Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen của cây ba kích (morinda offcinalis how ) ở miền bắc việt nam

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. CÂY BA KÍCH ........................................................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................. 2
1.1.2. Phân bố và đặc tính sinh thái ................................................................. 2
1.1.3. Bộ phận dùng ......................................................................................... 3
1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................... 3
1.1.5. Tác dụng dược lý .................................................................................... 6
1.1.6. Tác dụng trong Y học cổ truyền ............................................................ 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI
TRUYỀN ......................................................................................................... 7
1.2.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR ............................................................. 7
1.2.2. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS .................................................. 8
1.2.3. Giới thiệu sơ lược về Kỹ thuật giải trình tự GEN (DNA sequencing) .. 9
1.2.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây Ba kích .......................................... 11
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 13
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 13
2.1.1. Mẫu nghiên cứu.................................................................................... 13
2.1.2. Dung môi, hóa chất .............................................................................. 14
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ............................................................ 14
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 15
2.2.1. Phân tích hình thái................................................................................ 15


2.2.2 Phân tích hóa học .................................................................................. 16
2.2.3. Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS .................................. 17
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 21
3.1. TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
......................................................................................................................... 21
3.1.1. Đa dạng sinh học các mẫu thuộc loài Morinda officinalis dựa vào đặc

điểm hình thái ................................................................................................. 21
3.1.2. Đặc điểm hình thái các mẫu thuộc chi Polygala ................................. 36
3.1.3. So sánh đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc loài Morinda officinalis
How. và mẫu Polygala sp. ............................................................................. 37
3.2. SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA CÁC MẪU BA KÍCH THUỘC LOÀI
MORINDA OFFICINALIS HOW. VÀ POLYGALA SP ............................ 38
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ADN ............................................................. 40
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .......................................................... 40
3.3.2. Kết quả phân tích các sản phẩm khuếch đại trên gel agarose .............. 41
3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA .................................................. 41
3.3.4. Cây phân loại trình tự ITS-rADN ........................................................ 53
Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 55
4.1. Về phân tích hình thái .......................................................................... 55
4.2. Về phân tích đặc điểm hóa học ............................................................ 56
4.3. Về phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị ITS ............................... 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
ADN
CTAB
dATP
dCTP
dGTP
dNTP
dTTP
EDTA

EtBr
ETS
HNIP
HPTLC
IGS
ITS
LSU
NCBI
PCR
RAPD
rDNA
Rf
rRNA
SSU
TAE
TLC
TWINSPAN

Tên đầy đủ
Acid Deoxyribo Nucleic
Cetyl trimethylammonium
bromide
2’-deoxyadenosin triphosphat
2’-deoxycytidin-5’-triphosphat
2’-deoxyguanosin triphosphat
deoxynucleotide Triphosphate
2’-deoxythymin triphosphat
Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Ethidium bromide
External Transcribed Spacer

High performance thin layer
chromatography
Intergenic spacer
Internal Transcribed Spacer
Large subunit
National Center for Biotechnology
Information
Polymerase Chain Reaction
Random Amplification of
Polymorphic DNA
Ribosomal Deoxyribo Nucleic
Acid
Retention factor
Ribosomal Ribonucleic Acid
Small subunit
Tris base-acetate-EDTA
Thin-layer chromatography
Two way indicator species
analysis

Diễn giải
Acid Deoxyribo Nucleic
Cetyl trimethylammonium bromide
2’-deoxyadenosin triphosphat
2’-deoxycytidin-5’-triphosphat
2’-deoxyguanosin triphosphat
deoxynucleotide Triphosphate
2’-deoxythymin triphosphat
Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Ethidium bromide
Vùng phiên mã bên ngoài
Phòng tiêu bản Trường Đại học
Dược Hà Nội
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Vùng biến động bên trong
Vùng phiên mã bên trong
Tiểu đơn vị lớn
Trung tâm quốc gia về thông tin
công nghệ sinh học
Phản ứng chuỗi trùng hợp
DNA đa hình khuếch đại ngẫu
nhiên
Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid
Hệ số lưu giữ
Ribosomal Ribonucleic Acid
Tiểu đơn vị nhỏ
Tris base-acetate-EDTA
Sắc ký lớp mỏng
Phép phân loại đa biến bảng 2
chiều loài chỉ thị


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 2.1. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR ........................................................ 18
Bảng 2.2. Chu trình khuếch đại ADN .........................................................................18
Bảng 3.1 Các đặc điểm khác nhau giữa 11 mẫu Morinda officinalis ............................... 29
Bảng 3.2 Các đặc điểm hình thái phân biệt các mẫu Morinda officinalis How. và các
mẫu Polygala sp. ...................................................................................................... 37
Bảng 3.3. Diện tích peak Nystose của 13 mẫu Ba kích ................................................40

Bảng 3.4 Kết quả giải trình tự ITS của 11 mẫu nghiên cứu .....................................42
Bảng 3.5. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu .............45
Bảng 3.6: Bảng so sánh gióng hàng ADN của 11 mẫu Ba kích thực hiện bằng phần
mềm Megav6.0 ......................................................................................................... 46
Bảng 3.7. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 11 mẫu .......................53
Bảng 4.1: Trình tự Gen vùng ITS của các mẫu Morinda Officinalis công bố trên NCBI
...................................................................................................................................57


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Một số anthraquinon trong rễ Ba kích ............................................. 3
Hình 1.2: Một số iridoid có trong Ba kích .................................................................4
Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng chính trong rễ Ba kích ............................5
Hình 1.4. Một số hợp chất thuộc coumarin và sterol phân lập từ rễ Ba kích .................6
Hình 1.5: Sơ đồ vùng rDNA- ITS ..............................................................................9
Hình 3.1. Dạng sống của loài Morinda officinalis How. ...........................................22
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái rễ loài Ba kích Morinda officinalis How. ...................23
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái thân non loài Morinda officinalis How. ......................23
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái lá và lá kèm loài Morinda officinalis How. ................24
Hình 3.5. Đặc điểm bề mặt lá loài Morinda officinalis How. ....................................24
Hình 3.6. Cụm hoa loài Morinda officinalis How. ........................................................... 25
Hình 3.7. Các dạng hoa loài Morinda officinalis How. .............................................25
Hình 3.8. Đài hoa loài Morinda officinalis How. .......................................................25
Hình 3.9. Tràng hoa loài Morinda officinalis How. ...................................................26
Hình 3.10. Các dạng bộ nhụy loài Morinda officinalis How. ....................................26
Hình 3.11. Các dạng cụm quả loài Morinda officinalis How. ...................................27
Hình 3.12. Quả và hạt loài Morinda officinalis How. ................................................27
Hình 3.13. Phân loại các mẫu Morinda officinalis bằng phép phân loại đa biến
TWINSPAN............................................................................................................................ 35
Hình 3.14. Đặc điểm hình thái loài Polygala sp. .........................................................36

Hình 3.15. Sắc ký đồ dịch chiết methanol 13 mẫu Ba kích khai triển với hệ Ethyl
Acetat: Nước: Acid Acetic: Acid Formic (6,5:2,5:2:2) ở bước sóng 366nm và ở ánh
sáng thường sau khi phun thuốc thử ........................................................................39
Hình 3.16. Ảnh điện di ADN tổng số của 11 mẫu Ba Kích .....................................40
Hình 3.17. Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 11 mẫu Ba Kích với
thang chuẩn Marker: 100bp .....................................................................................41
Hình 4.1 Thực trạng bán giả Ba kích tại Sa Pa (Lào Cai) và Quản Bạ (Hà Giang) ....
...................................................................................................................................55
Hình 4.2. Cây phân loại 11 mẫu với các mẫu đã được công bố trên NCBI dựa trên
so sánh trình tự ITS-Radn ........................................................................................ 59


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ba kích (Morinda officinalis How.) là một vị thuốc được sử dụng rộng rãi
trong Y học cổ truyền và Y học hiện đại với tác dụng bổ thận dương, mạnh gân
xương. Trước đây, Ba kích được khai thác chủ yếu từ tự nhiên không những phục
vụ nhu cầu trong nước mà còn phục vụ xuất khẩu. Hiện nay, do sự khai thác quá
mức, dẫn đến nguồn Ba kích tự nhiên bị cạn kiệt. Nhiều địa phương như Bắc
Giang, Quảng Ninh, Lạng Sơn ... đã triển khai trồng Ba kích và đã mang lại những
hiệu quả kinh tế nhất định. Tuy nhiên các nguồn giống Ba kích được thu hái trong
tự nhiên từ rất nhiều nơi khác nhau điều này ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng
dược liệu và năng suất cây trồng. Hơn thế nữa dược liệu Ba kích còn được làm giả
mạo bởi một số cây thuộc chi Polygala; đặc biệt tại tỉnh Lào Cai (khu du lịch Sa
Pa) [10].
Trước đây có nhiều các nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học
của Ba kích nhưng chưa đủ để phục vụ công cuộc tiêu chuẩn hóa giống dược liệu
Ba kích mà cần có thêm các nghiên cứu đánh giá về tính đa dạng di truyền các
nguồn gen của cây Ba kích thông qua đặc điểm hình thái, đặc biệt thông qua phân
tích sinh học phân tử - phương pháp hiện đại đang được sử dụng nhiều trên thế
giới cũng như những cập nhật mới trong tiêu chuẩn dược liệu.

Vì các lý do đó, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen của cây
Ba kích (Morinda officinalis How.) ở miền Bắc Việt Nam” được thực hiện với
các mục tiêu sau:
1. Phân tích đặc điểm hình thái và định tính hóa học của một số mẫu Ba kích
thuộc loài Morinda officinalis How. và một số mẫu làm giả Ba kích thuộc
chi Polygala ở khu vực miền Bắc Việt Nam.
2. Xác định tính đa dạng di truyền của một số mẫu Ba kích thuộc loài
Morinda officinalis How. ở khu vực miền Bắc Việt Nam.

1


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. CÂY BA KÍCH
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học:Morinda officinalis How.
Tên thường gọi: Ba kích
Tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây một gà, Chấu phóng xì (Hải Ninh),
Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim, Sáy cày (Thái), Chày kiang dòi (Dao),
Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [8], [11].
Cây thảo, sống lâu năm, leo bằng thân cuốn, dài hàng mét. Rễ hình trụ,
mập, vặn vẹo, vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, trên mặt vỏ có
nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi [4]. Thân hình tròn trơn, màu nâu xám, có
nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau. Thân non màu tím có lông, sau
nhẵn, lóng dài 5-10cm [1],[2],[4],[9]. Lá mọc đối. Cuống dài 5-7mm. Phiến lá
hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14cm, rộng 2,5-6cm,
lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở gân và mép lá, màu
xanh lục, sau già ít lông hơn và màu trắng, gân phụ 8-9 cặp. Lá kèm mỏng,
ôm sát vào thân [1],[2],[3],[4]. Cụm hoa mọc thành tán ở đầu cành, dài 0,31,5cm. Hoa nhỏ màu trắng, sau hơi vàng. Đài hình chén hay hình ống gồm

những lá đài nhỏ phát triển không đều. Tràng hàn liền ở phía dưới thành ống
ngắn. Nhị 4, bầu dưới. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi
chín màu đỏ, mang đài tồn tại ở đỉnh, có long [4],[9],[11]. Mùa hoa: Tháng 56. Mùa quả: Tháng 7- 10 [3],[4],[5].
1.1.2. Phân bố và đặc tính sinh thái
Ba kích mọc hoang ở ven rừng thứ sinh, trung du và miền núi. Cây
cũng được trồng nhiều nơi, trồng bằng những đoạn rễ trên đất nhiều màu, ẩm,
mát, được che bóng có giá tựa cho cây leo [4].
Ba kích được gặp nhiều ở Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Phú Thọ,

2


Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Bắc Ninh. Còn có cả ở Trung Quốc [4].
1.1.3. Bộ phận dùng
Rễ (Radix Morindae officinalis), có thể đào rễ quanh năm, tốt là vào mùa
thu đông, rửa sạch cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy cho gần khô, đập dẹt rồi phơi sấy
tiếp cho đến khô hẳn [4].
1.1.4. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu đã chứng minh rễ Ba kích có rất nhiều hợp chất thuộc
các nhóm như anthraquinon, iridoid (nhóm diterpenoid), terpenoid,
phytosterol, các sacchrid (nhất là nhóm oligosaccharid) và acid hữu cơ,
coumarin…
* Nhóm chất anthraquinon

Tên chất
Physcion

Rubiandin
1,8-dihydroxyanthraquinon
2-methylanthraquinon

R1

R2

R3

-OH

-H

-OH

-CH3 -OH

-H

-H

-OH

-H

-H

-H

-OH

-H

-CH3 -H

-H

-H

OCH3

R6

R8

-CH3 -H

Hình 1.1: Một số anthraquinon trong rễ Ba kích
Một số anthraquinon được phân lập từ Ba kích như: Rubiadin, rubiadin1-methyl ether, 1-hydroxy anthraquinon, 1-hydroxy-2-methyl anthraquinon,
1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy anthraquinone [15], 1,6-dihydroxy-2-methoxy
anthraquinon, 1-hydroxy-2-methoxy anthraquinon, physcion, 2-methylanthraquinon, 1-hydroxy-2-hydroxymethyl

anthraquinon, 1,3-dihydroxy-2-

methoxy-anthraquinon, 1,4-dimethoxy-2-hydroxy anthraquinone [24], 1,4dihydroxy-2-methyl-anthraquinon, 1-methoxy-2-hydroxy anthraquinone [30],
3


alizarin-1-methylether,

lucidin-ω-methylether,

1-hydroxy-2,3-dimethyl-

anthraquinon, 1-hydroxy-3-hydroxymethyl anthraquinon, 3-hydroxy-1,2dimethoxy-anthraquinon, 2-hydroxy-1-methoxy anthraquinon, 1,2-dihydroxy3-methyl-anthraquinon,

1,3,8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinon,

2-

hydroxymethyl-3-hydroxy anthraquinon, 2-methoxy-anthraquinon, alizarin-2methylether, 1,2-dimethoxy anthraquinon… (Hình 1.1), [21],[25],[34],[46].
* Nhóm chất iridoid glycosid (diterpenoid)
- Nhóm gắn đường glucose: Asperulosid, monotropein [27], asperulosid
tetra-acetat, morofficinalosid, acid asperulosidic [39], acid desacetylasperulosidic… [16]
- Nhóm gắn đường lacton: Morindoli, monotropein, morofficinalosid…
(Hình 1.2) [10],[28],[42],[43].
H3CO

O

HO
O

HO

2)

O
Glc

Morindoli

Monotropein

Morofficinalosid

Hình 1.2: Một số iridoid có trong Ba kích
* Nhóm chất terpenoid:
Một số terpenoid phân lập từ rễ Ba kích như: L-borneol-6-O-ß-Dapiosyl-ß-D-glucosid, acid rotungenic… [37], [38], [41], [42].
* Nhóm chất sacchrid
Hiện nay có nhiều công bố nhóm chất saccharid là nhóm hoạt chất có
tác dụng chính trong tác dụng cường dương của Ba kích, một số saccharid đã
được phân lập từ Ba kích như: Nystose, fructofuranosyl-nystose, inulin-type

4


hexasaccharid

and

heptasaccharid,

sucrose,

inulin-type

trisaccharide,

inulotriose, inulotetrose, inulopentose, 1-kestose (nhóm oligosaccharid),
Arabinose, galactose, galacturonic acid [30.], acidic polysaccharides (nhóm
monosaccharid)… (Hình 1.3). Hiện nay nystose đang được dùng để đánh giá

chất lượng trong chuyên luận Ba kích của một số quốc gia và vùng lãnh thổ
như Trung Quốc, Hồng Kông,… [18],[20],[21],[34].

Bajijiasu

Nystose

Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng chính trong rễ Ba kích
5) Nhóm coumarin: Scopoletin [35], [43]
6) Nhóm sterol: Một số phytosterol đã được phân lập từ rễ Ba kích như
sigmasterol, daucosterol [30],[34], β-sitosterol … [21].
7) Các acid hữu cơ : Acid fumaric, acid succinic…[21], [24].

Scopoletin

Sigmasterol

5


β-sitosterol

Daucosterol

Hình 1.4. Một số hợp chất thuộc coumarin và sterol phân lập từ rễ Ba kích
* Đánh giá chất lượng Ba kích bằng phương pháp hóa học:
- Theo Dược điển Việt Nam 4, trong chuyên luận Ba kích không có phương
pháp định lượng và chỉ có định tính bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng so với
dịch chiết của mẫu chuẩn.
- Theo Dược điển Hồng Kong 2012 với chuyên luận Ba kích đã sử dụng

phương pháp định tính và định lượng theo hợp chất Nystose.
- Theo Dược điển Trung Quốc 2010 với chuyên luận Ba kích đã sử dụng
phương pháp định lượng theo hợp chất Nystose.
1.1.5. Tác dụng dược lý
Cao chiết từ Ba kích có nhiều tác dụng khác nhau trong đó tác dụng
hướng sinh dục nam là tác dụng được quan tâm nhất. Dịch chiết rễ Ba kích có
tác dụng làm tăng nồng độ testosteron, tăng hormone vùng dưới đồi, tuyến
yên [40],[45], tăng cường khả năng tình dục [33] và có tác dụng chống oxy
hóa bảo vệ tinh trùng [36]. Đây là một trong những cơ chế chữa vô sinh và
yếu sinh lý ở nam giới.
Ngoài ra, Ba kích còn được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng khác :
Tác dụng tăng lực : Với liệu pháp chuột bơi, dịch chiết nước Ba kích
với liều 5-10g/kg cơ thể, dùng liên tiếp 7 ngày có tác dụng tăng cường sức
dẻo dai cho súc vật thí nghiệm [11],[17].
Tác dụng chống độc : Baijiasu phân lập từ Ba kích có tác dụng chống
lại khả năng gây độc thần kinh gây ra bởi beta amyloid trong tế bào PC12
6


[14]; tăng cường khả năng tình dục của chuột đực và tác dụng bảo vệ, chống
oxy hóa của tinh trùng người [11].
Ngoài ra, còn một số tác dụng khác đã được chứng minh trên thực
nghiệm, gồm : Tác dụng hạ đường huyết và giảm stress [29] ; Tác dụng dự
phòng thiếu máu cục bộ nhờ cơ chế tăng canxi và các gốc tự do [11]; Tác
dụng tăng sinh tế bào xương và ngăn ngừa tiêu xương trên xương [47], thành
phần anthraquinon được chứng minh là có tác dụng giảm đau, chống viêm
[22], kháng khuẩn, chống HIV…[13],[29],[44]
1.1.6. Tác dụng trong Y học cổ truyền
Tính vị công năng : Ba kích có vị ngọt, tính ấm vào kinh thận.
Công dụng : Ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp.

Chủ trị : liệt dương, di mộng tinh, xuất tinh sớm, tử cung lạnh, khó
mang thai, kinh nguyệt không đều, bụng dưới đau lạnh, phong tê thấp đau,
gân xương mềm yếu [2].
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG
DI TRUYỀN
1.2.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp cho phép nhân
một trinh tự AND bất kỳ lên một số lượng bản sao gần như vô hạn tạo nguồn
vật liệu AND cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo.
PCR là quá trình khuếch đại của một trình tự AND đặc hiệu in vitro do
sự xúc tác của enzyme AND polymerase. Sự khuếch đại này nói chung được
thực hiện như các quy trình lặp lại gồm 3 giai đoạn: Biến tính gắn mồi kéo dài
chuỗi. Trong dung dịch có các đoạn mồi mỗi loại sẽ bắt cặp bổ xung với đầu
mạch đơn tương ứng: như vậy 1 mạch kép AND sau phản ứng do AND
polymerase thực hiện sẽ thành 2 mạch AND kép và có thể thực hiện chu kỳ
mới tạo thành số AND mới theo cấp số nhân 2n sau n chu kỳ [6].
Các bước tiến hành: Mỗi chu kỳ tiến hành theo 3 bước cơ bản:

7


Bước 1: Biến tính AND khuôn
Bước 2: Lai hay bắt gặp mồi
Bước 3: Kéo dài chuỗi
1.2.2. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS
rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò
quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được nghiên
cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hoá cho bất kỳ
protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan
mật thiết tới quá trình tiến hoá. Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh

vật và có cùng nguồn gốc. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên
được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các
sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có
tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng
tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều đoạn mồi cũng được thiết
kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi
sinh vật [32].
rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trở
thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS. Vùng phiên mã 18S kết
thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm
vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của
ribosome RNA. Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA),
nhưng bị cắt trước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, tuy nhiên ITS
lại có chức năng trong sự hình thành ribosome. Ở đầu kết thúc 5’ của 18S
và đầu kết thúc 3’ của 28S, cũng có một vùng được biết đến là ETS.
IGS là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA. Tuy nhiên vùng không gian không
phiên mã của những rDNA chứa trình tự kết thúc phiên mã của những
gene rRNA.

8


Hình 1.5: Sơ đồ vùng rDNA- ITS
Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm
xen kẽ với các vùng ITS và các vùng ETS. Giữa các nhóm gen gồm nhiều
bản sao lập lại là vùng không phiên mã . Có một rDNA 5S thường không có
vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S
thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm [23].
rDNA 18S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8S có kích
thước rất nhỏ và ít có sự biến đối song rRNA 5S là thành phần không thể

thiếu của nu-LSU- rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy
quá trình tổng hợp protein [31].
Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử
dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh
trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng
loài [23].
Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA)
được tìm thấy như những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành từng cặp.
Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S
và 5,8S) và một vùng không phiên mã. Trong vùng phiên mã, ITS được tìm
thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2.
1.2.3. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật giải trình tự GEN (DNA sequencing)
Kỹ thuật giải trình tự Gen là công trình được công bố bởi Maxam và
Gilbert năm 1977. Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này được cải tiến rất
nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của máy tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ
của phương pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật giải trình tự Gen trở
9


thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome.
Phương pháp hóa học giải trình tự DNA
Nguyên tắc của phương pháp này là:
(1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải
giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);
(2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể
làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA.
Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc
methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và
Cytosine, hydrazine và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến
đổi Guanine và Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với

Adenine ưu tiên hơn Cytosine [26].
Phương pháp enzyme giải trình tự DNA:
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một
vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã
được xác định rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này
vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó
tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của
vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA
polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide
triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là
ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP
tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và
mỗi ống cho một loại dNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA
polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch
DNA chèn trên vector và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà
ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì

10


ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của
đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp
được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng cũng giống như phương pháp
của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ
ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA.
Giải trình tự bằng máy tự động (Automated sequencer):
Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA
đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh
quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một

chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai
phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát
hiện các vạch điện di.
Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao
quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và
một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt
quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch
điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi
nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của
các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các
màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Với các ddNTP đánh dấu huỳnh quang khác nhau, các đọan trình tự
tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác nhau
tương ứng với nuleotide là A, hay T, hay C hay G. Chính nhờ vậy không
cần phải thực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng.
1.2.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây Ba kích
Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây Ba kích trước đây được tiến
hành chủ yếu sử dụng mồi RAPD.
Đặc điểm hình thái và di truyền của Ba kích đã được các nhà khoa học

11


Trung Quốc nghiên cứu. Năm 2006, Ding và cộng sự đã phân tích sự đa dạng
di truyền Ba kích bằng chỉ thị RAPD. Trong số 40 mồi RAPD được sử dụng
thì 14 mồi cho sản phẩm đa hình. Qua phân tích kết quả, tác giả đưa ra kết
luận cây Ba kích có sự đa dạng ở mức độ phân tử [19].
Ở Việt Nam, năm 2010 Nguyễn Cẩm Dương đã sử dụng chỉ thị ADN
(RAPD-PCR) để phân biệt các dạng hình thái khác nhau của loài Ba kích.
Nghiên cứu di truyền của 25 mẫu Ba kích thu ở Quảng Ninh, Phân tích phổ

băng điện di của kết quả thu được một số băng ADN đồng hình cho tất cả 25
mẫu Ba kích sử dụng trong nghiên cứu, có sự khác biệt giữa phổ băng ADN
của các mẫu có đặc điểm hình thái thân có lông và thân không có lông [7].
Nghiên cứu cũng cho thấy về di truyền giữa 25 mẫu loài Ba kích thu
thập trong nghiên cứu được chia thành hai nhóm lớn rõ rệt: Nhóm thứ nhất (I)
bao gồm các mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân có lông (L) có hệ số
tương đồng di truyền giữa chúng dao động từ 0,54 đến 0,88; nhóm thứ hai (II)
là các mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân không có lông (K) có hệ số
tương đồng di truyền giữa chúng từ 0,56 đến 0,95 [7].

12


Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu Ba kích thuộc loài Morinda officinalis How. được thu thập từ các
quần thể mọc tự nhiên từ vùng Đông Bắc (Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn,
Quảng Ninh); Tây Bắc (Lào Cai) trong giai đoạn từ tháng 1/2014 - 4/2014. Tổng
cộng có 11 quần thể được thu thập, được ký hiệu từ BK1 đến BK11 (Phụ lục 1).
Các mẫu này được trồng, chăm sóc, trong cùng một điều kiện tại thôn Bà Gò, xã
Nghĩa Phương, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang từ tháng 4/2014 đến tháng
6/2016.
- Mẫu "Ba kích" thuộc chi Polygala được thu thập tại tỉnh Lào Cai, từ
tháng 4/2016 - 6/2016, được ký hiệu là BK12, BK13 (Phụ lục 1).
TT

KÝ

ĐỊA ĐIỂM THU MẪU

HIỆU

SỐ HIỆU TIÊU
BẢN

MẪU

1

BK1

Xã Yên Định, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang

HNIP/18287/16

2

BK2

Xã Tuấn Đạo, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang

HNIP/18288/16

3

BK3

Xã An Thượng, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang

HNIP/18289/16

4

BK4

Xã Tràng Lương, huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh

HNIP/18290/16

5

BK5

Xã Thượng Yên Công, huyện Uông Bí, tỉnh Quảng Ninh

HNIP/18291/16

6

BK6

Xã Lương Mông, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh

HNIP/18292/16

7

BK7

Xã Đại Thành, huyện Tiên Yên, tỉnh Quảng Ninh

HNIP/18293/16

8

BK8

Xã Đại Đồng, huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn

HNIP/18294/16

9

BK9

Xã Quân Chu, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên

HNIP/18295/16

10

BK10 Xã Lam Vĩ, huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên

HNIP/18296/16

11

BK11 Xã Thanh Phú, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

HNIP/18297/16

12

BK12 Xã Sa Pả, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

HNIP/18298/16

13

BK13 Xã Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

HNIP/18299/16

13


- Mẫu phân tích đặc điểm hình thái: Toàn cây.
- Mẫu phân tích thành phần hóa học: Rễ cây. Riêng rễ của Morinda
officinalis được trồng trong cùng điều kiện tại thôn Bà Gò, xã Nghĩa Phương,
huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Các mẫu rễ được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô ở
nhiệt độ 60 0C, xay thành bột thô.
- Mẫu phân tích đa dạng di truyền: Lá cây.
- Các mẫu này được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Phòng Tiêu bản
Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP ),số hiệu mẫu từ HNIP/18287/16 đến
HNIP/18299/16.
2.1.2. Dung môi, hóa chất
- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam IV.

- Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck).
- Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng
Sigma và Merck gồm có CTAB, tris base, boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X
orange loading dye solution, Taq Polymeraza (Sigma); ethanol, 2-propanol, acetic
acid glacial, phenol, chloroform, isoamyalcohol, agarose, các mồi ITS (Merck).
Danh sách các mồi ITS (White et al. 1989) (Sigma):
+ ITS1; trình tự Nucelotid: GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG
+ ITS2; trình tự Nucelotid: CACGCTTCTCCAGACTACA
- Chất chuẩn Nystose (hàm lượng 98%) (Baoji Guokang Bio
Technology - Trung Quốc).
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.1.3.1. Phân tích hình thái:
Kính lúp soi nổi Leica EZ4, máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D, Canon
SD4000IS tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.3.2.2. Nghiên cứu hóa học

14


- Tủ sấy SHELLAB.
- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g.
- Máy xác định hàm ẩm AND MF-50.
- Hệ thống chiết siêu âm.
- Máy cô quay Buchi.
- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: Máy chấm
sắc ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần
mềm phân tích winCATS và VideoScan.
- Các dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ nhiều thể tích, bình định mức nhiều thể
tích, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn.

2.3.2.3. Nghiên cứu di truyền
- Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu -230C (Biomedical Freezer – Sanyo).
- Dụng cụ tách chiết bao gồm: Chày, cối sứ, máy ly tâm để bàn tốc độ cao
Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -300C, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml), bể ổn nhiệt
Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA.
- Dụng cụ nhân gen: Eppendorf Mastercycler Pro S, máy soi chụp ảnh gen
UVP Gel-docIt , máy điện di Consort EV 222.
- Dụng cụ giải trình tự gen: máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer,
máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Therma Cycler (BIO-RAD).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân tích hình thái
Các đặc điểm hình thái được quan sát và ghi chép tạo thành các biến phân
loại bao gồm: dạng sống; lá (cuống lá: hình dạng cuống lá; kích thước cuống lá,
bề mặt; gốc lá: hình dạng gốc lá; phiến lá: hình dạng; chỉ số lá; hình dạng gân lá
(gân chính, gân phụ; gân cấp 3); số lượng gân lá; bề mặt lá; hình dạng mép lá;
hình dạng ngọn lá, bề mặt trên lá, bề mặt dưới lá), lá kèm (cách đính, màu sắc,
hình dạng, bề mặt, độ dài); thân (bề mặt thân, màu sắc thân non, màu sắc thân

15


già), quả (cách mọc, số quả trên cụm; bề mặt), hạt (số hạt). Tổng cộng có 35 biến
được sử dụng (Phụ lục 2).
Các mẫu và biến số của nó được lập thành ma trận phân loại và được phân
tích bằng phép phân loại đa biến bảng 2 chiều loài chỉ thị (TWINSPAN), sử dụng
phần mềm PCORD phiên bản 4.0.
Tên khoa học được xác định dựa trên phương khóa phân loại và mô tả
loài trong các tài liệu thực vật trong nước. Các mẫu sau khi tra khóa được so
sánh đối chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của từng loài tham khảo từ
mẫu lưu tại phòng tiêu bản Paris, New York và Kew.

2.2.2 Phân tích hóa học
Định tính Nystose trong rễ các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí
lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC).
1) Chuẩn bị mẫu:
a. Mẫu chuẩn
Chuẩn Nystose: Hòa tan chính xác 100 mg Nystose chuẩn vào bình định
mức 5 ml bằng methanol. Siêu âm trong 15 phút cho tan hết. Bổ sung methanol
vừa đủ đến vạch, lắc đều.
b. Mẫu thử
Cân chính xác khoảng 0,5g bột, chiết siêu âm với 10ml Ethanol 3 lần mỗi
lần 20 phút. Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cô cất quay ở áp suất giảm đến
cắn. Hòa tan cắn trong 5ml methanol, lọc. Dịch lọc được sử dụng làm mẫu để tiến
hành xác định sắc kí lớp mỏng.
2) Thực hiện:
- Bản mỏng: Bản mỏng) được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Kích thước
bản mỏng 20 × 10 cm.
- Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm
mẫu. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8 mm. Khoảng cách giữa vết

16


đầu tiên so với vết mép bản mỏng là 15 mm. Độ dài băng chấm 8,0 mm và thể
tích chấm mỗi vết là 2,0 μl.
- Hệ dung môi khai triển: Ethylacetat : Nước : Acid formic : Acid Acetic
(6,5:2,5:2:2).
- Điều kiện chạy HPTLC:
+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 260C; độ ẩm tương đối 65%.
+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml.
+ Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút.

+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 4 phút.
+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80,0 mm.
- Bản mỏng được nhúng thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN
IV), sau đó sấy ở 1050C trong 15 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường.
- Chụp ảnh bản mỏng, tính toán giá trị Rf tương ứng của vết chuẩn Nystose.
2.2.3. Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS
1) Tách chiết ADN tổng số:
Sử dụng phương pháp CTAB của P. Doyle và Doyle (1987) có một số cải
tiến nhỏ đã được lựa chọn để tiến hành tách chiết ADN từ 11 mẫu nghiên cứu.
- Quy trình:
+ Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C.
+ Nghiền khoảng 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng
đến khi thành dạng bột mịn.
+Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%.
Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M,
CTAB 2%.
+ Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
+ Bổ sung chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm
10.500 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C. Hút dung dịch phía trên chuyển
sang ống mới.
+ Tiếp tục chiết lần 2 bằng chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN.

17


+ Kết tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ.
+ Ly tâm 10.500 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Lấy tủa.
+ Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan
trong đệm TE.

+ Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 370C trong 1 giờ.
2) Khuếch đại ADN (PCR):
- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần trình bày ở Bảng 2.1
Bảng 2.1. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

Nước cất hai lần khử ion

8,4

2

Buffer Mg+ 25 Mm

1,5

3

dNTPs 10 Mm

0,3

4

Taq ADN polymerase 5 U/µl

0,8

5

Mồi ITS1 10 µM

1,5

6

Mồi ITS8 10 µM

1,5

7

DNA

1

Tổng thể tích của một phản ứng

15,0

Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện trên
máy Mastercycler epgradient S theo chu trình ở Bảng 2.2
Bảng 2.2. Chu trình khuếch đại ADN
Các bước

Nhiệt độ(0C)

Thời gian

1

94

5 phút

2

94

1 phút

3

52

45 giây

4

72

50 giây

5

Lặp lại từ bước 2, 35 lần

6

72

7 phút

7

4

∞

18


Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung
4µl ADN Sequencing Stop Solution (Bao gồm: 10 mM NaOH + 95% formamide
+ 0,05% bromophenol + 0,05% xylene cyanol).
3) Điện di ADN trên gel agarose:
Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn
toàn. Để nguội 45-50C bổ sung 2,5 l ethidium bromide, đổ vào khuôn gel đã
được chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển
khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di
sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm.
+ Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4l loading dye và tra vào các
giếng trên gel.
+ Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với

bộ nguồn.
+ Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ
liên kết với EtBr.
4) Thôi gel theo kit Qiagen:
1. Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào
ống eppendorf 2ml.
2. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 thể tích gel (100mg
~100μl).
3. Ủ ở nhiệt độ 500C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn.
4. Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng,
nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl
sodium acetate 3M, pH 5.
5. Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ
13.000 vòng/phút.
6. Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000
vòng/ phút để loại hết agarose dư thừa.
7. Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút
sau đó ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút.

19


8. Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch.
9. Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng của cột
QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút, thu lượng ADN tinh sạch.
5) Giải trình tự:
Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty
Macrogen (Hàn Quốc). Sau đó các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng
chương trình MEGA v5.1 để tạo cây đa dạng.

20