Biểu hiện và tinh sạch staphylococcal enterotoxin b (SEB) từ chủng tụ cầu vàng staphylococcus aureus được phân lập tại thái nguyên

i

HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẬU NINH THUẬN

BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB)
TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2016


ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẬU NINH THUẬN

BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB)
TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGHIÊM NGỌC MINH

Thái Nguyên - 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa có ai công bố
trong một công trình nào khác.
Tác giả luận văn

Đậu Ninh Thuận


ii

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc
Minh - Phó Viện trƣởng Viện Nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy tâm huyết đã luôn
giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học tại
phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thầy luôn tận tình hƣớng dẫn, dành thời
gian trao đổi, định hƣớng cũng nhƣ động viên, nhắc nhở và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các anh chị trong phòng Công
nghệ Sinh học Môi trƣờng, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thị Hoài Thu và KS. Phạm
Thùy Linh đã luôn tạo điều kiện, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện, nghiên cứu, hoàn thành luận văn của mình.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Khoa học sự sống Trƣờng ĐH Khoa học - Đại học Thái Nguyên cùng với Ban lãnh đạo Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại
trƣờng cũng nhƣ tại viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình và
bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn
thành tốt luận văn này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên ng y

tháng

năm 2016

HỌC VIÊN

Đậu Ninh Thuận


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột SEB
trên thế giới và tại Việt Nam .......................................................................................3
1.1.1. Khái quát tình hình ngộ độc thực phẩm ............................................................3
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus v độc tố ruột SEB trên thế giới v
tại Việt Nam.................................................................................................................5
1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus ...................................................................9
1.2.1. Lịch sử phát hiện ...............................................................................................9
1.2.2. Đặc điểm phân loại .........................................................................................10
1.2.3. Đặc điểm vi khuẩn học ....................................................................................12
1.3. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B ..........................................................17
1.3.1. Cấu trúc phân tử v cơ chế gây độc của SEB .................................................18
1.3.2. Gen seb ............................................................................................................19
1.3.3. Triển vọng ứng dụng của SEB ........................................................................20
1.4. Các kỹ thuật xác định S. aureus trong phòng thí nghiệm ..................................21
1.4.1 Các kỹ thuật thông thường xác định S. aureus ................................................21
1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử .........................................................................22
1.4.3. Một số kỹ thuật dựa trên miễn dịch .................................................................24
Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................27
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ...................................................27
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................27
2.1.2. Các bộ kit ........................................................................................................27
2.1.3. Hóa chất máy móc v thiết bị sử dụng ...........................................................27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................29
2.2.1. Phương pháp tách DNA tổng số .....................................................................29
2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ..........................................30
2.2.3. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony - PCR).............................31

2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ...................................................31


iv

2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm từ gel agarose ...........................................32
2.2.6. Phương pháp tách dòng gen seb trong vector pTZ57R/T ...............................32
2.2.7. Phương pháp xử lý enzym hạn chế trên gen seb v vector biểu hiện
pET22b(+) .................................................................................................................33
2.2.8. Phương pháp ghép nối gen ngoại lai v o vector pET22b(+) .........................37
2.2.9. Phương pháp biến nạp DNA plasmid v o tế b o khả biến E. coli .................37
Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................43
3.1. Tách chiết DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus ....................................43
3.2. Tách dòng gen seb534 ........................................................................................43
3.2.1. Nhân gen seb534 từ chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus .........................43
3.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................................44
3.2.3. Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector tách dòng pTZ57R/T ..........................45
3.2.4. Xác định trình tự gen seb534 ..........................................................................46
3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22(b+) mang gen seb534 ....................................48
3.3.1. Xử lý enzym cắt hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb534 v vector
pET22(b+) .................................................................................................................48
3.3.2. Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector biểu hiện pET22(b+).........................50
3.3.3. Chọn lọc dòng tế b o chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) ...............51
3.4. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 trong tế b o E. coli BL21(DE3)
...................................................................................................................................53
3.4.1. Biểu hiện gen seb534 trong tế b o E. coli BL21(DE3)...................................53
3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 ..............................................55
3.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB534 .................................................................59
KẾT LUẬN ...............................................................................................................62
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................62

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................63


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µl

Microliter

APS

Ammonium persulphate

Bp

Base pair

dH2O

Nƣớc khử ion

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNase

Deoxyribonuclease

dNTP

Deoxyribonucleotide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid

Kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria - Bertani

Ml

Milliliter

OD

Optical density

PBS

Phosphate buffer saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

S. aureus

Staphylococcus aureus

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis

SEB

Staphylococcal enterotoxin B

SEs

Staphylococcal enterotoxins

TAE

Tris-acetate-EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris EDTA


vi

TEMED

Tetramethylethylenediamine

v/p

Vòng/phút

v/v

volume/volume

w/v

Weight/volume

WHO

World Health Organization

wtSEB

Wild type SEB


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus .........................................................12
Hình 1.2. Vi khuẩn tụ cầu S. aureus Gram dƣơng dƣới kính hiển vi .......................12
Hình 1.3. Các độc tố quyết định của S. aureus .........................................................16
Hình 1.4. Cấu trúc tinh thể của protein SEB .............................................................18
Hình 1.5. Cơ chế gây độc của siêu kháng nguyên ....................................................19
Hình 2.1. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ..................................................................31
Hình 2.2. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .......................................................32
Hình 2.3. Cấu trúc vertor biểu hiện pET22(b+) ........................................................35
Hình 3.1. Sản phẩm tách DNA tổng số của chủng S. aureus ...................................43
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 ....................................44
Hình 3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ..............................................................44
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1%....45
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm cắt seb534/pTZ57R/T .............................................46
bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII .....................................................................46
Hình 3.6. Trình tự gen seb534 của chủng S. aureus .................................................47
Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch................................................49

Hình 3.8. Điện di đồ plasmid pET22(b+) sau khi cắt bằng các enzym hạn chế .......49
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) .............................50
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc ......................................52
để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+) ......................................52
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid seb534/pET22(b+) của các dòng khuẩn lạc
...................................................................................................................................53
Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện protein SEB534 .......................................54
Hình 3.13. Điện di đồ ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein
SEB534......................................................................................................................56
Hình 3.14. Điện di đồ ảnh hƣởng của nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543
...................................................................................................................................57
Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cảm ứng ...................58
Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh sạch ...............60


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam từ năm 2007 - 2014 ....4
Bảng 1.2. Sơ bộ tình hình nhiễm độc S. aureus trên thế giới trong những năm gần
đây ...............................................................................................................................6
Bảng 1.3. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 - 2016. ......8
Bảng 1.4. Phân loại khoa học S. aureus ....................................................................10
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng cho tách dòng ...............................................................27
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng chính ......................................................................28
Bảng 2.3. Các máy móc và thiết bị sử dụng..............................................................29
Bảng 2.4. Thành phần PCR .......................................................................................30
Bảng 2.5. Thành phần gel tách 12% .........................................................................40
Bảng 2.6. Thành phần gel cô 5% ..............................................................................40
Bảng 3.1. Độ tƣơng đồng của gen seb534 ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số

chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ................................................47


1

MỞ ĐẦU
An toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng, đƣợc tiếp cận với thực phẩm an toàn
đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con ngƣời. Thực phẩm an toàn đóng góp to
lớn trong việc cải thiện sức khoẻ con ngƣời, chất lƣợng cuộc sống và chất lƣợng
giống nòi.
Tuy nhiên tình hình ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta nói riêng và trên thế giới nói
chung có xu hƣớng ngày càng tăng không chỉ gây ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khoẻ,
cuộc sống và tính mạng của mỗi ngƣời, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh
nặng chi phí cho chăm sóc sức khoẻ, an sinh xã hội quốc gia. Chính vì thế mà
không ít ngƣời đã đặt câu hỏi: “Liệu trong thời đại phát triển nhƣ hiện nay thì sức
khỏe của con ngƣời có đƣợc đảm bảo hay không?”.
Nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể do: hóa chất, vi sinh vật, thực
phẩm chứa sẵn một số chất độc,… thực phẩm nhiễm vi sinh vật là nguyên nhân phổ
biến trong ngộ độc thực phẩm. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus (S. aureus) là
một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. S. aureus còn đƣợc biết
đến với cái tên “vi khuẩn bệnh viện” thƣờng khu trú tại các vị trí khác nhau trong cơ
thể ngƣời nhƣ trong hốc mũi, họng, trong vết thƣơng, vết mổ không đảm bảo quy
trình vô trùng. Nguy hiểm hơn chúng còn có khả năng kháng methiciline,
penicilline khi gặp điều kiện thuận lợi có thể lây lan và gây nên nhƣng căn bệnh
nguy hiểm. Các độc tố ruột do S. aureus sản sinh ra phải kể đến độc tố
staphylococcal enterotoxin B (SEB), đây là một độc tố mạnh, bền với nhiệt, hòa tan
trong nƣớc và là tác nhân chính thƣờng gặp trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus. Vì vậy, việc xác định sự có mặt của SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực
phẩm đóng vai trò vô cùng quan trọng.
Hiện nay, nhiều nƣớc trên thế giới đã sản xuất đƣợc que thử phát hiện nhanh

độc tố SEB dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch. Tuy nhiên, que thử nƣớc ngoài
khi sử dụng ở Việt Nam có nhiều hạn chế nhƣ: giá thành cao, kháng nguyên trong
nƣớc có thể không tƣơng thích với que thử… từ những hạn chế trên, thúc đẩy chúng
tôi phải chủ động sản xuất que thử trong nƣớc. Nhằm phục vụ cho nghiên cứu chế


2

tạo kit phát hiện nhanh sự có mặt của độc tố ruột SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực
phẩm, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Biểu hiện và tinh sạch Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) từ chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus được phân lập
tại Thái Nguyên”.
Mục tiêu của đề tài:
Nhân dòng, biểu hiện gen seb534 tự nhiên và tinh sạch protein tái tổ hợp SEB
dạng tự nhiên mang độc tính, làm cơ sở tạo protein tái tổ hợp ở dạng đột biến mất
độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo que thử phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm
do độc tố tụ cầu vàng.
Đối tƣợng nghiên cứu:
Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên.
Nội dung nghiên cứu:
- Tách dòng và xác định trình tự gen seb534 tự nhiên từ chủng tụ cầu vàng S.
aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên.
- Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên SEB.
- Nghiên cứu các điều kiện để tối ƣu khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp SEB
trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
- Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB.


3

Chƣơng I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột SEB
trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Khái quát tình hình ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm là hội chứng lâm sàng cấp tính xuất hiện sau khi
ngƣời bệnh ăn các thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật, thực
phẩm bị nhiễm hoá chất hoặc bản thân thực phẩm có độc (chất độc có tự nhiên
trong thực phẩm nhƣ nấm độc, khoai tây mọc mầm, sắn, một số loài nhiễm thể,
cá nóc, cóc). Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng đau bụng, buồn nôn,
nôn, nóng sốt, tiêu chảy… hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng
loại tác nhân gây ngộ độc.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay có tới hơn 400 các bệnh lây
truyền qua thực phẩm không an toàn, từ các bệnh nh tới các bệnh ung thƣ. Thực
phẩm bị ô nhiễm bởi vi sinh vật hoặc độc tố của chúng là một trong những nguyên
nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm. Tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm
bao gồm: vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng; trong đó các loại vi khuẩn gây ra
tới 90% ca bệnh và tử vong ở ngƣời [1], [18]. Trong số các nguyên nhân đã đƣợc
xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ
tử vong cao nhƣ: Salmonella, E. coli, Clostridium perfringens, S. aureus, vi khuẩn
Listeria,… trong đó S. aureus đƣợc xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ
ngộ độc thực phẩm ở nhiều nƣớc chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens [1].
Theo báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các
nƣớc phát triển bị ảnh hƣởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm. Đối với
các nƣớc đang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử
vong hơn 2,2 triệu ngƣời, trong đó hầu hết là trẻ em [1].
Các vụ ngộ độc thực phẩm có xu hƣớng ngày càng tăng. Nƣớc Mỹ hiện tại mỗi
năm vẫn có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm với 325000 ngƣời phải vào viện và 5000
ngƣời chết. Chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ

4

điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm. Trung bình cứ 1000 dân có 175 ngƣời bị ngộ độc
thực phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 1531 đô la Mỹ [1],
[49]. Nƣớc Úc có Luật thực phẩm từ năm 1908 nhƣng hiện nay mỗi năm vẫn có
khoảng 4,2 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm, trung
bình mỗi ngày có 11500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra và chi phí cho 1 ca
ngộ độc thực phẩm mất 1679 đô la Úc. Ở Anh cứ 1000 dân có 190 ca bị ngộ độc thực
phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 789 bảng Anh. Tại Hàn
Quốc, tháng 6 năm 2006 có 3000 học sinh ở 36 trƣờng học bị ngộ độc thực phẩm [1].
Mặc dù cho đến nay đã có khá nhiều tiến bộ về khoa học kỹ thuật trong công
tác bảo vệ và an toàn vệ sinh thực phẩm, cũng nhƣ biện pháp về quản lý giáo dục,
ban hành luật, điều lệ và thanh tra giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm, nhƣng tình
hình ngộ độc thực phẩm do kém chất lƣợng về vệ sinh thực phẩm và thức ăn ở Việt
Nam vẫn chiếm tỷ lệ khá cao (bảng 1.1) [1].
Bảng 1.1. Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam từ năm 2007 - 2014
Kết quả điều tra
TT

Năm
Vụ ngộ độc (vụ)

Số mắc (người)

Chết (người)

1

2007

247

7329

55

2

2008

205

7828

61

3

2009

152

5212

35

4

2010

175

5664

51

5

2011

148

4700

27

6

2012

168

5541

34

7

2013

163

5000

28

8

2014

189

5.100

43

Trung bình/năm

181 (148 - 247)

5797(4700 - 7828)

42 (27 - 61)

Tổng cộng

1447

46376

334


5

Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong năm 2015,
toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực phẩm với 4965 ngƣời mắc và 23
trƣờng hợp tử vong.
Trong quý I năm 2016, toàn quốc ghi nhận 25 vụ ngộ độc thực phẩm với 969
ngƣời mắc, 669 ngƣời nhập viện và 2 trƣờng hợp tử vong. Nguyên nhân ngộ độc
thực phẩm do vi sinh vật chiếm 36%, do độc tố tự nhiên chiếm 12%, do hoá chất
4% và 48% vụ chƣa xác định đƣợc nguyên nhân. Trong 9 vụ ngộ độc thực phẩm do
vi sinh vật thì ghi nhận 4 vụ do tụ cầu vàng S. aureus, 1 vụ liên quan đến E. coli còn
lại chƣa xác định rõ nguyên nhân.
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus và độc tố ruột SEB trên thế giới
và tại Việt Nam
Trên thế giới, vụ ngộ độc thực phẩm lớn đầu tiên đƣợc Vaughan và Sternberg
phát hiện trong pho mát có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan Mỹ. Năm 1930, Dack xác định đƣợc vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh
[54]. Vào năm 1934, Jordan và Burrows tìm thấy sự hiện diện của Staphylococci
trong 9 vụ ngộ độc thực phẩm [42].
Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trƣờng hợp ngộ độc thực
phẩm do S. aureus đƣợc ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là
ruốc); 22% các trƣờng hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7%
từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [60].
Tại Mỹ, ƣớc tính mỗi năm có 241000 ngƣời bị ngộ độc thực phẩm do S. aureus.
Chi phí điều trị và chăm sóc sức khoẻ cho mỗi trƣờng hợp bị ngộ độc thực phẩm do S.
aureus là 695 đô la, tổng chi phí hàng năm là 167.597.860 đô la [43]. Trong số các
trƣờng hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus đƣợc báo cáo giữa các năm 1975 và 1982
thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ salad, 11,3% từ gia cầm, từ bánh

ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [33].
Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S. aureus đƣợc ghi nhận trong hai
năm (1999 - 2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là pho mát) (32%), thịt
(22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng


6

(11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [34]. Ghi nhận trong năm
2012 đã xảy ra 1288 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó ngộ độc thực phẩm do S.
aureus là 300 (23%) vụ [51].
Tại Nhật Bản cũng đã xảy ra 2 vụ ngộ độc S. aureus lớn vào tháng 8 năm 1955
làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trƣờng tiểu học ở Tokyo và tháng 7 năm
2000 làm 14000 ngƣời ở 6 tỉnh bị ngộ độc. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều
do họ đã uống sữa bị nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow. Vụ ngộ độc sữa tháng 7
năm 2000 khiến tập đoàn Snow phải bồi thƣờng cho 4000 nạn nhân 20000
Yên/ngƣời/ngày và Tổng giám đốc bị cách chức [1].
Ở Đài Loan, từ năm 1986 đến năm 1995 ngộ độc thực phẩm do S. aureus
chiếm 30% trong tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm. Tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc
thực phẩm do tụ cầu tại một trƣờng trung học ở thành phố Đài Trung làm 10 trong
số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc sau khi ăn sáng 2-3 giờ [59].
Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm S. aureus
và độc tố của S. aureus ở các nƣớc diễn tiến ngày càng trở nên phức tạp, trên quy
mô rộng, không phân biệt trình độ phát triển (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Sơ bộ tình hình nhiễm độc S. aureus trên thế giới trong những năm gần đây
STT

Địa điểm

Thời gian

Loại thực phẩm

Số ngƣời mắc

1

Bỉ

2007

Bánh Hamburger

15

2

Áo

2007

Sữa, sữa cacao, sữa vani

166

3

Pháp

2008

Mì ống salad

100

4

Nhật Bản

2009

Bánh Crepes

75

5

New Zealand

2010

Hàu, phomai, thịt xông khói

22

6

Ý

2011

Salad hải sản

26

7

Úc

2012

Cơm chiên, thịt gà

22

8

Mỹ

2012

Thịt gà, lợn, xúc xích

35

9

Mỹ

2013

Thịt lợn

26

10

Pháp

2014

Cá hồi

31


7

Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus cao nhất là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những
nƣớc có tỷ lệ nhiễm S. aureus cao.
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng,
thƣờng gặp nhất là các thực phẩm đƣờng phố (46,6%), xúc xích (96,6%), bánh gato
(85%), Patê (83,3%)…[5]. Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế
biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt. Tụ cầu thƣờng nhiễm trực tiếp vào thực
phẩm từ tay ngƣời chế biến hay do ho, hắt hơi. Cùng với việc bảo quản thực phẩm
không đúng quy cách, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu sẽ là điều kiện để chúng
tăng nhanh số lƣợng. Điều đáng lo ngại là độc tố đƣợc tạo ra trong suốt quá trình
phát triển của tụ cầu không gây ảnh hƣởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít
đƣợc chú ý và khó phát hiện [11], [48].

S. aureus có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều ngƣời trong cùng một thời
điểm khi họ cùng tiêu thụ một loại thực phẩm và có thể xảy ra với bất kì đối tƣợng
nào. Tuy nhiên, ngƣời già, trẻ em và những ngƣời có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc
và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [7]. Dựa theo bảng 1.3, chúng ta
nhận thấy tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus diễn ra khá phổ biến ở khắp
các tỉnh thành trong cả nƣớc.


8

Bảng 1.3. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 - 2016.
Địa điểm

STT

1

2

3

4

5

Trƣờng mầm non bán công Vĩnh Thọ Phú Thọ
Cty TNHH Alliace One, KCN Giao
Long - Bến Tre
Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng - Hải
Dƣơng

Vụ Bản - Nam Định
Nhà máy dệt may Haivine Kim Liên Nam Đàn - Nghệ An

Số ngƣời

Đối tƣợng

mắc

mắc

9/2007

100

Học sinh

6/2008

100

Công nhân

8/2009

160

Công nhân

12/2010

65

12/2011

200

Thời gian

Khách dự
đám cƣới
Công nhân
Khách dự

6

Bản Hùn - Chiềng Cọ - Sơn La

4/2012

300

7

Công ty TNHH Foremart - Hƣng Yên

7/2013

182

8

Yên Dũng - Bắc Giang

6/2014

181

10/2014

39

Học sinh

3/2015

229

Công nhân

4/2015

30

Học sinh

4/2016

243

Công nhân

9

10

11

12

Trƣờng THCS Nguyễn Gia Thiều Phƣờng 12 - Vũng Tàu
Công ty TNHH CY Vina - KCN Long
Đức - Trà Vinh
Trƣờng mầm non Sao Mai - Ninh Kiều
- Cần Thơ
KCN Minh Hƣng - Hàn Quốc, Chơn
Thành - Bình Phƣớc

đám cƣới
Công nhân
Khách dự
đám cƣới


9

Qua các số liệu trên chúng ta thấy, ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng S.
aureus chiếm tỷ lệ nhiễm khá cao ở Việt Nam và trên toàn thế giới. Trên thực tế,
bệnh làm mất nhiều thời gian và năng suất lao động cũng nhƣ tốn kém kinh phí cho
điều trị tại bệnh viện. Hơn thế, bệnh cũng gây thiệt hại đáng kể về kinh tế trong

ngành công nghiệp thực phẩm, các công ty cung cấp thực phẩm và nhà hàng. Do đó,
việc kiểm soát, nắm bắt tình hình ngộ độc thực phẩm gây ra bởi S. aureus đóng vai
trò quan trọng trong vấn đề sức khỏe của con ngƣời, kinh tế và xã hội.
Trong các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bởi độc tố của S. aureus, ngộ độc thực
phẩm bởi độc tố ruột SEB chiếm tỷ lệ khá cao. Tuy nhiên, trên thực tế, số ca mắc
hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB vẫn chƣa đƣợc thống kê cụ
thể. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình ngộ độc
thực phẩm do SEB nhƣ:
1. Bệnh nh nên ngƣời bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở
chuyên khoa.
2. Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thƣờng có nhiều bệnh có biểu
hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chƣa kết luận đúng bệnh.
3. Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực
phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ,
chủ yếu vẫn dựa vào các phƣơng pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời
gian kéo dài.
Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì
SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh, có thể dẫn
tới tử vong ở ngƣời.
1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus
1.2.1. Lịch sử phát hiện
- S. aureus đƣợc nhà khoa học Robert Koch phát hiện đầu tiên vào năm 1878
sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt.
- Năm 1880 Louis Pasteur tiến hành phân lập và nghiên cứu về S. aureus.


10

- Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ ngƣời Scotland - Alexander Ogston đã trình
bày tại hội nghị Hội phẫu thuật Đức lần thứ 9 một báo cáo khoa học trong đó ông sử

dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tƣơng đối đầy đủ vai trò
của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
- Năm 1926, Julius Von Darányi là ngƣời đầu tiên phát hiện mối tƣơng quan
giữa sự hiện diện của hoạt động enzym coagulase huyết tƣơng của vi khuẩn với khả
năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới đƣợc chấp
nhận rộng rãi [31].
1.2.2. Đặc điểm phân loại
Đặc điểm phân loại của tụ cầu vàng S. aureus đƣợc trình bày trong bảng 1.4.
Bảng 1.4. Phân loại khoa học S. aureus
Phân loại khoa học
Giới

Prokaryote

Ngành

Firmicute

Lớp

Cocci

Bộ

Bacillales

Họ

Staphylococcaceae

Chi

Staphylococcus

Loài

Staphylococcus aureus

Việc phân loại vi khuẩn tụ cầu có thể dựa trên yếu tố khác nhau nhƣ kháng
nguyên, phage, enzym coagulase:
 Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Vi khuẩn tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: Protein, polysaccharid, acid teichoic của thành tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên,
phân loại tụ cầu rất khó khăn nếu chỉ dựa trên yếu tố kháng nguyên.
 Phân loại bằng phage: Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc
hiệu rất cao. Do đó, đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong phân loại S.
aureus. S. aureus đƣợc phân vào các nhóm I, II, III, IV [4].


11

 Việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây
bệnh thƣờng dựa vào sự hiện diện của enzym Coagulase. Coagulase có khả năng
làm đông huyết tƣơng ngƣời và động vật khi đã đƣợc chống đông. Đây là tiêu
chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác. Coagulase có ở tất
cả các chủng tụ cầu vàng. Hoạt động của Coagulase giống nhƣ thrombokianase
tạo thành một “áo fibrinogen” trong huyết tƣơng. Coagulase có 2 loại: một loại
tiết ra môi trƣờng gọi là Coagulase tự do và một loại bám vào thành tế bào gọi
là Coagulase cố định. Dựa vào sự hiện diện của enzym Coagulase chia vi khuẩn
tụ cầu thành 2 nhóm:
- Tụ cầu có enzym coagulase: Nhờ enzym coagulase này mà trên môi trƣờng

nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn này
còn gọi là tụ cầu vàng. Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này là:
+ Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng.
+ Staphylococcus intermedius.
- Tụ cầu không có enzym coagulase: Vi khuẩn tụ cầu nhóm này không có
enzym coagulase nên khi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch máu chúng không tạo
thành khuẩn lạc khuẩn mầu vàng mà tạo thành khuẩn lạc có màu trắng ngà.
Do vậy vi khuẩn tụ cầu nhóm này thƣờng đƣợc gọi là tụ cầu trắng. Các vi
khuẩn nhóm này gồm:
+ Staphylococcus epidermidis.
+ Staphylococcus saprophyticus.
+ Staphylococcus haemolyticus.
+ Staphylococcus capitis.
+ Staphylococcus simulans.
+ Staphylococcus hominis.
+ Staphylococcus warneri.
+ Cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở ngƣời.


12

1.2.3. Đặc điểm vi khuẩn học
1.2.3.1. Hình dạng v kích thước
Vi khuẩn tụ cầu khuẩn hay Staphylococcus - có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp,
staphyle nghĩa là chùm nho (hình 1.1). S. aureus thuộc chi Staphylococcus nên mang
đặc điểm thuộc chi này, là những vi khuẩn có dạng hình cầu, gram dƣơng, tế bào có
đƣờng kính 0,5 - 1,5 µm (hình 1.2), các tế bào thƣờng tụm lại thành đám hình chùm
nho, đôi khi có thể đứng riêng rẽ, từ đôi, bốn tế bào, đám nhỏ trong các mẫu bệnh
phẩm. Tế bào không có lông, không có khả năng di động, không sinh nha bào.

Hình 1.1. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
(Nguồn: )

Hình 1.2. Vi khuẩn tụ cầu S. aureus Gram dƣơng dƣới kính hiển vi
(Nguồn: )
1.2.3.2. Đặc điểm hệ gen
Hiện nay các nhà khoa học đã thành công trong việc giải trình tự gen của các
chủng tụ cầu vàng. Nhƣ Steven và các cộng sự đã công bố trình tự bộ gen dài


13

2.809.422 bp của chủng S. aureus COL và kết quả đƣợc ghi nhận trên Genbank với
mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Nhiều
chủng tụ cầu vàng khác đã đƣợc giải trình tự gen và đƣợc ký hiệu: Newman,
UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 v.v. [15], [36].
1.2.3.3. Đặc điểm sinh hoá
- S. aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi chính vì thế chúng
phân bố rộng rãi trong tự nhiên. S. aureus phát triển ở dải nhiệt độ rộng 7oC - 48oC
(khoảng nhiệt độ tối ƣu là 30oC đến 37oC) [56], pH = 4,2 - 9,3 (khoảng pH tối ƣu là
7 đến 7,5) [19], nồng độ muối NaCl lên đến 15%, chịu khô, nó có thể sống sót trong
môi trƣờng khắc nghiệt, nhƣ trong mũi ngƣời, trên da hoặc trên quần áo. S. aureus
có thể tồn tại trên tay và trên bề mặt môi trƣờng trong một khoảng thời gian dài sau
khi tiếp xúc [45].
- Tụ cầu vàng có hệ thống enzym phong phú, những enzym thƣờng đƣợc dùng
trong chẩn đoán là:
+ Coagulase có ở tất cả các chủng tụ cầu vàng và chia thành 2 loại: coagulase
tự do đƣợc tiết ra môi trƣờng và coagulase cố định bám vào vách tế bào.
+ Catalase xúc tác chuyển hoá hydrogen peroxid thành nƣớc và oxygen.
Catalase có ở tất cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu.

+ Enzym deoxyribonuclease có vai trò enzym phân giải DNA.
- Tụ cầu vàng có khả năng lên enzym và sinh acid từ mannitol, trehalose,
sucrose.
1.2.3.4. Khả năng đề kháng
Vi khuẩn tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hoá chất cao
hơn các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 80°C trong một giờ trong
khi đó các vi khuẩn khác thƣờng bị diệt ở 60°C trong 30 phút. Khả năng chịu
nhiệt thƣờng phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (48°C) mà vi
khuẩn có thể phát triển. Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian
dài tồn tại ở môi trƣờng [3].


14

Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá
hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu vàng.
Nhạy cảm thay đổi với kháng sinh đây là điều đáng quan tâm và lo ngại.
Nhiều chủng có khả năng đề kháng với penicillin và các loại kháng sinh khác [2].
Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất đƣợc enzym penicillinase (beta - lactamase)
nhờ gen của R-plasmid. Enzym này phá huỷ vòng beta - lactam (cấu trúc cơ bản của
các kháng sinh nhƣ penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline) làm cho các
kháng sinh này mất tác dụng. Một số dòng kháng lại đƣợc methicillin gọi là
methicillin resistant Staphylococcus aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra đƣơc
cac protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh. Hiện nay một số rất ít tụ cầu còn
đề kháng đƣợc với cephalosporin các thế hệ. Kháng sinh đƣợc dùng trong các
trƣờng hợp này là vancomycin. Trong phòng thí nghiệm, ngƣời ta đã tìm thấy
plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus,
và ngƣời ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên hoặc trong
đƣờng tiêu hóa. Trong những năm gần đây việc thay thế kháng sinh cũ bằng
vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin VRSA

(Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus) [61].
Khảo sát tính chất kháng kháng sinh của những chủng S.aureus phân lập từ
các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2005, cho thấy có
đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng
Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin [9].
1.2.3.5. Sự phân bố
S. aureus có mặt ở các môi trƣờng đất, nƣớc, không khí, trên cơ thể động vật,
đặc biệt là ngƣời, chủ yếu ở vùng mũi họng (30%), nách, âm đạo, mụn nƣớc trên da,
các vùng da trầy xƣớc và tầng sinh môn. Chúng nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua
con đƣờng chế biến có công đoạn tiếp xúc trực tiếp với ngƣời. Sự hiện diện với mật
độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế
biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên,
điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy


15

ra khi S. aureus đƣợc phân lập tạo độc tố. Ngƣợc lại, chỉ với một lƣợng nhỏ S.
aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc [54].
Có 10 - 50% dân số vẫn sống khoẻ mạnh dù mang S. aureus. Tỷ lệ mang
vi khuẩn S. aureus cao hơn ở các nhân viên y tế, các bệnh nhân lọc máu có
bệnh tiểu đƣờng, nghiện hút, nhiễm HIV hoặc mắc các bênh da mãn tính.
Khoảng sau 2 tuần nằm viện tỷ lệ này lên đến 30% - 50% và thƣờng nhiễm các
chủng kháng thuốc [10].
1.2.3.6. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy; hiếu khí hay kị khí tùy nghi;
phát triển ở dải nhiệt độ và pH rộng; nồng độ muối cao. Nhu cầu dinh dƣỡng
cho sự phát triển của S. aureus thay đổi tuỳ thuộc vào từng dòng. Tụ cầu vàng
bền vững khi ở nồng độ đƣờng cao, ở nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát
triển, trong khi các vi khuẩn khác nhƣ Shigella và Salmonella bị ức chế, nhƣng

bị ức chế bởi nồng độ 60% [6].
Trên môi trƣờng thạch thƣờng, vi khuẩn tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S
đƣờng kính 1 - 2 mm, tròn, lồi, bóng láng, óng ánh. Hầu hết các dòng S. aureus đều
tạo sắc tố vàng sau 24h ở 370C. Sắc tố đƣợc tạo ra nhiều hơn trong môi trƣờng có
lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà chúng có thể sử dụng [28]. Môi trƣờng
thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh và tạo vòng tan máu. Vòng tan máu phụ
thuộc vào từng chủng nhƣng chúng đều có vòng tan máu h p hơn so với đƣờng kính
khuẩn lạc. Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, ε, δ. Trên
môi trƣờng canh thang, sau 5 - 6 giờ tụ cầu vàng làm đục môi trƣờng, sau 24 giờ làm
đục rõ, để lâu có thể lắng cặn [3].
1.2.3.7. Độc tố v khả năng gây bệnh
 Các loại độc tố của S. aureus
Dựa theo các nghiên cứu và các báo cáo khoa học, S. aureus sản sinh ra 11
độc tố (hình 1.3) bao gồm: độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc (TSST - Toxic
shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic; độc tố alpha; độc
tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung huyết tố