Nghiên cứu đặc điểm thực vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của dây hoàng liên (arcangelisia flava (l ) merr )

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ ............................................ 2
1.1.1. Đặc điểm chung của các cây thuộc họ Tiết dê ................................ 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari ............................ 3
1.1.3. Đặc điểm thực vật loài Arcangelisia flava (L.) Merr. .................... 4
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................. 4
1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG ....................................... 6
1.3.1. Tác dụng dƣợc lý của Arcangelisia flava (L.) Merr. ...................... 6
1.3.2. Tác dụng dƣợc lý của berberin........................................................ 7
1.3.3. Công dụng ....................................................................................... 8
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN
CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN ........................................................................... 9
1.4.1. Thành phần và cấu trúc ADN ......................................................... 9
1.4.2. Quá trình sao chép ADN ............................................................... 10
1.4.3. Các loại chỉ thị ADN ..................................................................... 10
1.4.4. Chỉ thị RAPD trong kỹ thuật PCR ................................................ 11
1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG HẠ
ĐƢỜNG HUYẾT IN VITRO THÔNG QUA MÔ HÌNH HOẠT HÓA
AMPK.......................................................................................................... 13
1.5.1. Vài nét về bệnh đái tháo đƣờng .................................................... 13
1.5.2. Vai trò của AMPK trong đái tháo đƣờng ...................................... 13
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 15


2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .............................................. 15
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 15

2.1.2. Dung môi, hóa chất ....................................................................... 16
2.1.3. Máy móc, thiết bị .......................................................................... 18
2.1.4. Tế bào và động vật thí nghiệm ...................................................... 19
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 19
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật ................................................................. 19
2.2.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái.............................................. 19
2.2.1.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học .................................................. 20
2.2.2. Nghiên cứu về đa dạng di truyền .................................................. 20
2.2.2.1. Tách chiết ADN tổng số ............................................................. 20
2.2.2.2. Khuếch đại ADN bằng PCR sử dụng chỉ thị RAPD .................. 21
2.2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose....................................... 22
2.2.2.4. Phương pháp phân tích số liệu .................................................. 23
2.2.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................... 23
2.2.3.1. Định tính các nhóm chất hóa học trong mẫu nghiên cứu .......... 23
2.2.3.2. Định tính thành phần berberin, palmatin trong dịch chiết
alcaloid của mẫu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng .............................. 24
2.2.3.4. Định lượng berberin bằng HPLC .............................................. 26
2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu về tác dụng sinh học ............................ 29
2.2.4.1. Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng ..................................... 29
2.2.4.2. Thử tác dụng hạ đường huyết in vitro trên mô hình hoạt hóa
AMPK ...................................................................................................... 30
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................... 31
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và đa dạng di truyền của Dây hoàng
liên................................................................................................................ 31
3.1.1. Đặc điểm thực vật của Dây hoàng liên ......................................... 31
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái ..................................................................... 31


3.1.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu ....................................................... 34
3.1.1.3. Đặc điểm vi học bột dược liệu ................................................... 35

3.1.2. Đa dạng di truyền của Dây hoàng liên .......................................... 37
3.1.2.1. Kết quả tách chiết AND tổng số ................................................ 37
3.1.2.2. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng chỉ thị RAPD ................. 38
3.1.2.3. Xác định hệ số tương đồng di truyền và cây quan hệ di truyền 44
3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học của Dây hoàng liên ...................... 45
3.2.1. Định tính thành phần hoá học của Dây hoàng liên ....................... 45
3.2.1.1. Định tính bằng phản ứng hoá học ............................................. 45
3.2.1.2. Định tính berberin và palmatin trong Dây hoàng liên bằng sắc
ký lớp mỏng ............................................................................................. 48
3.2.1.3. Xây dựng cây phân loại quan hệ gần gũi của các mẫu AR1 –
AR8 dựa trên hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần ..... 49
3.2.2. Định lƣợng thành phần berberin trong các mẫu Dây hoàng liên .. 50
3.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ......................................................... 50
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................ 50
3.2.2.3. Định lượng berberin trong các mẫu .......................................... 56
3.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học của Dây hoàng liên .......................... 57
3.3.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết in vitro thông qua mô hình hoạt hoá
AMPK của Dây hoàng liên ..................................................................... 57
3.3.2. Thử độc tính cấp của Dây hoàng liên ........................................... 58
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 60
4.1. Về đặc điểm thực vật và đa dạng di truyền ...................................... 60
4.1.1. Về đặc điểm hình thái ................................................................... 60
4.1.2. Về đa dạng di truyền ..................................................................... 60
4.2. Về thành phần hoá học ....................................................................... 61
4.2.1. Về thành phần alcaloid có trong các mẫu nghiên cứu .................. 61
4.2.2. Về hàm lƣợng berberin trong Dây hoàng liên .............................. 63


4.3. Về tác dụng sinh học ........................................................................... 63
4.3.1. Tác dụng hoạt hoá AMPK của các mẫu Dây hoàng liên .............. 63

4.3.2. Độc tính cấp .................................................................................. 63
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
A

Diễn giải
Adenin

ACC

Acetyl Coenzym A Carboxylase

ADN

Acid DeoxyriboNucleic

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

AMPK

Adenosin monophosphat – activated protein kinase

AMP

Adenosin Monophosphat

ATP

Adenosin Triphosphat

bp

Base pair

Cr

Circularized RNA

CTAB

CetylTrimethylAmmonium Bromid

dATP

DeoxyAdenosin TriPhosphat

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

ĐTĐ

Đái tháo đƣờng

dTTP

DeoxyThymidin TriPhosphat

dGTP

DeoxyGuanosin TriPhosphat

dCTP

DeoxyCytidin TriPhosphat

DD

Dung dịch

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO
dNTPs
DPPH

DiMethyl SulfOxid
Nucleosid triphosphat
2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazyl

EC50

Effective concentration 50%

EDTA

Ethylen Diamin TetraAcetat

EtBr

Ethidium Bromide

EtOH

Ethanol

FBS

Fetal Bovine Serum

G

Guanin

HeLa

Tế bào ung thƣ cổ tử cung


HPLC

High-Performance Liquid Chromatographic

HPTLC
HRP
IC50

High-Performance Thin Layer Chromatographic
enzym HorseRadish Peroxidase
Inhibitory Concentration 50%

IPNI

International Plant Names Index

kDa

kiloDaltons

LC50

Lethal Concentration 50%

MCF-7
MRC5
ppm

Michigan Cancer Foundation-7
Medical Research Council cell strain 5
parts per million

PCR

Polymerase chain reaction

PTP1B

Protein Tyrosine Phosphatase 1B

RAPD

Random Amplified Polymorphic ADN

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Enzym Ribonuclease

RSD

Relative Standard Deviation

SDS

Sodium Dodecyl Sulfat

SCARs

Sequence Characterized Amplified Region

STT

Số thứ tự

T

Thymine

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

TT

Thuốc thử

TLC

Thin Layer Chromatographic

UV

Ultraviolet


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1.

Danh mục mẫu nghiên cứu

15

Bảng 2.2.

Các hóa chất dung môi sử dụng trong HPLC

16

Bảng 2.3.

Danh sách các mồi RAPD

16

Bảng 2.4.

Đặc điểm hình thái mô tả mẫu nghiên cứu

19

Bảng 2.5.

Thành phần phản ứng PCR-RAPD

21

Bảng 2.6.

Chu trình chạy PCR-RAPD

22

Bảng 3.1.

Bảng 3.2.

Bảng 3.3.

Bảng 3.4.

Bảng 3.5.

Bảng 3.6.

Bảng 3.7.

Các đặc điểm phân biệt về hình thái về lá của mẫu
nghiên cứu
Thống kê số băng ADN thu đƣợc của 8 mẫu loài Dây
hoàng liên với 26 mồi RAPD đa hình
Bảng tóm tắt thống kê phân tích đa hình PCR-RAPD
của 8 mẫu giống loài Dây hoàng liên
Số băng ADN thu đƣợc của 8 mẫu giống thuộc loài Dây
hoàng liên với mồi OPN6
Số băng ADN thu đƣợc của 8 mẫu giống loài Dây
hoàng liên với mồi OPF13
Số băng ADN thu đƣợc của 8 mẫu giống loài Dây
hoàng liên với mồi S208
Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 8 mẫu loài Dây hoàng
liên

33

38

39

40

42

43

44

Bảng 3.8.

Thành phần hoá học của Dây hoàng liên

45

Bảng 3.9.

Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký

51

Bảng 3.10.
Bảng 3.11.

Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của berberin

53

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp (mẫu 54


AR1)
Bảng 3.12.
Bảng 3.13.

Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp
Kết quả hàm lƣợng berberin trong các mẫu Dây hoàng

liên

55
56

Bảng 3.14.

Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK so với lô chứng

57

Bảng 3.15.

Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ

58

Bảng 3.16.

Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày

59


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1.

Họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.,)

2

Hình 1.2.

Arcangelisia flava (L.) Merr.

4

Hình 1.3.

Hình 1.4.

Công thức hóa học của các alcaloid chính trong
Arcangelisia flava (L.) Merr.
Công thức hóa học của các furanoditerpen đƣợc phân
lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr

5

5

Hình 3.1.

Các đặc điểm hình thái của cây Dây hoàng liên

32

Hình 3.2.

Hình dạng phiến lá của 8 mẫu loài Dây hoàng liên

33

Hình 3.3.

Đặc điểm vi phẫu thân (A) và lá (B) của mẫu AR1

35

Hình 3.4.

Đặc điểm bột thân của Dây hoàng liên

36

Hình 3.5.

Đặc điểm bột lá của Dây hoàng liên

37

Hình 3.6.

Hình 3.7.

Hình 3.8.

Hình 3.9.

Hình 3.10.

Hình 3.11.

Hình 3.12.

Ảnh điện di ADN tổng số của 8 mẫu giống loài Dây
hoàng liên
Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu Dây
hoàng liên với mồi OPN6 (M: marker 1kb)
Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu giống
nghiên cứu với mồi OPF13 (M: marker 1kb)
Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của 8 mẫu giống
nghiên cứu với mồi S208 (M: marker 1kb)
Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền 8 mẫu loài Dây hoàng
liên
Sắc ký đồ alcaloid toàn phần của thân mẫu AR7 ở bƣớc
sóng 366nm
Sắc ký đồ các dịch chiết alcaloid toàn phần của 8 mẫu
loài Dây hoàng liên (366 nm)

38

40

41

43

44

48

49


Hình 3.13.

Hình 3.14.

Hình 3.15.

Cây phân loại các mẫu Dây hoàng liên dựa vào thành
phần hoá học trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng
Sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi pha mẫu) (A), mẫu
chuẩn berberin (B), mẫu thử AR3 (C)
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và
diện tích pic (mAU.s) của berberin

Hình 3.16. Hình ảnh mức độ biểu hiện của p-AMPK và β-actin
Hình 3.17.
Hình 4.1.

Số lần tăng biểu hiện p-AMPK của lô ủ với mẫu thử so
với lô chứng
Cây phân loại các mẫu nghiên cứu

50

52

53
57
58
62


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam có nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú với các cấp đa
dạng sinh học từ mức thấp đến mức cao. Ƣớc tính ở Việt Nam có khoảng
6000 loài cây thuốc đang đƣợc sử dụng nhƣng hiện nay mới chỉ có khoảng
gần 4000 loài đƣợc phát hiện và tiến hành nghiên cứu. Trong đó, họ Tiết dê
(Menispermaceae Juss.,) với khoảng 40 loài thì có khoảng 17 loài đƣợc dùng
làm thuốc [4]. Các loài đã đƣợc nghiên cứu và khai thác nhiều trong họ Tiết
dê gồm có: Vàng đắng (Coscinium usitatum Pierre.), Hoàng đằng (Fibraurea
tinctoria Lour.), ... chủ yếu đƣợc dùng để chiết xuất berberin.
Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực
vật bậc cao và là hoạt chất đƣợc sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền
thống. Ngoài các tác dụng thƣờng đƣợc biết đến nhƣ tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp,… [3], [46], [66], berberin mới đƣợc
chứng minh có tác dụng hạ đƣờng huyết và chống lại một số dòng tế bào ung
thƣ [37], [55], [61].
Dây hoàng liên (Arcangelisia flava (L.) Merr.) là một loài thuộc họ Tiết
dê, đƣợc ghi trong Sách đỏ Việt Nam [2] và đã đƣợc sử dụng nhiều trong các
nền y học truyền thống và đƣợc các nhà khoa học trên thế giới quan tâm
nghiên cứu. Đây cũng là một trong các dƣợc liệu có chứa berberin [55], [59].

Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về loài này vẫn chƣa đƣợc đầy đủ.
Bên cạnh đó, các nguồn dƣợc liệu chứa berberin đang dần cạn kiệt do tình
trạng khai thác một cách bừa bãi, ồ ạt.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực
vật, tính đa dạng di truyền, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh
học của Dây hoàng liên (Arcangelisia flava (L.) Merr.)” đƣợc thực hiện với
ba mục tiêu sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi học và phân tích đa dạng di truyền
của Dây hoàng liên ở một số tỉnh miền Nam, Việt Nam.
2. Xác định thành phần hóa học và hàm lƣợng berberin có trong thân mẫu
nghiên cứu.
3. Thử độc tính cấp và tác dụng hạ đƣờng huyết in vitro của thân Dây hoàng
liên.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ
1.1.1. Đặc điểm chung của các cây thuộc họ Tiết dê
Họ Tiết dê (Dây mối, Phòng kỷ) – Menispermaceae Juss., 1789
Tên tiếng Anh: Moonseed family
Dây leo, rễ có khi phình thành củ. Lá đơn, nguyên, mọc so le; gân hình
chân vịt hay lọng; cuống lá thƣờng phồng lên ở gốc. Hoa nhỏ, đơn tính khác
gốc, mẫu 3, xếp vòng. Đài 6, xếp thành 2 vòng. Tràng 6, xếp thành 2 vòng.
Hoa đực có 6 nhị, xếp thành 2 vòng; có khi bao phấn nằm ở mép một đĩa mật
hình nấm. Hoa cái có (1)-3-(6-32) lá noãn rời nhau. Quả hạch hay quả mọng.
Hạt thƣờng có hình móng ngựa, phôi cong.

Hình 1.1. Họ Tiết dê (Menispermaceae Juss.,)

1. Dạng sống, 2-3. Hoa cái, 4-7. Các dạng hoa đực, 8. Sơ đồ hoa, 9.
Cụm quả, 10-11. Hạt hình móng ngựa.
Đa dạng và sử dụng: Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới.
Việt Nam có 18 chi và 40 loài, mọc hoang.
Ở Việt Nam, Menispermaceae có 17 loài thƣờng dùng làm thuốc với
các tên: Bình vôi, Dây xanh, Dây đau xƣơng, Dây ký ninh, Hoàng đằng, Dây
lõi tiền, Phòng kỷ, Sơn từ cô, Vàng đắng; trong đó có 5 loài dùng trong công

2


nghiệp dƣợc là Bình vôi, Dây đau xƣơng, Hoàng đằng, Phòng kỷ, Vàng đắng
[4].
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari
Cây dây leo lớn hóa gỗ. Lá có cuống dài, phiến lớn; gân gốc 3-5; gân lá
hình chân vịt, gân giữa mang mỗi bên 1-2 gân. Cụm hoa chùm ở nách lá, phân
nhánh hình bông. Hoa đực có 6 lá đài mà 3 cái ngoài nhỏ, 3 cái trong hơi lớn
hơn các cánh hoa; cánh hoa 3; nhị 9-12, chỉ nhị không rõ, bao phấn dính nhau
thành hình đầu, có 4 thùy ít phân biệt, mở ngang. Hoa cái có bao hoa nhƣ hoa
đực; lá noãn 3, mỗi cái chứa 2 noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc. Quả hạch
có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng –trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt
ngoài có lông. Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong cứng. Hạt có nhiều phôi nhũ
quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [76], [82], [85].
Số lƣợng loài và phân bố của chi Arcangelisia Beccari:
Hiện nay có 3 tên loài (IPNI) đã đƣợc biết đến trong chi Arcangelisia
Beccari bao gồm:
Arcangelisia flava (L.) Merr.
Arcangelisia gusanlung H.S.Lo
Arcangelisia tympanopoda Diels
Loài Arcangelisia flava (L.) Merr. phân bố rộng khắp vùng Đông Nam

Á, gặp nhiều ở Thái Lan, Việt Nam và Hải Nam (Trung Quốc). Ở nƣớc ta cây
mọc nhiều ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai. Ngoài ra, ngƣời ta còn thấy loài này
phân bố ở Sumatra, Java, Philippines, phía bắc Moluccas đến New Guinea
[60].

3


1.1.3. Đặc điểm thực vật loài Arcangelisia flava (L.) Merr.
Loài Arcangelisia flava (L.) Merr. có tên là Cổ an, Dây hoàng liên, Vảy
đắng.

Hình 1.2. Arcangelisia flava (L.) Merr.
1. Cành mang lá và quả; 2. Hoa đực đã nở; 3. Nụ hoa đực.
Dây leo to, có thể dài tới 20m, đƣờng kính thân có thể lên tới 5cm; gỗ
vàng tươi, mủ vàng; cành non không lông, đen, cũng nhƣ cuống lá. Phiến to
hay trung bình, (10)-12-25 x (4,5)-8-19cm, dai cứng, không lông, gốc tròn
hay hình tim, gân 5 từ đáy; cuống 3-15cm, phù 2 đầu, không có bẹ lá. Chùy
10-50 cm; hoa đực nhỏ, 3 lá đài ngoài, 3-3 lá đài trong, nhị thành đầu tròn.
Hoa cái có 6 lá đài, nhị lép nhƣ vảy, 3 lá noãn. Trái xoan, dài 2cm, vàng, trên
đế hoa phù rộng. Hạt hình bầu dục với nội nhũ và lá mầm bẻ gập lại [10],
[20].
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Niwat Keawpradub và cộng sự (2005) [59] đã chiết xuất và phân lập
đƣợc các alcaloid thuộc nhóm protoberberin trong Arcangelisia flava (L.)
Merr. với các hoạt chất chính là berberin, palmatin, jatrorrhizine.

4

Hình 1.3. Công thức hóa học của các alcaloid chính trong
Arcangelisia flava (L.) Merr.
Một

số

alcaloid

khác

nhƣ

columbamin,

dehydrocorydalmin,

homoaromolin và thalifendin cũng đƣợc phân lập từ thân của Arcangelisa
flava (L.) Merr. [63].
Toshisada Suzuki và cộng sự (2011) [71] đã chứng minh trong rễ của
Arcangelisia flava (L.) Merr. có chứa 2 hoạt chất thuộc nhóm furanoditerpen
là 2α,3α-epoxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic acid methyl ester và 2α,3α
epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester. Ngoài ra, có các chất khác
nhƣ fibraurin, fibleucin, 2β,3α-dihydroxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic acid2,17-lactone, p-hydroxy-benzaldehyd và vanillin cũng đƣợc chiết xuất và
phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr..

Hình 1.4. Công thức hóa học của các furanoditerpen đƣợc phân lập từ
Arcangelisia flava (L.) Merr.
(1): 2α,3α -epoxy-2,3,7,8α -tetrahydropenianthic acid methyl ester;
(2): 2α,3α epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester.

5


1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG
1.3.1. Tác dụng dƣợc lý của Arcangelisia flava (L.) Merr.
Niwat Keawpradub và cộng sự (2005) [59] trong nghiên cứu của mình
cũng đã chứng minh dịch chiết methanol và dịch chiết nƣớc của Arcangelisia
flava (L.) Merr. có khả năng chống oxy hóa trong thử nghiệm dùng DPPH với
EC50 lần lƣợt là 25,7±1,7 μg/ml và 68,3±0,8 μg/ml. Trong khi đó dịch chiết
chloroform và dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L.) Merr. lại thể
hiện khả năng gây độc tế bào trong thí nghiệm trên dòng tế bào MCF-7 với
IC50 lần lƣợt là 8,6±1,0 μg/ml và 7,7±0,6 μg/ml.
Nghiên cứu của Niwat Keawpradub và cộng sự cũng chỉ ra rằng các
hoạt chất thuộc nhóm protoberberin có trong Arcangelisia flava (L.) Merr.
cũng có tác dụng gây độc tế bào tôm nƣớc mặn và dòng tế bào MCF-7 với
LC50 và IC50 lần lƣợt nằm trong khoảng 37 – 206μg/ml (110 – 611μM) và 1 –
4μg/ml (3,0 – 11,5μM). Trong đó, đáng chú ý là berberin có khả năng gây độc
tế bào mạnh nhất với LC50 và IC50 lần lƣợt là 37,1μg/ml (110,4μM) và
1,0μg/ml (3,0μM).
Julie Nguyen-Pouplin và cộng sự (2007) [49] đã chứng minh trong số
38 loài cây trong cùng nghiên cứu, Arcangelisia flava (L.) Merr. thể hiện tác
dụng chống sốt rét tƣơng đối mạnh với IC50 nằm trong khoảng 0,4 – 1,1μg/ml
(nghiên cứu thực hiện trên chủng Plasmodium falciparum FcB1). Nghiên cứu
này cũng chứng minh khả năng gây độc tế bào của các phân đoạn chiết xuất
từ thân Arcangelisia flava (L.) Merr. trên các dòng tế bào HeLa và MRC5
với IC50 lần lƣợt nằm trong khoảng 8,8 – 40,7μg/ml và 56,5 – 155,0μg/ml.
Toshisada Suzuki và cộng sự (2011) [71] đã chứng minh các
furanoditerpen có trong cây Arcangelisia flava (L.) Merr. có hoạt tính chống
nấm, trong đó chất 2β,3α-dihydroxy-2,3,7,8α-tetrahydropenianthic acid-2,17lactone thể hiện tác dụng chống nấm mạnh nhất trên hai chủng Trametes
versicolor (48,6%) và Fomitopsis palustris (62,3%) ở nồng độ 100ppm.

6


1.3.2. Tác dụng dƣợc lý của berberin
Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực
vật bậc cao [8]. Nó là hoạt chất đƣợc ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học
truyền thống trên thế giới để chữa các bệnh của các nƣớc nghèo do đặc tính
kháng khuẩn, nấm, đơn bào,…và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều
trị các bệnh đang phát triển nhƣ tiểu đƣờng, ung thƣ, tăng mỡ máu,… Các tác
dụng đã đƣợc chứng minh của berberin bao gồm:
(1) Tác dụng kháng khuẩn: Berberin có phổ kháng khuẩn rộng đối với
một số chủng gram (+) và gram (-), nhƣ Streptococcus, Pneumococcus,
Vibrio cholera, Bacillus anthracis, Streptococcua viridians, Sh. shigae, Sh.
flexneri, Bacillus diphtheria, B. subtilus, B. typhoid,... Tác dụng này có liên
quan đến tác dụng ức chế sinh tổng hợp RNA, ADN và protein của vi khuẩn
[3]. Berberin có thể sử dụng để chống lại Staphylococcus aureus đã kháng
kháng sinh Methicillin [78].
(2) Tác dụng kháng nấm: Berberin sulfat ức chế sự sinh trƣởng của
nhiều nấm, nhƣ Alternaria spp. Aspergillus flavus, A. fumigates, Candida
albicans, Curvularia spp., Drechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryzae,
Scophulariopsis spp.,… [3].
(3) Tác dụng kháng đơn bào: Berberin bằng đƣờng uống có tác dụng ức
chế sự sinh trƣởng của amip, diệt Typanosoma brucei rhodesiense [3].
(4) Tác dụng chống ung thƣ: Ngày nay, berberin đƣợc chú ý rất nhiều
tới tác dụng chống ung thƣ [69] do nó có thể ngăn chặn nhiều loại tế bào ung
thƣ nhƣ ung thƣ vú [50], bệnh bạch cầu, u ác tính [69], ung thƣ da, ung thƣ
gan, ung thƣ tuyến tụy [58], ung thƣ miệng, ung thƣ lƣỡi [46].
(5) Tác dụng hạ huyết áp: Berberin sulfat gây hạ huyết áp và làm chậm
nhịp tim. Tác dụng này có thể do ức chế α –andrenoceptor chứ không phải do

tác dụng giãn mạch [3].

7


(6) Tác dụng hạ đƣờng huyết: Berberin đã đƣợc thử nghiệm và sử dụng
thành công trên thực nghiệm [73] và trên ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng [44].
Đặc biệt là tác dụng của berberin và các dƣợc liệu chứa hoạt chất này trên đái
tháo đƣờng type 2 [64]. Nghiên cứu của Chunhua Chen và cộng sự (2010) đã
chứng minh berberin có khả năng ức chế hoạt động của enzym protein
tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) và bắt chƣớc hoạt động của insulin [38].
(7) Tác dụng chống loét đƣờng tiêu hóa: Berberin có tác dụng ức chế sự
hình thành loét và hiện tƣợng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt
môn vị [3].
(8) Tác dụng lợi mật: Berberin có tác dụng tăng cƣờng sự phân tiết
bilirubin mật, tiêm tính mạch với liều rất nhỏ cũng có tác dụng rõ rệt [3].
(9) Các tác dụng khác: Berberin có tác dụng an thần, tăng cƣờng thời
gian gây ngủ của phetobarbital, gây tê cục bộ, giảm tác dụng chống đông máu
của heparin, ức chế kết tập tiểu cầu nhỏ [3].
Độc tính: Trên chuột cống trắng bằng đƣờng uống, berberin sulfat có
LD50 = 1.000mg/kg, và bằng đƣờng tiêm phúc mạc là 90 mg/kg. Nghiên cứu
về tổ chức học cho thấy berberin không gây nên những thay đổi đáng kể về tổ
chức học của các cơ quan trong cơ thể cả khi dùng berberin sulfat với liều lớn
(50 mg/kg) trong 6 tuần lễ liên tục. Berberin dạng tiêm có thể gây dị ứng [3].
Với các tác dụng truyền thống và các các tác dụng mới phát hiện trong
điều trị tiểu đƣờng và ung thƣ cũng nhƣ tính an toàn trong sử dụng, berberin
ngày càng đƣợc sử dụng nhiều trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam với hàng
chục sản phẩm đang đƣợc sản xuất tại các công ty Dƣợc trong nƣớc.
1.3.3. Công dụng
Theo Y học cổ truyền, vị thuốc là thân leo và rễ của Dây hoàng liên có

vị đắng, tính bình, hơi có độc; có tác dụng thanh nhiệt giải độc, chữa sốt rét
và sốt không rõ nguyên nhân [10], [44], [62].

8


Ở Thái Lan, gỗ cây dùng lợi tiêu hoá, bổ huyết, làm thuốc điều kinh và
trừ tiêu chảy. Rễ đƣợc dùng làm thuốc nhuận tràng.
Ở Philippines, Dây hoàng liên đƣợc biết đến với tác dụng kháng khuẩn,
nƣớc sắc gỗ và thân leo đƣợc dùng để điều trị vết thƣơng, vết loét, kích ứng
da, bệnh răng miệng, sốt, điều kinh, điều trị sảy thai,…[59].
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA TRÊN CHỈ
THỊ PHÂN TỬ ADN
1.4.1. Thành phần và cấu trúc ADN
ADN (acid deoxyribonucleic) là chất mang thông tin di truyền quy định
tình trạng của hầu hết các cơ thể sinh vật (trừ một số virus).
ADN là một phân tử polymer (polynucleotide) sinh học, có cấu trúc
dạng xoắn kép với 2 mạch đơn là 2 chuỗi polynucleotide quấn quanh nhau tạo
nên chuỗi xoắn kép (mô hình của Watson – Crick). Mỗi mạch đơn gồm nhiều
monomer là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm 3 thành phần: một base nitơ,
gốc đƣờng 5 carbon (pentose hay còn gọi là 2᾽-deoxyribose) và một nhóm
phosphate.
Có 4 loại base nitơ gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine), C
(Cytosine) tƣơng ứng với 4 loại nucleotide: dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
Mạch đơn tạo thành nhờ liên kết phospho-diester 3᾽-5᾽ giữa gốc
phosphate ở đầu 5᾽ của nucleotide này với nguyên tử carbon 3᾽ ở gốc đƣờng
của nucleotide bên cạnh. Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hydro
giữa các nucleotide (giữa nhóm CO-NH2 và N-NH) theo nguyên tắc bổ sung
nhƣ sau: A và T liên kết với nhau bằng 2 liên kết hydro, G và C liên kết với
nhau bằng 3 liên kết hydro. Nhờ nguyên tắc bổ sung này mà khi biết trình tự

sắp xếp các nucleotide trên một mạch ta có thể biết trình tự trên mạch còn lại
[28].

9


1.4.2. Quá trình sao chép ADN
Sao chép ADN là một quá trình phức tạp nhƣng đều trải qua các giai
đoạn sau:
- Các liên kết hydro giúp ổn định cấu trúc xoắn và gắn hai mạch đơn với nhau
bị phá vỡ và phân tử ADN tách thành hai sợ đơn. Giai đoạn này gọi là giai
đoạn biến ADN, cần có protein đặc hiệu nhận biết điểm khởi phát sao chép và
enzym tháo xoắn.
- Đoạn mồi (primer), tức đoạn ADN hay ARN mạch đơn ngắn, bắt cặp với
mạch khuôn.
- Đủ 4 loại nucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) bắt cặp bổ
sung với các nucleotide mạch khuôn nhờ các enzym ADN-polymerase.
- Mạch mới tổng hợp theo chiều 5᾽P →3᾽OH.
- Các nucleotide mới đƣợc gắn lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo
mạch mới.
Mỗi bƣớc đƣợc điều khiển bởi enzym đặc hiệu và đƣợc thực hiện một
cách chính xác, nhanh chóng [28].
1.4.3. Các loại chỉ thị ADN
Thông tin di truyền đƣợc lƣu trữ trong phân tử ADN là nguồn thông tin
để tổng hợp mọi protein của cơ thể, đồng thời là nguồn thông tin di truyền lại
cho thế hệ sau. Tính đa dạng của sinh giới có thể nói là hệ quả của sự đa dạng
về trình tự ADN. Nhƣ vậy, muốn nghiên cứu và phân loại các sinh vật khác
nhau, bên cạnh con đƣờng truyền thống là dựa vào các đặc điểm hình thái, ta
có thể dựa trên các đặc điểm di truyền và ADN, coi đó nhƣ một chỉ thị phổ
biến [31].

Các loại chỉ thị thƣờng dùng trong kỹ thuật di truyền bao gồm: chỉ thị
dựa cơ sở lai ADN (RFLP); chỉ thị dựa trên kỹ thuật PCR (STS, RAPD,
AFLP, SSR).

10


1.4.4. Chỉ thị RAPD trong kỹ thuật PCR
Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic AND – đa hình các
đoạn AND khuếch đại ngẫu nhiên) đƣợc sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự
nhân bội những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu
nhiên (random primer) dài khoảng 6-12 nucleotide dƣới nhiệt độ kết cặp thấp
(khoảng 370C). Sản phẩm của phản ứng đƣợc phân tách bằng điện di trên gel
agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dƣới tia cực tím. RAPD
sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc
trƣng. Khi phân tích phổ băng RAPD, nếu 2 mẫu có phổ băng giống nhau
nhiều thì chúng có quan hệ di truyền gần gũi và ngƣợc lại. Hạn chế của loại
chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt đƣợc thể dị hợp
tử. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ
ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi
thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự.
- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do
không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác
đơn giản, chất lƣợng.
ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh,
khả năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền
và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.

Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của
phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại đƣợc, nên ngƣời ta đã khắc phục bằng
cách nhân dòng những alen RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi

11


thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị
SCARs (Sequence Characterized Amplified Region).
- Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra
đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do
ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp.
Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc
phát hiện tính đa dạng của sinh vật. Tại Việt Nam, nó đã đƣợc sử dụng để nghiên
cứu đa hình di truyền của các loài nhƣ: ngũ gia bì [24], đậu xanh [19], [29], các
cây thuộc chi Gynostemma Blume [11], [15], các loài sâm bố chính [25].
- Những cải tiến của kỹ thuật RAPD
Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là
sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật
RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen
so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác
nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer
cho sản phẩm ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn
trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai
kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các alen khó xác định (complex
band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là
tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng
những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có
thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm

giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức
tạp hơn.

12


1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG
HUYẾT IN VITRO THÔNG QUA MÔ HÌNH HOẠT HÓA AMPK
1.5.1. Vài nét về bệnh đái tháo đƣờng
Theo quan điểm của Tổ chức y tế thế giới (WHO), đái tháo đƣờng
(ĐTĐ) là “một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose huyết do
hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc liên quan đến sự suy
yếu trong hoạt động của insulin” [36].
Đái tháo đƣờng là một rối loạn xảy ra trong cơ thể do cả yếu tố di
truyền và yếu tố môi trƣờng, đặc trƣng bởi sự thay đổi chuyển hóa glucid,
lipid và protein do sự thiếu hụt tƣơng đối hoặc tuyệt đối insulin và do sự
kháng insulin ở các mức độ khác nhau. Ở những bệnh nhân bị ĐTĐ trong
khoảng thời gian dài có thể gặp các biến chứng tiến triển dẫn đến sự thay đổi
và mất hoạt tính của nhiều cơ quan (đặc biệt ở bệnh ĐTĐ không phụ thuộc
insulin) nhƣ: ở mắt gây mất thị lực; thận gây suy thận; bệnh lý thần kinh
ngoại vi; tim và mạch máu gây bệnh lý tim mạch sớm và nghiêm trọng, xơ
vữa động mạch não, động mạch ngoại vi. Đái tháo đƣờng gồm nhiều bệnh lý
lâm sàng với các nguyên nhân khác nhau nhƣng đa phần đều có tăng đƣờng
huyết [35].
1.5.2. Vai trò của AMPK trong đái tháo đƣờng
AMPK là một protein quan trọng trong điều hòa năng lƣợng của tế bào
và đƣợc coi nhƣ một yếu tố chính tham gia điều hòa chuyển hóa glucose và
lipid ở nhiều cơ quan, đặc biệt là cơ vân và gan [35], [61].
Vai trò của AMPK trong cơ vân:
Cơ vân là nơi sử dụng glucose chính của cơ thể. Có 2 con đƣờng kích

thích sự thu nhận glucose vào cơ vân là con đƣờng phụ thuộc insulin và con
đƣờng không phụ thuộc insulin. Kháng insulin là một trong những khiếm

13


khuyết của cơ vân ở bệnh nhân ĐTĐ và chủ yếu do sự sai lệch trong quá trình
truyền tín hiệu của insulin. Tuy nhiên, hiện nay những biện pháp hữu hiệu để
khắc phục những sai lệch này vẫn còn rất hạn chế. Do đó, cải thiện quá trình
sử dụng glucose ở cơ vân theo con đƣờng không phụ thuộc insulin đƣợc coi là
biện pháp thay thế có hiệu quả.
Các số liệu in vivo và ex vivo đã chứng minh rằng AMPK tác dụng lên
sự hấp thu glucose thông qua cả cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc insulin.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh giả thuyết cho rằng tập luyện có thể làm
tăng sử dụng glucose trong cơ thông qua cơ chế không phụ thuộc insulin [34],
[45]. Sự co cơ làm tăng tỷ lệ AMP/ATP và Cr/pCr dẫn đến sự tăng mạnh mẽ
hoạt tính của AMPK. Nhƣ vậy, AMPK đóng vai trò quan trọng trong việc
tăng sử dụng glucose khi co cơ. AMPK còn thể hiện chức năng đồng hóa
trong cơ vân thông qua hoạt hóa 2 enzym chính của chu trình acid citric là
citrate synthase và succunat dehydrogenase [35].
Ngoài việc làm tăng vận chuyển glucose trong cơ, AMPK còn đóng vai
trò quan trọng trong chuyển hóa chất béo ở cơ. Hoạt hóa AMPK làm giảm
tổng hợp acid béo tự do và làm tăng quá trình β-oxy hóa trong ty thể thông
qua ức chế enzyme acetyl coenzyme A carboxylase (ACC). Do đó làm giảm
nồng độ acid béo tự do và cải thiện sự kháng insulin [61].

14


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm 8 mẫu
Dây hoàng liên đƣợc thu thập ở các vùng sinh thái khác nhau trong khoảng
thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 04/2016. Danh mục các mẫu nghiên cứu
đƣợc tóm tắt trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục mẫu nghiên cứu
T

Ký

T

hiệu

Địa điểm

Mã số tiêu bản

Tỉnh

Khu rừng phòng hộ Tân Phú - Định

1
AR1

HNIP/18117/15

Quán

Đồng Nai

Khu rừng phòng hộ Tân Phú - Định

2
AR2

HNIP/18118/15

Quán

Đồng Nai

Khu rừng phòng hộ Tân Phú - Định

3
AR3

HNIP/18119/15

Quán

Đồng Nai

4

AR4

HNIP/18120/15

Bến Cự - Vƣờn quốc gia Cát Tiên

Đồng Nai

5

AR5

HNIP/18121/15

Vƣờn quốc gia Cát Tiên

Đồng Nai

6

AR6

HNIP/18122/15

Bàu Sấu - Vƣờn quốc gia Cát Tiên

Đồng Nai

7

AR7

HNIP/18147/15

Vƣờn quốc gia Cát Tiên

Đồng Nai

8

Lâm
AR8

HNIP/18148/15

Đèo Chuối – Bảo Lộc

Đồng

Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền là lá tƣơi của 8 mẫu.
Mẫu nghiên cứu thực vật đƣợc lấy cả thân, lá và cơ quan sinh sản (nếu
có), tiêu bản cây khô đƣợc lƣu tại phòng Tiêu bản – Bộ môn Thực vật –
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
Mẫu nghiên cứu hoá học và tác dụng sinh học là phần thân, đƣợc thái
phiến và xay nhỏ, sấy khô ở 55-60oC, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.

15