 2 đến 5 ngày sau khi cấy ghép.
Nó gây ra bởi sự nhạy cảm với kháng nguyên của thể cho. Thông qua truyền máu,
mang thai hoặc ghép thận trước đó mà kháng nguyên được trình diện làm cho bộ
nhớ phản ứng dẫn đến sự tích tụ một cách nhanh chóng kháng thể và độc tố tế bào T
chống lại kháng nguyên đó.
Thải ghép mãn tính: là thuật ngữ được sử dụng để mô tả quá trình hình thành mô
sẹo mãn tính với việc gây hại cho chức năng thận ghép, xuất hiện ít nhất 3 tháng sau
ghép. Cả cơ chế miễn dịch và không miễn dịch đều tích tụ gây hại cho thận.
1.1.2.3. Thải ghép cấp tính
Thải ghép cấp tính được mô tả bởi sự thâm nhập các tế bào đơn nhân vào mô kẽ,
không chỉ bao gồm các hoạt động của tế bào lympho T mà còn ở các dạng thể con
khác nhau của tế bào T và tế bào B, tế bào NK, đại thực bào và neutrophils [51].
Các bước đầu tiên nhằm đáp ứng miễn dịch chống lại mô ghép, coi mô được ghép
như vật liệu bên ngoài bởi các tế bào T của người nhận. Thụ thể tế bào T (T cell
receptor, TCR) liên kết với phân tử MHC (Major histocompatibility complex) trên
bề mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên của thể cho (Antigen- presenting
cells, APC) và phát hiện ra phân tử MHC và peptide có mặt như ngoại lai. Cơ chế
này được gọi là allorecognition, và trình diện gây ra thải ghép qua trung gian tế bào.
Allorecognition xuất hiện bởi hai cơ chế khác nhau, được gọi là đường hướng trực
tiếp và đường hướng gián tiếp.
 Kết quả của đường hướng trực tiếp là việc chấp nhận phân tử MHC còn nguyên
trên bề mặt các tế bào của thể cho. Thêm vào đó, sự tăng cường của APCs của
thể cho đến hệ thống lymphoid của thể nhận và sự có mặt allorecognition của
các phân tử MHC ngoại lai. Cơ chế này ngay lập tức đã cho thấy sự khởi đầu
phức tạp của thải ghép cấp tính.
 Allorecognition theo đường hướng gián tiếp xuất hiện khi các phân tử tương hợp

của thể cho được tiếp nhận, xử lý và đưa ra như các peptide bởi kháng nguyên
thể nhận có mặt trong tế bào. Cơ chế này diễn ra trực tiếp nhưng kể từ khi APCs

6


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

của thể cho ban đầu được loại bỏ theo thời gian thì giới hạn sự ảnh hưởng dẫn
đến đường hướng trực tiếp. Con đường gián tiếp allorecognition chuyển qua thải
ghép mãn tính [15].
Dưới ảnh hưởng của các tín hiệu cùng một liệu pháp kích thích ( hình 2) tế bào T
nhận biết, hoạt động và tiết một mẫu chính xác cho phân bào [42].

Hình 2. Các phân tử co-stimulatory trong APC và phối tử của chúng trong tế bào T

[29]
Các phân bào này tăng sinh và tăng nhanh sự biệt hóa của các tế bào T sơ khai để
kích thích các tế bào, điều chỉnh hoạt động độc tố của các tế bào khác và các hoạt
động của đại thực bào. Các sản phẩm của Chemokines dẫn đến sự lựa chọn tế bào T
và tế bào đơn nhân trong cơ quan được cấy ghép. Tế bào đơn nhân thâm nhập vào
mô để gắn kết các phân tử (hình 3) phát triển thành đại thực bào và giải thoát các
enzyme cytolytic protease và các gốc tự do là nguyên nhân phá hủy mô.

7


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Hình 3. Các phân tử adhesion gian bào và phân tử adhesion tế bào mạch máu [25] .

Hơn nữa, chúng tiết ra các phân bào để tăng cường huy động các tế bào miễn dịch
và quá trình viêm nhiễm. Hoạt động độc tố tế bào T góp phần phá hủy mô bằng
cách trực tiếp gắn vào tế bào thể cho. Đầu tiên, chúng nhận ra các peptide ngoại lai
bởi phức hợp TCR-MHC. Chúng giải phóng các hạt nhỏ có chứa các phân tử độc tố
như granzyme và perforin. Các dạng perforin trong tế bào của thể cho, granzyme
làm phân mảnh DNA nội bào và apoptosis. Tiếp đó, con đường độc tố tế bào trọng
yếu thứ hai khởi đầu bằng gắn Fas và phối tử của nó. Fas ligand (FasL) được biểu
hiện trong tế bào T hoạt động trong quá trình viêm nhiễm trong suốt giai đoạn thải
ghép. Thụ thể Fas (CD95) biểu hiện trong tế bào thể cho và liên kết với vùng chết
nội bào. Trong trường hợp liên kết Fas-FasL, Caspases hoạt động khởi đầu
apoptosis trong tế bào đích [47].

8


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Phần lớn các giai đoạn thải ghép cấp tính có thể điều trị bằng thuốc ức chế miễn
dịch, đặc biệt khi chúng xuất hiện 6 tháng đầu tiên của quá trình cấy ghép. Sau khi
xuất hiện thải ghép cấp tính thì luôn đi kèm với những dự đoán không tốt cho thận
được ghép và cơ thể sẽ đáp ứng kém hơn với thuốc điều trị thải ghép. Phương pháp
lâm sàng tốt cho điều trị thải ghép là sử dụng corticosteroids liều cao trong khoảng
vài ngày, trong trường hợp không có nhân tố đáp ứng thì một kháng thể đơn dòng

hoặc đa dòng có thể được thêm vào. Tuy nhiên, mọi giai đoạn thải ghép đều đóng
góp vào sự phát triển của thải ghép mãn tính và hạn chế chức năng lâu dài của thận
ghép.
1.1.2.4. Chẩn đoán thải ghép
Trong những ngày đầu tiên sau khi cấy ghép, bệnh nhân được tăng cường
theo dõi với các chỉ số như: nhiệt độ, huyết áp, nhịp tim, lượng nước tiểu và trọng
lượng. Các thông số máu bao gồm số lượng tế bào, điện giải, creatinine huyết thanh,
nước tiểu và glucose máu được xác định hàng ngày để thông báo những thay đổi có
thể bị nghi ngờ là thải ghép. Sốt và tăng bạch cầu có thể là dấu hiệu của một phản
ứng miễn dịch đang diễn ra đối với thận ghép. Hấu hết các triệu chứng lâm sàng của
các giai đoạn thải ghép là hậu quả của suy giảm chức năng của thận ghép. Nếu thận
ghép bị lỗi không thể sản sinh nước tiểu, bệnh nhân sẽ tăng cân do giữ nước. Rối
loạn điện giải trong thành phần huyết thanh cũng được xem là khác thường so với
các chức năng thận hoạt động bình thường. Creatinine là một thông số quan trọng
để xác định sự lọc thải các chất thải của cơ thể từ thận. Bệnh thiểu máu có thể dựa
vào sự thiếu hụt erythropoietin, một hormone được sản xuất trong thận khỏe mạnh.
Kiểm tra siêu âm được thực hiện để xác định rối loạn ghép, mặc dù độ đặc hiệu và
độ nhạy trong nhận diện thải ghép cấp tính còn nhiều hạn chế, ngay cả với việc sử
dụng các chất hỗ trợ tiếng vang [21]. Nếu một bệnh nhân nghi ngờ có biểu hiện từ
chối cấp tính, sinh thiết sẽ được thực hiện để xác định chẩn đoán. Sự đánh giá mô
học của mô ghép là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán thải ghép và tìm kiếm sự khác
biệt hiệu quả nhất.

9


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Tại các bệnh viện, sự theo dõi sau cấy ghép chủ yếu dựa vào việc đi tiểu, creatinine
huyết thanh, nồng độ ure và ước tính tốc độ lọc cầu thận. Vô niệu hoặc tăng liên tục
các mức độ creatinine trong huyết thanh sẽ đi đến việc sử dụng kỹ thuật sinh thiết.
Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị lỗi để nhận ra thải ghép cấp tính sớm. Do đó,
một số bệnh viện đã thường xuyên thực hiện sinh thiết lại để phát hiện thải ghép
cấp. Cách tiếp cận này là tốt, tuy nhiên bị giới hạn vì những lý do khác nhau: lỗi lấy
mẫu do tính chất nguy hiểm của việc xâm lấn vào cơ thể và giới hạn kích thước
mẫu, chi phí cao, rủi ro về thao tác như chảy máu hoặc rò mối tĩnh mạch, và sự căng
thẳng cho bệnh nhân [80]. Vì vậy cần thiết để tìm kiếm các công cụ xác định thải
ghép cấp tính mà không xâm lấn.
1.2. NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU
1.2.1. Vai trò của nƣớc tiểu trong y học
Nước tiểu con người đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng.
Bác sỹ đã kiểm tra mẫu nước tiểu của bệnh nhân để chẩn đoán các rối loạn khác
nhau trong nhiều thế kỷ. Nhà triết học Hermogenes (thế kỷ thứ 5 trước công
nguyên) đã mô tả màu sắc và các thuộc tính khác nhau của nước tiểu như các chỉ thị
bệnh [39]. Nước tiểu được sản xuất bởi thận và cho phép cơ thể loại bỏ các chất thải
từ máu. Thận duy trì nội cân bằng toàn bộ cơ thể và sản xuất kích thích tố bao gồm
cả rennin và erythropoietin [53]. Thận của con người bao gồm một triệu đơn vị chức
năng được gọi là các nephron, có thể được chia thành 2 phần chức năng: cầu thận
đóng vai trò lọc từ sản phẩm huyết tương được gọi là nước tiểu loạt đầu, và ống
thận tái hấp thu hầu hết nước tiểu loạt đầu. Trong 24 giờ, khoảng 900 lít huyết
tương được chảy qua thận trong đó khoảng 150-180 lít được lọc. Tuy nhiên, hơn
99% nước tiểu loạt đầu được tái hấp thu. Phần còn lại (nước tiểu loạt cuối) ra khỏi
thận qua các niệu quản vào bàng quang. Do đó nước tiểu chứa đựng thông tin không
chỉ từ thận và đường tiết niệu mà còn từ các cơ quan khác thông qua huyết thanh,
thu được bằng cách lọc qua thận. Ở người khỏe mạnh 70% hệ protein nước tiểu bắt
nguồn từ thận và đường tiết niệu, trong khi còn lại 30% protein được lọc qua cầu
thận [90]. Do đó phân tích hệ proteome nước tiểu có thể cho phép xác định các chỉ

10


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

thị sinh học của cả niệu sinh dục và các bệnh khác của cơ thể. Nghiên cứu hệ
protein nước tiểu cung cấp một công cụ mạnh cho sự hiểu biết vấn đề về sinh lý và
bệnh lý thận. Nó sẽ giúp xác định, cung cấp đầy đủ hơn danh sách các protein từ các
vùng riêng biệt của thận, các tế bào, và bào quan, cũng như các protein tín hiệu.
Những công cụ này sẽ được sử dụng để xác định không chỉ các protein tham gia chu
trình truyền tín hiệu, mà còn những biến đổi của chúng qua thời gian. Protein được
xác định trong mô liên kết với các mô hình bệnh tật sẽ giúp hiểu biết rõ hơn về bệnh
thận và các bệnh thận khác. Những khám phá biomarker trong nước tiểu sẽ dẫn đến
việc nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh thận đặc biệt là các biến chứng sau ghép.
1.2.2. Tính chất và thành phần của nƣớc tiểu
Nước tiểu trong suốt, màu vàng nhạt, có tỉ trọng lớn hơn tỉ trọng của nước, ở người
là 1,01 - 1,02, độ pH = 5 - 6. Mỗi ngày đêm con người thải ra ngoài khoảng 1 - 1,5
lít nước tiểu chính thức. Số lượng nước tiểu thường luôn thay đổi, phụ thuộc vào
chế độ ăn uống, vào tuổi, thời gian trong ngày, vào nhiệt độ môi trường xung
quanh, thức ăn, đồ uống. Trời nắng, mồ hôi ra nhiều, lượng nước tiểu tạo ra ít. Buổi
tối ngủ, nước tiểu tạo ra ít và đặc. Ban ngày hoạt động, nước tiểu tạo ra nhiều nhưng
loãng.
Nước tiểu gồm 95 - 96% là nước và một ít chất khô (5-6%). Trong nước tiểu có
chứa nhiều chất hóa học như urê, axit uric, creatinin, natri, kali, lưu huỳnh,
photphat, sulfat, NaCl, Flo, Chì, và một số hoocmon với hàm lượng như sau (bảng
2)
Bảng 2: Hàm lƣợng một số chất trong máu và trong nƣớc tiểu

Chất

Nước
Ure
Axit uric
Glucoza

Tỷ lệ %
Trong
máu

Trong nƣớc tiểu

90-91
0,03
0,004
0,12

95-96
2,0
0,05
0

11

Tỷ số

1
65
12

-


Phạm Đức Đan

Protein

Luận văn thạc sỹ khoa học

7-8

0

-

K+
Na+
Photphat
Sulfat

0,02
0,32
0,009
0,002

0,15
0,35
0,15
0,18

7
1
16
90

Creatinin

0,001

0,075

75

1.2.3. Ƣu và nhƣợc điểm trong nghiên cứu nƣơc tiểu
1.2.4.1. Ưu điểm của nước tiểu
So với các dịch của cơ thể khác, nước tiểu có một số đặc điểm làm cho nó được ưu
tiên trong nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị sinh học: Đầu tiên, mẫu nước tiểu có thể
thu nhận được với số lượng lớn mà không phải sử dụng các kỹ thuật xâm lấn. Điều
này cho phép lấy mẫu lặp đi lặp lại của cùng một bệnh nhân trong suốt quá trình
theo dõi bệnh. Tính sẵn có của mẫu cũng cho phép dễ dàng đánh giá khả năng tái
sinh hoặc cải tiến mẫu trong phương pháp chuẩn bị mẫu. Thứ 2, các peptide nước
tiểu và các protein khối lượng phân tử thấp nói chung dễ hòa tan. Do đó hòa tan các
peptide và protein khối lượng phân tử thấp, một nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá
trình phân tích proteomics của tế bào hoặc mô nói chung được cải thiện. Hơn nữa,
những protein có khối lượng phân tử thấp (<30 kDa) có thể phân tích trong khối
phổ mà không cần thao tác bổ sung như thủy phân bằng enzyme trypsin. Thứ ba,
hàm lượng protein trong nước tiểu là tương đối ổn định có thể do thực tế là nước
tiểu được giữ lại ở bàng quang trong vài giờ, do đó làm giảm quá trình proteolytic
bởi các proteases có thể về cơ bản được hoàn thành cho đến thời điểm bài tiết. Điều
này trái ngược hẳn với huyết thanh là kích hoạt protease do đó sẽ phân giải các

protein trong quá trình thu thập mẫu [43]. Nghiên cứu từ hai phòng thí nghiệm độc
lập đã chỉ ra rằng hệ protein thay đổi không đáng kể khi nước tiểu được bảo quản 3
ngày ở 4°C và lên đến 6 giờ ở nhiệt độ phòng [77]. Ngoài ra mẫu nước tiểu còn có
thể lưu trữ vài năm ở -20°C mà không ảnh hưởng nhiều đến lượng protein có trong
đó. Tuy nhiên, sự xem xét này có thể không áp dụng đối với những ứng dụng đặc
biệt như những mô tả gần đây về cấu trúc mật độ thấp (exosome) nước tiểu có thể ít
ổn định [101]. Cuối cùng, như đã mô tả ở trên, không chỉ những thay đổi trong thận

12


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

và đường sinh dục được phản ánh bởi những thay đổi của hệ protein trong nước tiểu
mà còn thay đổi tại các vị trí, bộ phận khác.
1.2.4.2. Nhược điểm của nước tiểu
Nước tiểu có nhiều nhược điểm là phổ nồng độ của protein, peptide thay đổi khá
lớn. Tuy nhiên điều này có thể khắc phục được bằng tiêu chuẩn hóa dựa trên
creatinine [92]. Hoặc các peptide thường hiện diện trong nước tiểu (petide
keepinghouse) [78]. Ngoài ra, định nghĩa các chỉ dấu sinh học của một bệnh nào đó
trong nước tiểu là phức tạp bởi những thay đổi đáng kể hệ proteome trong ngày.
Những thay đổi này có thể xảy ra do một loạt các yếu tố như sự thay đổi trong chế
độ ăn uống, trao đổi chất, hoặc quá trình dị hóa, nhịp sinh học, tập thể dục, cũng
như mức độ tuần hoàn của các hormone khác nhau [23]. Sự lặp lại của bất kỳ phân
tích nào đều có sự sai khác do những thay đổi về mặt sinh lý này, thậm chí các
phương pháp phân tích chỉ ra độ lặp lại cao. Tuy nhiên, sự xuất hiện của những biến
đổi này đã giới hạn một phân đoạn nhỏ trong hệ protein nước tiểu, phần lớn vẫn
không bị ảnh hưởng bởi các quá trình này [96]. Đặc biệt, trong thực nghiệm xử lý

mẫu nước tiểu trước các thí nghiệm proteomics như điện di, sắc ký gặp những trở
ngại nhất định do thành phần nước tiểu có lẫn muối, ure và các chất thải loại khác
của cơ thể… Điều này có thể khắc phục được bằng những kỹ thuật xử lý mẫu khác
nhau.
1.2.4. Hệ protein nƣớc tiểu
Trong y học lâm sàng nước tiểu của người khỏe mạnh âm tính đối với prorein. Tuy
nhiên, với sự phát triển mạnh mẽ của các kỹ thuật proteomics thì những nghiên cứu
đã chỉ ra nước tiểu từ người khỏe mạnh có chứa một số lượng lớn các protein và
peptide. Ngày nay, những công bố mới nhất cho rằng số lượng các protein và
peptide được xác định trong nước tiểu vẫn còn tăng. Một trong những nỗ lực đầu
tiên để xác định hệ protein nước tiểu đã được công bố năm 2001 [83]. Sử dụng LCMS, các phân mảnh peptide của các mẫu nước tiểu đã được thủy phân bằng enzyme
trypsin được gộp lại phân tích và 124 protein đã được xác định. Trong khi nghiên
cứu này không được thiết kể để tìm kiếm chỉ thị sinh học trong nước tiểu của bệnh

13


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

tật, nó chỉ ra thông tin tiềm năng trong hệ protein nước tiểu và còn chỉ ra hướng tiếp
cận có thể khai thác trong đối tượng này. Năm 2004, bằng phương pháp điện di 2
chiều đã nhận ra được 1400 điểm protein khác biệt, khoảng 420 điểm được xác định
và 150 protein đơn nhất được chú giải [66]. Số lượng protein được nhận diện tăng
lên đáng kể năm 2006 là 1500 peptide bằng kết hợp điện di 1 chiều và sắc ký lỏng
ngược pha kết hợp với khối phổ [7], đã tiếp tục nhấn mạnh sự đa dạng và phức tạp
trong hệ protein nước tiểu con người. Trong một nghiên cứu gần đây năm (2008) đã
xác định được 100 000 peptide khác nhau và có ít nhất 5000 lặp lại với tần suất cao
[17]. Do đó nó được lưu trữ để nghiên cứu như một kho tàng tiềm năng về xác định

bệnh tật thông qua chỉ dấu sinh học mà không xâm lấn.
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ PROTEIN NƢỚC TIỂU
Proteomics – một thuật ngữ được sử dụng để chỉ tất cả những nghiên cứu về hệ
protein (Proteome) của một tế bào, mô, cơ quan hoặc cơ thể tại một thời điểm nhất
định. Khái niệm proteomics rất rộng, bao gồm các phương pháp tách chiết, tinh chế,
nhận dạng, định lượng protein, nghiên cứu cấu trúc thành phần, các cải biến sau
dịch mã, các tương tác protein – protein, và mối quan hệ, vai trò của protein với
nhau và với các thành phần khác trong tế bào.
1.3.1. Các kỹ thuật nghiên cứu proteomics
Proteomics ngày càng phát triển mạnh mẽ và trở thành công cụ không thể thiếu
nhằm tìm hiểu chức năng của protein, các hoạt động nội bào và cơ chế bệnh sinh.
Do proteome rất phức tạp và đa dạng, nên proteomics thường phải sử dụng nhiều
công cụ, phương pháp chuyên dụng phù hợp với nhu cầu và mục đích nghiên cứu.
Có 4 công cụ và kỹ thuật chính như: (i) kỹ thuật phân tách, (ii) công cụ nhận dạng
và định lượng protein, (iii) các công cụ tin sinh học, và (iv) các cơ sở dữ liệu
1.3.1.1. Các kỹ thuật phân tách protein
Điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi [44]. Trong phương pháp này, các phân tử
protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không đổi.

14


Phạm Đức Đan

Luận văn thạc sỹ khoa học

Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Dưới
tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau sẽ di chuyển
về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do

đó sự khác biệt về điện tích được loại trừ.
Điện di 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau.
Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI
bởi nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric focusing) trên một thanh
strip có giải gradient pH xác định (ví dụ dải pH 3-10). Chiều thứ hai, các phân tử
protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE)
(hình 4). Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i)
chiều thứ nhất theo điện tích và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
Mẫu protein

Thanh gel IPG

Chiều 1 IEF

Cân bằng mẫu

Chiều 2 SDS-PAGE

+

Hình 4 . Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE

Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric ponit) của các protein chính là cơ sở
của IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein
không di chuyển trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định. Thanh

15