Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus CyMV) (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------  ---------

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi
ĐỂ TẠ

D NG
I U

N Dendrobium CÓ KHẢ N NG

HẢ

HÁNG

NG Cymbidium mosaic virus)

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Công trình được hoàn thành tại:
TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP. HỒ CHÍ MINH
VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM

Người hướng dẫn khoa học: 1. T . DƯƠNG H

XÔ

2. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ

Phản biện 1: ......................................................................................

Phản biện 2: ......................................................................................

Phản biện 3: ......................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam ngày ..... tháng..... năm
201...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia
2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là một
giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử

dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự
trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam
trong nhiều năm qua. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm
sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một
trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu
và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa
lan thành phố trong năm 2015 (UBND Tp. Hồ Chí Minh, 2016). Tuy nhiên,
hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành
phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong
nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung
Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Việc nghiên cứu nâng cao năng
suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối
với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam.
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan,
trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất.
Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói
chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện
có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum
ringspot virus - ORSV) (Zettler và cs, 1990). Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus
CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam (Dũng và cs,
2009, Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007), và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus
CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs,
2009). Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam.
Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng
hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch.

1

Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh
chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn
với mức độ rất nghiêm trọng. Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh
virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá
trình sản xuất giống và canh tác. Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh
gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu
quả như mong muốn. Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được
nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo tính kháng virus cho cây bằng kỹ thuật
chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi).
Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ
thuật chuyển gen RNAi trên thế giới (Gottula và Fuchs, 2009). Việc nghiên
cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh
virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra
khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV
(Vân và cs, 2009), virus CMV (Vân và cs, 2008) và kháng đồng thời cả hai loại
virus TMV và CMV (Hà và cs, 2009); cà chua kháng virus TYLCV (Yến và cs,
2011); đu đủ kháng virus PRSV (Hà và cs, 2011), đậu tương kháng virus SMV
và BYMV (Thu và cs, 2014). Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào
được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV,
trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên
giống lan này.
Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá
hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để
tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan
Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và
sản lượng hoa lan.

2. Mục tiêu và yêu cầu
Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho lan Dendrobium trong điều
kiện nuôi cấy in vitro.

2


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây
bệnh trên lan. Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc
RNAi của gen CP và ORF2-4+CP từ virus CyMV vào mô lan (PLBs) bằng kỹ
thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens). Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu được giới
hạn trong điều kiện in vitro.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học
- Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân
lập từ virus CyMV tại Việt Nam.
- Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn A.
tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium.
- Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để
tạo ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung.
* Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus
CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo giống lan
kháng virus thông qua lai tạo.
5. Đóng góp mới của luận án
- Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus
CyMV tại Việt Nam.

- Khẳng định được tính khả thi của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc
tạo khả năng kháng virus cho lan Dendrobium.
- Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả năng kháng virus của cây
lan chuyển gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
- Tạo ra được các dòng lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus
trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống
lan kháng virus.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm có 107 trang chia thành các phần: Mở đầu (04 trang);
Tổng quan tài liệu (31 trang); Nội dung và Phương pháp nghiên cứu (18 trang);

3


Kết quả và Thảo luận (41 trang); Kết luận và Đề nghị (2 trang); và Danh mục
các công trình đã công bố (01 trang. Luận án gồm có 18 bảng số liệu; 40 hình
ảnh minh họa; và 88 tài liệu tham khảo bao gồm 13 tài liệu tiếng Việt và 75 tài
liệu tiếng Anh. Ngoài ra luận án còn bao gồm 5 phụ lục đính kèm.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Dendrobium Sonia là dòng lan lai được tạo ra từ tổ hợp lai Dendrobium
Caesar x Dendrobium Tomie Drake bởi tác giả Chittraphong, và được giới
thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 (Yang và cs, 2003). Đây là một loại hoa phù
hợp cho cả mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. So với nhiều loại lan
khác, nhu cầu của thị trường đối với hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không
ngừng gia tăng trong nhiều năm qua.
Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum
ringspot virus - ORSV) (Zetter và cs, 1990). Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus
CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam (Dũng và cs,

2009; Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007) và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus
CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs,
2009). Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam.
Sự can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) là hiện tượng im lặng gen
sau phiên mã do phân tử RNA mạch kép cảm ứng, được công bố ban đầu ở
giun tròn (Ceanorhabditis elegans) (Yamada và cs, 2007). Việc khám phá ra
RNAi đã cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu chọn giống cây trồng. RNAi hiện
diện như một công cụ mới đầy tiềm năng cho việc chọn giống cây trồng qua
việc áp dụng các đoạn trình tự RNA không mã hóa nhỏ, có khả năng kiểm soát
sự biểu hiện gen một cách chuyên biệt trình tự (Abhary và Rez, 2015). RNAi
cũng được xem là một cơ chế quan trọng để tạo ra khả năng kháng virus cho
cây trồng (Baulcombe, 2004). Hiệu quả của RNAi trong việc tạo ra khả năng
kháng virus lần đầu tiên đã được thông báo với kết quả kháng virus PVY
(Potato virus Y) ở khoai tây. Nhiều nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả
năng kháng các loại virus thực vật khác nhau đã được công bố (Abhary và Rez,

4


2015). Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả năng kháng
virus cho lan Dendrobium hiện còn rất hạn chế. Đối với nghiên cứu ở nước
ngoài, công trình duy nhất về vấn đề này đã được Chuphrom và cộng sự (2009)
công bố trên lan Dendrobium Sonia. Trong đó, nhóm tác giả đã chuyển cấu
trúc RNAi của gen CP từ virus CyMV vào PLBs bằng phương pháp bắn gen.
Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này chỉ mới dừng ở mức thu được các dòng
lan có mang gen CP. Còn nhiều vấn đề chưa được làm rõ như khả năng kháng
virus và tính ổn định của gen chuyển như thế nào, hiệu quả tạo ra tính kháng
virus khi áp dụng RNAi ra sao,… Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp bắn gen

để đưa gen mục tiêu vào tế bào cũng là một vấn đề cần được xem xét, vì các
cây chuyển gen được tạo ra bằng phương pháp bắn gen thường không có khả
năng sinh sản và di truyền gen chuyển theo luật Menden (Alimohammadi và
Bagherieh-Najjar, 2009). Đối với nghiên cứu trong nước, hiện vẫn chưa có
công trình nào được công bố về vấn đề ứng dụng RNAi để tạo khả năng kháng
virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan. Do đó, cần có những nghiên cứu
với nội dung, phương pháp hoàn thiện và phù hợp hơn để có thể tạo ra giống
lan Dendrobium có khả năng kháng virus phục vụ cho sản xuất.
Chương 2. NỘI DUNG

PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nội dung nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giả hành (thân) của cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành; mẫu lá lan
Dendrobium nghi nhiễm virus được thu thập từ vườn trồng lan.
- Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105, LBA4404, C58 mang vector
pCambia 1301.
- Các loại vector: pJET1.2, pENTRTM/D-TOPO®, pK7GWIWG2(II).
- Đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP dài 496 bp, được tổng hợp nhân tạo và gắn
vào vector pBSK/ORF2-4+CP.
- Các trình tự mồi dùng cho khuếch đại gen:
Mục đích

Tên mồi

Khuếch đại gen F-CCP
CP của virus
R-CCP
CyMV

Trình tự mồi

SP(bp)

5’- GGGATCCATGGGAGAGTCCACTCCAAC-3’
5’-GGAATTCTTATTCAGTAGGGGGTCCAGGC-3’

672

5


Kiểm tra gen F-pJET1.2 5’- CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC- 3’
trong
vector
R-pJET1.2 5 - AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG- 3’
pJET1.2

807

Khuếch
đại Fi-ORF2-4 5’- CACCGCGGCCAATATAAAGA- 3’
đoạn gen từ
vector pBSK
Ri-CCP
5’- AGTCGACGGCATCGAAGAAG-3’

500

Khuếch
đại F-CCP1
đoạn gen CP
R-CCP1

5’- CACCTGTCCGCCGCGCCTCTCTT- 3’

Kiểm tra gen trong F-M13
vector pENTR
R-M13

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’

Phát hiện virus F-C
CyMV
R-C

5’-GTCTCTGGAACATCTGCAAAGC-3’

Kiểm chứng PCR Primer #1
phát hiện gen
Primer #2

5’- AGTTCGAGCCTGATTATCCC-3’

5’- TCCGGCTAAGCATATTATGC-3’
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
5’-CCGCATCTTACGGAGGTAGC-3’
5’- GCATGCCGCCAGCGTTCATC-3’

450
780/820
257
297

2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành và
virus CyMV gây bệnh trên hoa lan.
Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs lan
Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens.
Nội dung 2: Nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen CP của virus
CyMV ở Việt Nam.
Nội dung 3: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen RNAi mang phân đoạn
gen CP và gen ORF2-4 của virus CyMV.
Nội dung 4: Nghiên cứu tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của
gen CP và gen ORF2-4+CP.
Nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan
chuyển gen bằng phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia
* Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs
Thực hiện thí nghiệm nuôi cấy để xác định các yếu tố: nồng độ Ca(OCl)2
(15-30%) để khử trùng đoạn thân mang chồi ngủ; nồng độ BA (0,1-0,5 mg/l),
NAA (0,5-5 mg/l) bổ sung vào môi trường MS để tạo PLBs từ lát cắt thân cây
lan in vitro và sự tăng sinh của PLBs.

6


* Xác định nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nuôi cấy và chủng vi

khuẩn thích hợp cho chuyển gen
Thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào PLBs với các yếu tố thay đổi: chủng
vi khuẩn (C58, EHA105, LBA4404), nồng độ AS (0-300 µM), thời gian nuôi
cấy. Đánh giá hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm GUS.
* Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs
Thực hiện thí nghiệm nuôi cấy PLBs trên môi trường MS bổ sung các nồng độ
khác nhau của cefotaxime (0-700 mg/l) hay kanamycin (0-700 mg/l), hygromycin
(0-15 mg/l) để loại vi khuẩn từ PLBs hay sàng lọc PLBs chuyển gen.
2.2.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của CyMV
* Phân lập gen CP của CyMV ở các tỉnh của Việt Nam
Tiến hành ly trích RNA virus từ mẫu lá (Berendzen và cs, 2005) và thực hiện
phản ứng RT-PCR với cặp mồi được thiết kế để khuếch đại toàn bộ gen CP.
* Dòng hóa gen CP phân lập được vào vi khuẩn
Gen CP được gắn vào vector pJET1.2 và biến nạp vào tế bào E.coli. Sàng
lọc tế bào mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB + 100 mg/l ampicilin.
Kiển tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi pJET1.2 và enzyme cắt hạn chế
BamHI và EcoRI (nằm ở 2 đầu vị trí gắn gen).
* Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng
Vector mang gen được giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST.
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi
* Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen mục tiêu
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP (450 bp) và gen ghép nối
ORF2-4+CP (500 bp), gắn vào vector và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli.
Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB + 50mg/l
kanamycin. Kiểm tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi M13 và enzyme cắt hạn
chế SalI (trên gen) và NotI (trên vector).
* Thiết kế vector RNAi và biến nạp vào A. tumefaciens
Thực hiện phản ứng tái tổ hợp giữa vector pENTR và pK7GWIWG2(II) để
đưa gen mục tiêu vào vector pK7GWIWG2(II) bằng kỹ thuật Gateway. Sản
phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coli và sàng lọc trên môi trường

LB + 100 mg/l spectinomycin. Kiểm tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi M13
và enzyme cắt hạn chế XbaI và HindIII (nằm trên vector). Biến nạp vector tái
tổ hợp vào A. tumefaciens C58 và sàng lọc trên môi trường LB + 50 mg/l
ampicilin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin.

7


2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi
* Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs bằng A. tumefaciens
Lây nhiễm PLBs với A. tumefaciens C58 mang vector RNAi, nuôi cấy trên
môi trường MS + 0,3 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 100 M AS trong 3 ngày, loại
vi khuẩn với 300 mg/l cefotaxime. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển với
500 mg/l kanamycin và kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR.
* Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển
PLBs mang cấu trúc gen chuyển được nuôi cấy trên môi trường ½ MS để
thu nhận cây lan hoàn chỉnh.
2.2.5. Đánh giá khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen
Ly trích dịch virus từ mẫu lá lan nhiễm virus, lọc vô trùng và tiêm vào cây
lan trong điều kiện in vitro để lây nhiễm. Đánh giá khả năng kháng virus của
cây lan bằng quan sát hình thái và phản ứng RT-PCR.
2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu
nghiên cứu được được phân tích ANOVA, so sánh khác biệt ở mức p< 0,05 và
phân hạng (nếu có) theo Duncan bằng phần mềm SPSS.
2.2.7. Điều kiện nuôi cấy
Mẫu thực vật được nuôi cấy ở điều kiện: ánh sáng 2.500  500 lux, thời gian
chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 25  2oC, ẩm độ 55  5%. Vi khuẩn được nuôi
cấy trong tối, nhiệt độ 28oC (A. tumefaciens) hay 37oC (E. coli), lắc 200 vòng/phút.
2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ 01/2011-12/2015 tại Trung
tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN
3.1.1. Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs
* Nồng độ chất khử trùng để tạo mẫu cấy in vitro
Sau 14 ngày, tỉ lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nhất ở nồng độ 25%. Việc tiếp
tục tăng nồng độ Ca(OCl)2 lên mức cao hơn 25% không làm tăng mà làm giảm
tỷ lệ mẫu sống vô trùng (Bảng 3.1).
Như vậy, Ca(OCl)2 25% thích hợp cho khử trùng mẫu. Chồi ngủ từ các
mẫu cấy tăng trưởng thành chồi sau 8 tuần (Hình 3.1).

8


Bảng 3.1. Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ
sống vô trùng sau 14 ngày nuôi cấy.
Thời Nồng độ Tỷ lệ mẫu
Nghiệm
Chứng
âm. gian Ca(OCl) sống vô
2
thức
(phút)
(%)
trùng (%)
1
15
40,00b
2

20
50,00b
20
3
25
70,00a
4
30
46,70b
ANOVA
*
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.
*

1cm

A

Hình

3.1.

1 cm

B

Chồi

ngủ

lan

Dendrobium Sonia tăng trưởng
trên môi trường MS sau 4 (A) và
8 (B) tuần nuôi cấy.

ôi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro

Sau 4 tuần nuôi cấy, ở tất cả các môi trường đều có sự cảm ứng của lát cắt
mô thân với các biểu hiện như lát cắt vẫn giữ được màu xanh và có sự gia tăng
kích thước (phồng lên) so với ban đầu. Tỷ lệ mẫu cảm ứng tương đối thấp
(26,67%) và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in
vitro cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy.
Nghiệm
thức
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

14
15
ANOVA

Nồng độ (mg/l)
BA
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

NAA
0,5
1
2
3
5
0,5
1

2
3
5
0,5
1
2
3
5

Tỷ lệ mẫu mẫu cảm ứng
với môi trường
13,33
20,00
6,67
13,33
13,33
13,33
20,00
13,33
13,33
26,67
26,67
26,67
13,33
26,67
20,00
NS

NS: Không có sự khác biệt ở mức p < 0,05.

9


Đến 6 tuần nuôi cấy, bắt đầu có sự hình thành cấu trúc mới từ các lát cắt. Tuy
nhiên, chỉ có môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5 hay 1,0
mg/l phù hợp cho lát cắt tạo PLBs và tiếp tục nhân lên (Hình 3.2 - K, L).

A

H

B

I

C

D

J

K

F

E

L

M

G

N

O

1 cm

Hình 3.2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt thân Dendrobium Sonia trên môi
trường MS bổ sung BA và NAA, sau 6 tuần. (A - E). 0,1 mg/l BA + 0,5, 1, 2,
3, và 5 mg/l NAA, (F – J). 0,3 mg/l BA + 0,5; 1; 2; 3 và 5 mg/l NAA, (K – O).
0,5 mg/l BA + 0,5; 1; 2; 3 và 5 mg/l NAA.
*

ôi trường cho tăng sinh và phát triển PLBs

Sau 10 tuần, ở các môi trường đều có sự tăng sinh PLBs. Trong đó, môi
trường có 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất. Số lượng và trọng
lượng PLBs trên môi trường này cao hơn so với các môi trường còn lại (Hình
3.3, Bảng 3.3). Kết quả này cho thấy NAA và BA có tác động tích cực với sự
tăng sinh của PLBs và phù hợp với nghiên cứu của Atichart và cộng sự (2007).

A

B

C

D

2 cm

Hình 3.3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ
sung BA và NAA sau 10 tuần nuôi cấy. (A). MS, (B). 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l
NAA, (C). 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA, (D). 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA.
Bảng 3.3. Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường
Nghiệm thức
1. MS
2. MS + 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
3. MS + 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
4. MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
ANOVA
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.

Trọng lượng PLBs (g)
1,50c
2,34bc
8,47a
3,15b
*

10


3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi
khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs
* Trường hợp chủng C58
Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao nhất (71,67%) ở thời điểm 3 ngày
với cả hai trường hợp có (100 µM) và không có AS (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS
theo thời gian nuôi cấy với chủng A. tumefaciens C58.
Nồng độ
AS (µM)
0
50
100
200
300
ANOVA

Số mẫu
chuyển
gen
10
10
10
10
10

Tỉ lệ mẫu dương tính GU (%)
1 ngày

2 ngày

46,67
46,67
40,00
53,33
33,33

NS

76,67
60,00
56,67
61,67
41,67
NS

3 ngày

4 gày

5 ngày

a

55,42
41,67
26,67
43,89
50,00
NS

57,92a
41,67b
51,67ab
45,00b
48,33ab
*

78,33
58,33b
71,67a
60,00b
63,33b
*

*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05; NS: không có sự khác biệt.
* Trường hợp chủng EHA105
Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao nhất (75,00%) ở thời điểm 3 ngày với
100 µM AS (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian nuôi cấy với chủng A. tumefaciens EHA105.
Nồng độ
AC (µM)
0
50
100
200
300
ANOVA

Số mẫu
chuyển
gen
10
10
10
10

10

Tỉ lệ mẫu dương tính GU
1 ngày
53,33
36,67
60,00
53,33
26,67
NS

2 ngày
60,00
58,33
68,33
56,67
68,33
NS

3 ngày
51,67b
50,00b
75,00a
46,67b
44,44b
*

%)

4 ngày

51,67
70,00
60,00
54,17
54,44
NS

5 ngày
46,67ab
31,67bc
36,67abc
53,33a
20,00c
*

*Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05; NS: không có sự khác biệt.
* Trường hợp chủng LBA4404
Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao nhất ở 100 µM AS (73,33%) sau 4
ngày đồng nuôi cấy (Bảng 3.6).

11


Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian nuôi cấy với chủng A. tumefaciens LBA4404.
Nồng độ
AS (µM)

Số mẫu
chuyển

gen
10
10
10
10
10

Tỉ lệ mẫu dương tính GU

%)

1 ngày 2 ngày 3 ngày
4 ngày 5 ngày
b
c
0
20,00
43,33
33,33
20,00d
00,00b
a
ab
b
50
40,00
50,00
58,67
61,11
13,33b

a
a
b a
100
56,67
67,78
69,33
73,33
23,33ab
a
c
b
200
36,67
63,33
35,57
49,30
46,67a
bc
c
b a
300
40,00
55,00
46,67
36,67
0,00b
b
ANOVA
*

NS
*
*
*
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05; NS: không có sự khác biệt.
Như vậy, với cả 3 chủng vi khuẩn, hiệu quả chuyển gen đều đạt cao nhất ở

100 µM AS sau 3 hay 4 ngày đồng nuôi cấy.
* Về mức độ biểu hiện gen GUS
Các mẫu chuyển gen ở cả 3 trường hợp đều có sự xuất hiện màu (xanh
chàm) khác biệt so với đối chứng không chuyển gen (không màu), với 3 mức
độ khác nhau: biểu hiện dạng khảm, biểu hiện thành mảng hay biểu hiện trên
toàn mẫu (Hình 3.4).

A

B

C

D

0,5 mm

Hình 3.4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen.
(A). Đối chứng không chuyển gen, (B). Biểu hiện dạng khảm, (C). Biểu
hiện thành mảng, (D). Biểu hiện trên toàn mẫu.
Tóm lại, việc chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia có thể
được thực hiện thành công với cả 3 chủng vi khuẩn C58, EHA105 và
LBA4404. Sự chuyển gen xảy ra ổn định sau 3 ngày (C58 và EHA105) hay 4

ngày (LBA4404) đồng nuôi cấy. Nồng độ chất cảm ứng AS thích hợp nhất cho
sự chuyển gen là 100 µM. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Men và
cộng sự (2003). Tuy nhiên, có sự khác biệt về mức độ phụ thuộc vào chất cảm
ứng AS trong 3 chủng vi khuẩn được sử dụng. Trong đó, chủng C58 có khả
năng chuyển gen vào PLBs với sự phụ thuộc vào chất cảm ứng ít hơn so với
hai chủng vi khuẩn còn lại.

12


3.1.3. Các điều kiện thích hợp để loại khuẩn và sàng lọc PLBs
* Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn
Khả năng diệt khuẩn và tỉ lệ PLBs sống cao nhất đạt được với 300 mg/l
cefotaxime sau 14 ngày (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. Khả năng diệt khuẩn của cefotaxime trên PLBs.
Nồng độ
cefotaxime
(mg/l)

Thời gian nuôi cấy (ngày)
7
14
Tình trạng
Tình trạng
Tỷ lệ mẫu
Tỷ lệ mẫu
nhiễm
nhiễm
sống (%)
sống (%)

khuẩn
khuẩn

0
300
500
700

100,00
93,30
86,70
80,00

+++
++
+
-

100,00aa
80,00
40,00b
0,00c

+++
-

ANOVA
NS
*
*: Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05; NS: không có sự khác biệt,

(+). Mức độ nhiễm khuẩn của PLBs, (-). Không nhiễm khuẩn.
Như vậy, cefotaxime 300 mg/l thích hợp cho việc diệt khuẩn. Phù hợp với
kết quả này, cefotaxime 300 mg/l cũng đã được sử dụng để diệt vi khuẩn sau
giai đoạn đồng nuôi cấy ở lan Phalaenopsis (Belarmino và Mii, 2000).
* Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs
- Trường hợp hygromycin
Tỷ lệ PLBs chết cao nhất (100%) với hygromycin ở các nồng độ 7, 10 và
15 mg/l sau 28 ngày nuôi cấy (Bảng 3.8). Như vậy, hygromycin 7-15 mg/l
thích hợp cho sàng lọc PLBs chuyển gen, phù hợp với mức 10 mg/l mà Shretha
và cộng sự (2010) sử dụng trên lan Vanda.
Bảng 3.8. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của hygromycin ở các nồng độ khác
nhau theo thời gian nuôi cấy.
Tỷ lệ PLBs chết theo thời gian (%)
Nồng độ hygromycin
(mg/l)
14 ngày
28 ngày
0
5
7
10
15

0,00c
13,33b
86,67a
88,89a
90,00a

0,00c

26,67b
100,00a
100,00a
100,00a

ANOVA

*

*

*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.

13


- Trường hợp kanamycin
Sau 40 ngày, tỷ lệ PLBs chết chia thành 3 mức: thấp (100 - 300 mg/l), trung
bình (400 - 500 mg/l) và cao (700 mg/l) (Bảng 3.9). Nồng độ thấp không phù
hợp cho chọn lọc, nhưng nồng độ trung bình có thể dùng cho sàng lọc sơ bộ
trước khi chuyển sang nồng độ cao.
Bảng 3.9. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác
nhau, theo thời gian nuôi cấy
Nồng độ
Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian
kanamycin (mg/l)
(%)
20 ngày
40 ngày
0

0,00b
0,00c
b
100
0,00
0,00c
b
200
0,00
3,33c
b
300
0,00
3,33c
ab
400
10,00
23,33b
a
500
13,33
43,33b
a
700
36,67
93,33a
ANOVA
*
*
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA CyMV

3.2. PHÂN LẬP

3.2.1. Phân lập gen CP
Kết quả PCR thu được sản phẩm có kích thước gần 700 bp (Hình 3.5), phù
hợp với kích thước của gen cần phân lập (672 bp). Như vậy, gen CP đã được
khuếch đại thành công.
L

1

2

3

4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

L

700bp
700bp
500bp

500bp

Hình 3.6. Kết quả kiểm tra gen CP

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản

trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi

phẩm khuếch đại gen CP. (L). Thang

F-CCP và R-CCP. (L). Thang DNA,

DNA, (1-3). Mẫu, (4). Chứng âm.
3.2.2. Tạo dòng gen CP

(2-9). Mẫu, (1). Chứng âm.

Sau biến nạp đã thu được các dòng khuẩn lạc phát triển được trên môi trường

có 100 mg/l ampicilin. Khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi

14


F-CCP/R-CCP định vị trên gen. Kết quả đã khuếch đại được một phân đoạn
DNA ở vị trí khoảng 700 bp, phù hợp với sản phẩm dự kiến 672 bp (Hình 3.6).
Khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra với mồi F-pJET1.2/R-pJET1.2 định vị
trên vector và đã thu được phân đoạn DNA gần 800 bp, phù hợp với dự kiến
(807 bp) (Hình 3.7). Plasmid từ vi khuẩn cũng được kiểm tra với enzyme
BamHI và EcoRI và cũng thu được phân đoạn DNA gần 700 bp, phù hợp với
dự kiến (672 bp) (Hình 3.8). Như vậy, gen CP đã được tạo dòng thành công.
L

1

2

3

L

1

2

3000bp
1000bp

700bp

700bp

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra gen CP
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra gen
trong các dòng vi khuẩn bằng enzyme
CP trong các dòng vi khuẩn
BamHI và EcoRI. (L). Thang DNA,
với cặp mồi pJET1.2. (L).
(1). Mẫu, (2). Chứng âm.
Thang DNA, (1-2). Mẫu, (3).
Chứng
3.2.3.
Giảiâm.
trình tự gen CP và phân tích tương đồng trình tự
Các trình tự gen phân lập tương đồng với trình tự gen CP của CyMV công
bố trên ngân hàng gen NCBI ở mức từ 95% trở lên (Hình 3.9). Kết quả này
chứng tỏ các trình tự gen này là trình tự gen CP của CyMV.

Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự gen CP với các trình tự được công bố trên
ngân hàng gen NCBI.
Các trình tự phân lập được ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam có sự
tương đồng cao. Tỷ lệ tương đồng của các trình tự thay đổi tùy thuộc vào

15


khoảng cách địa lý giữa các khu vực phân lập và dao động trong khoảng từ 9599% (Bảng 3.10).
Bảng 3.10. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân
lập ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam
Tỷ lệ tương đồng (%)

Trình tự
HCM1
HCM2
DaLat
HaNoi
BacGiang
ThaiNguyen

HCM1

HCM2

DaLat

HaNoi

Bac
Giang

Thai
Nguyen

100
99
96
95
96

100
99

96
95
96

99
99
96
95
96

96
96
96
97
97

95
95
95
97
99

96
96
96
97
99
-

Các trình tự phân lập ở Việt Nam cũng có sự tương đồng cao với trình tự ở

các nước. Tỷ lệ tương đồng dao động từ 95-99% (Bảng 4.11). Như vậy, trình
tự gen CP của virus CyMV có tính bảo thủ cao giữa các vùng. Điều này đảm
bảo cho sự kháng virus hiệu quả của cây chuyển gen tạo ra bằng RNAi.
Bảng 3.11. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV ở Việt
Nam và một số khu vực trên thế giới
Tỷ lệ tương đồng (%)
Trình tự
HCM1
HCM2
DaLat
HaNoi
BacGiang
ThaiNguyen
3.3. THIẾT

KF85326 AY429021 AB693982 AF405728 AB541560 EF125180
China
Taiwan Indonesia Singapore
Korea
Hawai

97
97
97
97
96
96
Ế ECT

96

96
96
99
97
97

97
97
97
97
96
97

95
95
95
97
95
95

97
97
97
98
97
97

96
96
96

97
96
96

CHUYỂN GEN RNAi

Vector RNAi được thiết kế với đoạn gen CP (450 bp) thu nhận từ vector
nhân dòng mang gen CP; và đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP (496 bp), được
tổng hợp nhân tạo từ phân đoạn 302 bp (nt 819-1120) trên gen ORF2-4 và phân
đoạn 194 bp (nt 279-472) trên gen CP và gắn vào vector pBSK.

16


3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP/ORF2-4+CP
* Khuếch đại đoạn gen CP và gen ORF2-4+CP từ vector
Theo tính toán, đoạn gen CP và ORF2-4+CP sẽ có kích thước tương ứng là
450 bp và 500 bp. Kết quả đã thu được phân đoạn DNA ở gần vị trí 450 bp
(CP) và 500 bp (ORF2-4+CP). Điều này cho thấy, đoạn gen mục tiêu đã được
khuếch đại thành công (Hình 3.10).
1

L

1

L
1

2

3

4

5

L

6

7

8

9

10
1000bp

500bp

A

250bp

500bp

B

750bp

250bp

Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sản
phẩm khuếch đại gen CP (A)
và ORF2-4+CP (B). (1). Mẫu,
(L). Thang DNA.Chứng âm.

Hình 3.11. Kết quả kiểm tra phân
đoạn gen CP trong các dòng vi
khuẩn biến nạp vector pENTR/CP
với cặp mồi M13.

* Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR TOPO
(L). Thang DNA, (1-10). Mẫu
Kết quả kiểm tra các dòng tế bào biến nạp vector (đã gắn gen) bằng PCR với
mồi M13 cho thấy có hiện diện phân đoạn DNA ở vị trí gần 750 bp (CP) và giữa
750-1000 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.11 và 3.12), phù hợp với kích thước dự kiến
(780 bp và 820 bp. Điều này cho thấy gen mục tiêu đã được gắn vào vector.
1
1

2

3

4

5

6

7

8

9

L

L
3000bp

1000bp
250bp

3000bp

1
L

500bp

750bp

A

Hình 3.12. Kết quả kiểm tra sự hiện
diện của phân đoạn gen CP (A) và

ORF2-4+CP (B) trong vi khuẩn
bằng enzyme SalI và NotI.

B

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra sự hiện
diện của phân đoạn gen CP (A) và
ORF2-4+CP (B) trong vi khuẩn
bằng enzyme SalI và NotI.

Kết quả cắt plasmid pENTR tái tổ hợp với enzyme SalI và NotI đã thu được
các phân đoạn DNA ở vị trí 3000 bp và 250 bp (CP), 2500 bp và 500 bp (ORF24+CP) (Hình 3.13), phù hợp với kích thước tính toán: 2839 bp và 201 bp (CP),
2574 bp và 502 bp (ORF2-4+CP). Điều này một lần nữa khẳng định phân đoạn
gen CP và ORF2-4+CP đã được gắn thành công vào vector pENTR.

17

L


1 2

1 2 3 4 5 6 L

3

4

Bảng 3.12. Kích thước các phân

L

đoạn thu được khi cắt vector
pK7GWIWG2(II) /CP/ ORF2-

500bp
400bp

500bp

A

4+CP bằng Xba I và Hind III

B

Hình 3.14. Kết quả kiểm tra gen CP (A)
và gen ORF2-4+CP (B) trong các dòng
khuẩn lạc với cặp mồi của đoạn gen. (L).
Thang DNA, (1-5-A) và (1-3-B). Mẫu,
(6-A) và (4-B). Chứng dương.

pK7CP

pK7ORF24+CP

Phân đoạn 1 8116 8116
Phân đoạn 2 3310 2850
Phân đoạn 3 1463 1003

8116
2886
1039

Mẫu

pK7

* Thiết kế vector RNAi bằng kỹ thuật Gatewway
Sau khi thực hiện phản ứng tái tổ hợp và biến nạp vào vi khuẩn, các khuẩn
lạc phát triển trên môi trường kháng sinh sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi
của đoạn gen. Kết quả đã thu được phân đoạn DNA ở vị trí 500 bp (ORF2-4+CP)
và 450 bp (CP), phù hợp với kích thước tính toán (Hình 3.14). Điều này cho thấy
có gen mục tiêu hiện diện trong các dòng vi khuẩn được chọn lọc. Pasmid tái tổ
hợp cũng được kiểm tra bằng cách cắt với enzyme XbaI và HindIII. Nếu gen
được chèn vào đúng trên vector, phản ứng cắt sẽ cho ba phân đoạn DNA (Bảng
3.12). Kết quả đã thu được các phân đoạn DNA 8116 bp, 2850 bp, 1003 bp
(pK7GWIWG2(II)/CP) và 8116 bp, 2886 bp, 1039 bp (pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP), cho thấy gen mục tiêu đã chèn vào đúng cấu trúc (Hình 3.15).
L

1

2

3

4

5

10000bp
3000bp
1500bp
1000bp
500bp

1 cm

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra sản phẩm
cắt vector pK7GWIWG2(II)/CP và
pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng
enzyme XbaI và HindIII.

Hình 3.16. Khuẩn lạc A. tumefaciens
C58 phát triển trên môi trường LB +
50 mg/l ampicilin, 100 mg/l
spectinomycin và 50 mg/l rifamycin.

* Tạo chủng A. tumefaciens mang vector RNAi

(L).
Thang
DNA,
(1).
Sau khi biến nạp vector vào vi khuẩn đã thu được các khuẩn lạc phát triển
pK7GWIWG2(II),
(2,
3).
trên môi trường có 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomycin (sàng lọc
K7GWIWG2(II)/CP,

18
(4, 5). pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP.


vector) và 50 mg/l rifamycin (sàng lọc vi khuẩn) (Hình 3.16). Như vậy, quá
trình biến nạp đã thành công và những dòng khuẩn lạc thu được đều mang
vector mục tiêu.
3.4. TẠO CÂY LAN MANG CẤU TRÚC RNAi
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs bằng A. tumefaciens
* Giai đoạn đồng nuôi cấy
Sau 3 ngày nuôi cấy, PLBs được lây nhiễm và không lây nhiễm đều tăng
trưởng bình thường. Ở các PLBs được lây nhiễm, có sự xuất hiện các vòng
khuẩn trắng bao quanh (Hình 3.17). Điều này cho thấy vi khuẩn đã xâm nhiễm
vào PLBs. Sự phát triển đồng thời của vi khuẩn và PLBs cho thấy quy trình lây
nhiễm đã được thiết lập thành công.
* Giai đoạn khử khuẩn
Sau 7 ngày nuôi cấy, hầu hết PLBs vẫn sống và không còn vòng khuẩn bao
quanh. Đến ngày thứ 14, bên cạnh các PLBs tiếp tục phát triển thành cụm
PLBs, bắt đầu xuất hiện các PLBs chết. Các cụm PLBs còn sống được duy trì
trên môi trường khử khuẩn đến ngày thứ 21 để loại bỏ toàn bộ vi khuẩn (Hình
3.18). Kết quả thu được cho thấy cefotaxime 300 mg/l vừa có khả năng loại
khuẩn vừa duy trì được khả năng sống của PLBs.
3.4.2. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển
Sau 60 ngày nuôi cấy, hầu hết các cụm PLBs không chuyển gen đều chết.
Một số các cụm PLBs chuyển gen vẫn sống bên cạnh các cụm PLBs chết (Hình
3.19). Các cụm PLBs sống được xem là các mẫu giả định chuyển gen tạm thời,
và được sử dụng cho kiểm tra gen mục tiêu.

1 cm

Hình 3.17. PLBs tăng trưởng
trên môi trường MS + 0,3 mg/l
BA, 1,0 mg/l NAA và 100 M
AS sau 3 ngày lây nhiễm A.
tumefaciens. (A). Đối chứng,
(B). Lây nhiễm vi khuẩn.

1 cm

Hình 3.18. PLBs
tăng trưởng trên
môi trường khử
khuẩn sau 7 ngày
(A) và 14 ngày (B)
nuôi cấy.

1 cm

Hình 3.19. PLBs nuôi
cấy trên môi trường sàng
lọc chứa 500 mg/l
kanamycin sau 60 ngày.
(A). Không chuyển gen,
(B). Chuyển gen.

19


Kết quả chuyển gen cho thấy có 1233 cụm PLBs (705 RNAi-CP và 528
RNAi-ORF2-4+CP) sống qua giai đoạn sàng lọc trong tổng số 8814 PLBs

(4889 RNAi-CP và 3925 RNAi-ORF2-4+CP) được xử lý chuyển gen, chiếm tỷ
lệ 13,99% (Bảng 3.13).
Bảng 3.13. Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen sau giai đoạn sàng lọc kanamycin.
Tổng số P Bs xử lý
ố P Bs thu được
ần
Tỷ lệ %)
chuyển
gen
sau sàng lọc
chuyển
gen

CP

1
2
3
4
Tổng

301
959
2529
1100
4889

ORF24+CP
300
922

1762
941
3925

Tổng

CP

601
1881
4291
2041
8814

52
112
455
86
705

ORF24+CP
41
77
293
117
528

Tổng

CP

93
189
748
203
1233

17,28
11,68
17,99
7,82
14,42

ORF24+CP
13,67
8,35
16,63
12,43
13,45

Tổng
15,47
10,05
17,43
9,95
13,99

3.4.3. Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs
Kết quả đã thu được 2 phân đoạn DNA ở vị trí giữa 400-500 bp (CP) và
500 bp (ORF2-4+CP), phù hợp với dự kiến. Các cụm PLBs tương ứng với các

phân đoạn DNA này chắc chắn có mang gen mục tiêu (Hình 3. 20, 3.21).
1

2

3

4

5

6

7

8

9

L

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

L

500bp

500bp

400bp

400bp

Hình 3.20. Kết quả kiểm tra gen CP
trong cụm PLBs giả định chuyển
gen. (1-6). Chuyển gen, (7). Không
chuyển gen, (8). Chứng âm, (9).
Chứng dương, (L). Thang DNA.

Hình 3.21. Kết quả kiểm tra gen

ORF2-4+CP trong cụm PLBs giả định
chuyển gen. (1-9). Chuyển gen, (10).
Không chuyển gen, (11). Chứng âm,
(12). Chứng dương, (L). Thang DNA.

Kết quả kiểm tra trên tổng số 38 cụm PLBs (17 PLBs-RNAi-CP và 21 PLBsRNAi-ORF2-4+CP) được chọn ngẫu nhiên cho thấy có 20 PLBs mang gen mục
tiêu (8 PLBs-RNAi-CP và 12 PLBs-RNAi-ORF2-4+CP), chiếm tỷ lệ 52,63%
(Bảng 3.14). Kết quả này cho thấy cấu trúc gen mục tiêu đã được chuyển vào
PLBs. Hiệu quả chuyển gen ước đạt khoảng 7,36% (= 52,63*13,99/100).
3.4.4. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển
Sự tăng trưởng chồi từ PLBs chuyển gen xảy ra rất chậm, chỉ bắt đầu sau
khoảng 3 tháng nuôi cấy, khi PLBs đã phát triển kín bề mặt của bình nuôi (Hình
3.22). Sự tăng trưởng chậm của PLBs sau khi chuyển gen cũng đã được ghi nhận
bởi Chang và cộng sự (2005) trong nghiên cứu chuyển gen CP vào lan Dendrobium.

20


Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra sự hiện diện
của gen mục tiêu trong PLBs chuyển gen.
Tổng số P Bs ố P Bs Tỷ lệ
Gen
kiểm tra
c gen
(%)
CP
17
8
47,06
ORF2-4+CP

21
12
57,14
Tổng
38
20
52,63

A

B

Hình 3.22. Sự tăng trưởng của PLBs
chuyển gen trên môi trường ½ MS.
(A). Tăng sinh PLBs, (B). Tạo chồi.

Sau 6 tháng, cây lan chuyển gen đã được tạo thành. Có 3 dạng kiểu hình
cây chuyển gen (CP) khác biệt so với bình thường, bao gồm: (1) kiểu hình lá
thuôn dài, xoắn; (2) kiểu hình lá ngắn, dày; (3) kiểu hình lá ngắn, mỏng, mép lá
răng cưa (Hình 3.23). Trong đó, hai dạng kiểu hình lá ngắn tăng trưởng kém,
cây thường bị hoại tử, và chết sau một thời gian nuôi cấy (Hình 3.23-C, D).

A

B

C

D

Bảng 3.15. Tần suất xuất hiện của các
dạng kiểu hình cây lan Dendrobium
Sonia thu được từ PLBs chuyển gen.
1cm

Hình 3.23. Kiểu hình cây lan
Dendrobium Sonia từ PLBs
chuyển gen. (A). Bình thường,
(B). Lá thuôn dài, xoắn, (C). Lá
ngắn, dày, (D). Lá ngắn, mỏng

Dạng kiểu hình
Chỉ tiêu
Bình
Lá
thuôn Lá ngắn Lá ngắn
theo dõi
thường dài, xoắn dày
mỏng
Số lần
57
xuất hiện
Tần suất
41,60
(%)

4
2,92

61

15

44,52

10,95

Trong đó, kiểu hình (2) có tần suất xuất hiện cao nhất, kế đến là các kiểu
hình: bình thường; (3); và (1). (Bảng 3.15). Sự xuất hiện các kiểu hình khác
thường của cây lan phát triển từ PLBs chuyển gen có thể do việc chèn gen mục tiêu
vào đã tạo ra những thay đổi kiểu hình. Sự hiện diện gen mục tiêu trong cây lan
chuyển gen cũng đã được khẳng định bằng PCR với sự hiện diện của sản phẩm
khuếch đại ở vị trí 400bp (CP) và 500 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.24, 3.25).
1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 L

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

L

500 bp
500 bp

Hình 3.24. Kết quả kiểm tra gen CP trong

Hình 3.25. Kết quả kiểm tra gen ORF2-

cây lan chuyển gen. (1-8). Chuyển gen,

4+CP trong cây lan chuyển gen. (1-8).

(9). Không chuyển gen, (10). Đối chứng

Chuyển gen. (9). Không chuyển gen,

PCR (phát hiện gen lục lạp), (11). Chứng

(10). Đối chứng PCR, (11). Chứng âm,

âm, (12). Chứng dương. (L). Thang DNA.

(12). Chứng dương. (L). Thang DNA.

21


Kết quả kiểm tra trên tổng số 34 cây chọn ngẫu nhiên cho thấy có 14 cây
mang gen mục tiêu, chiếm tỷ lệ 41,17% (Bảng 3.16). Kết quả này cho thấy quá
trình tạo cây lan mang cấu trúc RNAi đã được thực hiện thành công.
Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của
gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ PLBs
chuyển gen
A

Cấu trúc
Số cây Số cây Tỷ lệ
gen chuyển kiểm tra có gen (%)
RNAi-CP
25

7
28,00
RNAi9
7
77,77
ORF2-4+CP
Tổng số
34
14
41,17
3.5. KHẢ N NG

B

C

D

1 cm

Hình 3.26. Triệu chứng nhiễm virus trên
cây lan in vitro sau 3 tuần lây nhiễm
CyMV. (A). Khảm vàng lá, (B, C). Vết
hoại tử lá, (D). Hoại tử và biến dạng lá.

HÁNG CyMV CỦA CÂY LAN CHUYỂN GEN

3.5.1. Về triệu chứng biểu hiện
Sau 3 tuần lây nhiễm nhân tạo, cây đối chứng không chuyển gen bắt đầu có
biểu hiện triệu chứng nhiễm virus; cây giả định chuyển gen chia thành hai

nhóm có và không có biểu hiện triệu chứng. Các triệu chứng nhiễm virus quan
sát được bao gồm khảm vàng lá, tạo vết (đốm) hoại tử trên lá và hoại tử đi kèm
với biến dạng lá (Hình 3.26). Sau 4 tuần lây nhiễm, các triệu chứng phát triển
trầm trọng hơn (khảm vàng và hoại tử lan rộng gây chết hoàn một số cây) trên
các cây có biểu hiện nhiễm virus (Hình 3.27).
1

A

B

1 cm

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

L
300 bp

C

Hình 3.27. Cây lan in vitro sau
4 tuần lây nhiễm virus nhân
tạo. (A, B). Giả định chuyển
gen. (C). Đối chứng không
chuyển gen.

2

200 bp

Hình 3.28. Kết quả kiểm tra virus CyMV
trong cây lan chuyển gen được lây nhiễm
virus sau 4 tuần. (1-6). Chuyển gen, (7-10).
Đối chứng (11). Chứng âm, (12). Chứng
dương, (L). Thang DNA.

3.5.2. Về sự hiện diện của virus trong cây lan
Kết quả kiểm tra virus bằng RT-PCR đã thu được một phân đoạn DNA ở
giữa vị trí 200-300 bp, phù hợp với kích thước tính toán (257 bp), đối với các
cây có triệu chứng. Phân đoạn DNA tương tự không xuất hiện với cây không

22


có triệu chứng (Hình 3.28). Như vậy, các cây lan không có triệu chứng cũng
đồng thời không có virus.
Bảng 3.17. Kết quả
3 đánh giá khả năng

kháng virus của cây lan giả định chuyển
gen sau 3 tuần lây nhiễm virus nhân tạo.
Cấu trúc Tổng số Số cây Tỷ lệ
gen
cây
kháng kháng
chuyển đánh giá virus
%)
RNAi-CP
68
20
29,4
RNAi4
3
75,0
ORF2-4+CP

Tổng số

72

23

31,94

1 cm

1 cm

Hình 3.29. Cây lan Dendrobium

Sonia chuyển gen (dòng 36176) tăng trưởng trong điều kiện
nhà kính.

Kết quả đánh giá khả năng kháng virus trên tổng số 72 cây giả định chuyển gen
chọn ngẫu nhiên cho thấy tỷ lệ kháng virus trung bình đạt 31,94% (Bảng 3.17).
Đến đây có thể kết luận cấu trúc gen được chuyển vào trong cây lan đã hoạt
động và tạo ra khả năng kháng virus cho cây như dự kiến. Trong số các dòng
kháng virus có được từ nghiên cứu, đã chọn lọc được 01 dòng (36-176) có khả
năng phát triển tốt. Các cá thể của dòng lan này đã được chuyển ra trồng trong điều
kiện nhà kính (Hình 3.29). Những kết quả trên cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật
chuyển gen RNAi để tạo ra dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus là
điều khả thi. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc gen
chuyển lên sự phát triển của mô và cây lan chuyển gen để nâng cao hiệu quả
chuyển gen.
KẾT LUẬN

ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận
- Quá chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia được thực hiện thành công
khi cho các PLBs (được tái sinh từ lát cắt mô thân của cây lan in vitro) lây
nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58 (hay EHA105 và LBA4404) và
nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 100µM AS, trong thời gian 3 ngày (với
chủng C58 và EHA105) hay 4 ngày (với chủng LBA4404), sau đó loại bỏ vi

23