Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa dã yên thảo (petunia hybrida)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida)

Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Thị Minh Thu
Sinh viên thực hiện

: Mai Thị Thảo

Mã số sinh viên

: 55131688

Khánh Hòa: 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida)

GVHD : TS. Phạm Thị Minh Thu
SVTH : Mai Thị Thảo

MSSV : 55131688

Khánh Hòa, tháng 6/2017


i
LỜI CẢM ƠN
Đồ án tốt nghiệp “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã yên thảo
(Petunia hybrida)” là một cột mốc quan trọng nhất trong những năm tháng sinh viên
của em. Để có thể bắt đầu thực hiện và hoàn thành đồ án em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ. Lời đầu tiên cho em được gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến những
người đã giúp đỡ em hoàn thành đồ án này:
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban lãnh
đạo cùng với quý thầy cô của Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tạo mọi
điều kiện và nhiệt tình chỉ dẫn em trong suốt thời gian em học tập tại trường cũng như
khi em làm đồ án.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn TS. Phạm Thị Minh Thu đã định hướng ý tưởng, tận
tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa luận văn và động viên trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ và là chỗ
dựa tinh thần trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài.

Nha Trang, tháng 06 năm 2017
Sinh viên
Mai Thị Thảo


ii
TÓM TẮT
Nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích nhân nhanh số lượng cây, tạo giống

cây khỏe, sạch bệnh, chất lượng giống được đồng đều sau khi nuôi cấy. Bước đầu của
thí nghiệm là có thể tạo được vật liệu in vitro từ mẫu ngoài tự nhiên. Đối với các mẫu
khác nhau thì thời gian và nồng độ của chất khử trùng cũng sẽ khác nhau. Thời gian
quá dài hoặc quá ngắn, nồng độ chất khử trùng quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng
trực tiếp đến kết quả của quá trình khử trùng. Mẫu lá sau khi được xử lý sơ bộ bằng
ethanol 70%, được khử trùng bằng NaOCl 1% trong vòng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch
và sống cao nhất là 60%. Mẫu chồi sau khi được xử lý sơ bộ bằng ethanol 70%, được
khử trùng bằng NaOCl 1% trong vòng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất là
80%. Để tăng nhanh hệ số nhân chồi ta tiến hành tạo cụm chồi trên môi trường MS +
30 g/l đường sacharose + 8 g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA. Để các chồi
được tách nhau và chiều cao chồi đủ lớn thì ta tiến hành kéo dài chồi trên môi trường
MS + 30 g/l đường sacharose + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA. Môi
trường MS là một môi trường giàu dinh dưỡng và cũng là môi trường thích hợp cho sự
ra rễ của cây Dã yên thảo, những cây con trên môi trường này sau ba tuần nuôi cấy đủ
điều kiện để đưa ra vườn ươm. Cuối cùng, cây Dã yên thảo nuôi cấy in vitro được đưa
ra ngoài tự nhiên có tỷ lệ sống cao nhất (50%) là trên môi trường gồm đất thịt + sơ dừa
+ trấu hun.Từ một mẫu lá in vitro ban đầu, sau năm tuần nuôi cấy trên môi trường tạo
cụm chồi (MS + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA) ta sẽ thu được 90 mẫu chồi in vitro.
Mẫu chồi in vitro tiếp tục được chuyển qua môi trường MS để tạo rễ. Khi đã tạo thành
được một cây hoàn chỉnh thì ta có thể tiến hành chuyển chúng ra môi trường tự nhiên,
50% số cây con có sức sống ổn định trên môi trường bao gồm đất thịt có bổ sung thêm
sơ dừa và trấu hun.


iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ...................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... v
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1 Giới thiệu về cây hoa Dã Yên Thảo .................................................................... 3
1.1.1 Hệ thống phân loại ....................................................................................... 3
1.1.2 Nguồn gốc và mô tả ..................................................................................... 3
1.1.2.1 Nguồn gốc .............................................................................................. 3
1.1.2.2 Mô tả...................................................................................................... 3
1.1.3 Một số loại hoa Dã yên thảo ......................................................................... 4
1.1.4 Nhân giống và kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo.............................................. 6
1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo ......................................................................... 6
1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo........................................................ 7
1.1.5 Nhược điểm của hoa Dã yên thảo ................................................................. 7
1.2 Sơ lược về nhân giống in vitro ............................................................................ 8
1.2.1 Lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật ................................................. 8
1.2.2 Ý nghĩa của việc NCMTBTV ....................................................................... 8
1.2.3 Hiện trạng NCMTBTV ở Việt Nam............................................................ 11
1.2.4 Một số thành tựu trong NCMTBTV ở Việt Nam ........................................ 11
1.2.5 Thuận lợi và khó khăn trong NCMTBTV ở Việt Nam ................................ 12
1.2.6 Thành phần dinh dưỡng trong NCMTBTV ................................................. 12
1.2.6.1 Nguồn Cacbon ..................................................................................... 13
1.2.6.2 Các loại muối khoáng ........................................................................... 13
1.2.6.3 Vitamin ................................................................................................ 15
1.2.6.4 Các chất điều hòa sinh trưởng .............................................................. 15
1.2.6.5 Chất độn – thạch (agar) ........................................................................ 19
1.2.6.6 Các chất bổ sung (than hoạt tính) ......................................................... 19


iv

1.2.6.7 pH ........................................................................................................ 20
1.3 Các nghiên cứu in vitro hoa Dã yên thảo.......................................................... 21
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 23
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 23
2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 23
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 23
2.2.2 Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 23
2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro ......................................................................... 23
2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 23
2.3.1 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 23
2.3.2 Nội dung thí nghiệm ................................................................................... 24
2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro từ lá và chồi ................................... 24
2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp tạo
cụm chồi in vitro .............................................................................................. 26
2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Tạo rễ in vitro cây Dã yên thảo ...................................... 27
2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên ..................... 27
2.4 Phương pháp phân tích số liệu .......................................................................... 28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 29
3.1 Tạo vật liệu in vitro từ các bộ phận khác nhau của cây Dã yên thảo (lá, chồi) ... 29
3.3 Ảnh hưởng của CĐHTTTV đến giai đoạn nhân chồi ........................................ 36
3.4 Tạo rễ in vitro cây Dã yên thảo ......................................................................... 41
3.5 Rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên ........................................................ 48
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 53
4.1 Kết luận ............................................................................................................ 53
4.2 Kiến Nghị ......................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 54
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 56


v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên.................................................................... 5
Hình 1.2: Công thức hóa học của một số auxin .......................................................... 16
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình khử trùng đơn giản tạo vật liệu in vitro từ mẫu lá .............. 25
Hình 3.1: Mẫu lá khử trùng bằng NaOCl 1% sau 7 ngày nuôi cấy.............................. 31
Hình 3.2: Mẫu chồi khử trùng bằng NaOCl 1% sau 7 ngày nuôi cấy.......................... 33
Hình 3.3: Chồi ngủ cây Dã yên thảo trên môi trường MS........................................... 35
Hình 3.4: Chồi ngọn cây Dã yên thảo sau một tuần nuôi cấy trong tối ....................... 36
Hình 3.5: Quá trình nhân nhanh bằng cách tạo cụm chồi ở cây Dã yên thảo............... 38
Hình 3.6: Mẫu lá trên môi trường tạo cụm chồi sau bốn tuần nuôi cấy ....................... 39
Hình 3.7: Cụm chồi cây Dã yên thảo trên môi trường kéo dài chồi sau hai tuần nuôi
cấy ............................................................................................................................. 40
Hình 3.8: Sự tạo rễ của cây Dã yên thảo trên môi trường MS sau bốn tuần nuôi cấy .. 42
Hình 3.9: Sự tạo rễ in vitro của cây Dã yên thảo sau bốn tuần nuôi cấy ..................... 43
Hình 3.10: Sự ra rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA sau bốn tuần
nuôi cấy ..................................................................................................................... 45
Hình 3.11: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA sau bốn
tuần nuôi cấy ............................................................................................................. 45
Hình 3.12: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 0,5mg/l IAA sau
bốn tuần nuôi cấy....................................................................................................... 46
Hình 3.13: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IAA sau bốn
tuần nuôi cấy ............................................................................................................. 46
Hình 3.14: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA sau
bốn tuần nuôi cấy....................................................................................................... 47
Hình 3.15: Sự tạo rễ in vitro trên môi trường MS có bổ sung thêm 2 % AC ............... 47
Hình 3.16: Cây Dã yên thảo sau một tháng rèn luyện ngoài tự nhiên ......................... 50
Hình 3.17: Cây Dã yên thảo ra hoa ngoài tự nhiên ..................................................... 50

vi
DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV đến khả năng tạo cụm chồi ............................. 26
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA và AC đến sự tạo rễ in vitro............... 27
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây hoa Dã yên thảo ................... 28
Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng đối với mấu lá cây Dã yên thảo ................................... 29
Bảng 3.2: Hiệu quả khử trùng đối với mẫu chồi cây Dã yên thảo ............................... 29
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP + NAA đến khả năng tạo cụm chồi ........................... 37
Bảng 3.4: Sự ra rễ của cây Dã yên thảo ở các nồng độ NAA khác nhau ..................... 41
Bảng 3.5: Sự ảnh hưởng của IAA và AC đến sự ra rễ của cây Dã yên thảo ................ 44
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của giá thể tới sự rèn luyện cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên .... 49


vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Cs: Cộng sự
Nxb: Nhà xuất bản
ĐC: Đối chứng
CT: Công thức
TB: Trung bình
MS: Murashige and Skoog
IAA:  - Indo accetic acid
NAA: Naphthylacetic acid
BAP: 6 benzyl amino purin
AC: Than hoạt tính
Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
NCMTBTV: Nuôi cấy mô tế bào thực vật
CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển trong đời sống vật chất, đời sống tinh thần và nhu cầu
thưởng thức cái đẹp của con người cũng không ngừng tăng lên. Trong đó hoa là một
thứ vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà con người dễ dàng thưởng thức nhất, luôn là tâm
điểm của mọi sự chú ý, nhất là vào những dịp lễ, tết, và các hoạt động văn hóa. Hoa
không những là một sự lựa chọn cho những ngày lễ ngày tết, hoa còn là một lựa chọn
tốt cho việc giải tỏa tâm trạng. Cuộc sống xã hội càng phát triển thì những lo toan, suy
nghĩ hàng ngày càng nhiều khiến cho con người ta cảm thấy mệt mỏi, áp lực. Nếu như
không thể giải tỏa được những thứ đó kịp thời thì có thể gây nên trầm cảm hoặc nặng
hơn. Con người ta khi được thả hồn mình vào thiên nhiên, tự nhiên sẽ cảm thấy thư
giãn và đem lại cảm giác thoải mái, lấy lại được cân bằng sau những giờ làm việc căng
thẳng. Việc ngắm nhìn những bông hoa trên ban công là một ý tưởng không tồi đối với
những ai ở thành phố. Có nhiều loại hoa được sử dụng để trồng trên ban công như hoa
Lan, hoa Đồng Tiền,….trong số đó có hoa Dã yên thảo – nữ hoàng hoa ban công. Hoa
Dã yên thảo được người ta lựa chọn trồng ngày càng nhiều bởi vì chúng rất dễ trồng,
hoa của chúng rất đẹp. Ban đầu hoa Dã yên thảo được nhân lên là do dùng hạt hoặc
giâm cành. Nhưng do giá thành vẫn còn cao, số lượng giống không đủ để đáp ứng
được nhu cầu của thị trường nên việc trồng hoa trên ban công vẫn còn là một việc làm
xa sỉ đối với nhiều người. Bằng những tiến bộ của khoa học kỹ thuật nói chung, phát
triển của ngành nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng đã có thể giải quyết được những
nhược điểm của việc nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp truyền
thống. Để có thể chủ động được số lượng giống thì việc nhân nhanh cây hoa Dã yên
thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là hết sức cần thiết để đáp ứng
nhu cầu của những người yêu hoa và phần nào giảm giá thành của hoa để có thể đưa
hoa đến với tất cả mọi người. Xuất phát từ những cơ sở đó tôi đã chọn và thực hiện

nghiên cứu đề tài : “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã yên thảo
(Petunia hybrida)”.


2
Mục đích
Tìm ra được công thức tốt nhất, để hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa Dã
yên thảo, để có thể tạo nên một cây hoa trong thời gian ngắn nhất, chất lượng tốt nhất
với chi phí thấp nhất.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát thời gian, nồng độ chất khử trùng đến khả năng sống của các bộ phận khác
nhau của cây Dã yên thảo (lá, chồi).
- Khảo sát ảnh hưởng của CĐHSTTV lên giai đoạn nhân chồi.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên giai đoạn cấy chuyền kéo dài chồi
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên giai đoạn tạo rễ.
- Khảo sát khả năng sống của cây hoa Dã yên thảo trên các giá thể khác nhau


3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây hoa Dã Yên Thảo
1.1.1 Hệ thống phân loại
Giới: Plantea
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Solanales
Họ: Solanaseae
Chi: Petunia
Loài: Petunia hybrida

Tên thông thường: Petunia
Tên Việt Nam: Dã yên thảo, Dạ yên thảo, Yên thảo hoa, Dạ yến thảo.
1.1.2 Nguồn gốc và mô tả
1.1.2.1 Nguồn gốc
Dã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ với cây
thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae).
Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu Mỹ, hiện nay
được trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất trống, vườn hoa khắp nước ta. Ở miền
Bắc hoa sẽ nở vào dịp hè thu, còn ở miền Nam hoa sẽ nở vào dịp tết. Cây có nhiều tên
gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên là dã yên, theo Trần Hợp
(2000) có tên là cây hoa cà.
Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi Putenia, ví như:
P. axillaris BSP (Large White Putenia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng hoặc P. violace
Lindl (Violet – Flowered Putenia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay các
vườn nhà từ loài lai này còn cho ra các loại hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp.
1.1.2.2 Mô tả
Dã yên thảo là một cây sống hàng năm, cây cao 15 – 30 cm. Thân có lông mịn
bao quanh, phân nhánh từ các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh. Lá
đơn mọc đối hay luân phiên, mặt trên và dưới của lá có phủ lông mịn. Lá hình oval,
mềm mại, mép nguyên không có răng cưa.


4
Hoa cô độc, mọc trên một cọng dài 2 – 3 cm, đài hoa cao 1 – 2,5 cm. Hoa lưỡng
tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành. Nang hủy ngăn thành hai mảnh,
hạt nhiều và rất nhỏ. Hoa Dã yên thảo nguyên thủy có hình phễu, tuy nhiên sự lai tạo
đã cho nhiều hình hoa khác nhau: hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn
sóng, mép dúng hình cung nhọn ở giữa. Màu sắc hoa có thể thay đổi từ tía đến trắng,
tía đến đỏ, đỏ đến cam, tím đến tím nhạt. Đặc biệt nhiều loại hoa Dã yên thảo trắng
thuần khiết hay xanh nhạt pha hơi đỏ (màu hoa oải hương) có mùi thơm dễ chịu.

Dã yên thảo là cây hàng năm, nở hoa vào mùa hè. Dã yên thảo ưa sáng, sẽ trở nên
mảnh khảnh và trở nên ít hoa trong tối. Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa phải, có
thể sống trong điều kiện hơi khô nhưng không thích ứng với điều kiện ngập úng. Cây
thích hợp với khí hậu nóng ẩm, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hoặc quá nóng. Dã
yên thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH
từ 6,0 – 7,0.
Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rủ cho cây, nếu cây ốm yếu hay sau
khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa bớt để cây phục hồi lại.
Dã yên thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới đúng liều lượng, không
tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy trì độ
ẩm thích hợp. Ngoài ra Dã yên thảo thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn
cũng như sâu, sên, rệp cắn phá. Một số loại bệnh virus cũng sẽ ảnh hưởng đến cây như
làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân
tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết
dính thành cụm.
1.1.3 Một số loại hoa Dã yên thảo
Cánh có thể đơn lớp hoặc đa lớp, dạng gợn sóng. Hoa có thể có sọc, đốm hoặc viền
quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương,
hồng, đỏ, trắng, vàng. Khi chạm vào cánh và cuống hoa thấy hơi dính và có mùi thơm
rất khác biệt. Dựa vào hình dạng hoa có thể chia hoa Dã yên thảo ngoài tự nhiên thành
ba loại:
Dã yên thảo đơn: Đây là loại đầu tiên được du nhập đến Việt Nam và cũng là loại phổ
biến nhất. Hoa đơn sắc, có hình dáng giống như chiếc loa nhỏ, hoa nở dày và liên tục,
cây thân thảo, phát triển bò ngang, chiều dài tối đa được khoảng 80 – 100 cm, thích


5
hợp trồng trong các chậu treo rủ. Cây bụi, có rất nhiều hoa nhưng hoa chỉ có một lớp
cánh, đường kính của hoa lên tới 5 – 7,5 cm, rất dễ trồng.
Dã yên thảo kép: Hoa dạ yến thảo kép có màu sặc sỡ, bông to, gồm nhiều lớp cánh

xếp chồng lên nhau, 1 bông hoa có thể gồm 2-3 màu hòa trộn. Cây thân bụi và cứng
cáp hơn dạ yến thảo đơn, phát triển thẳng đứng, chiều cao 30-50 cm.
Dã yên thảo lượn sóng: Đây là loại hoa dạ yến thảo mới nhất, được tạo ra do công
nghệ sinh học, hoa có hình dạng giống như dạ yến thảo đơn, thân cây cũng phát triển
bò ngang nhưng có thể dài đến 5m. Đây là loại dạ yến thảo khỏe nhất, phát triển nhanh
nhất, hoa nhiều và thơm nhất. Giống như cái tên của mình, những cây dạ yến thảo biển
sóng trưởng thành cho rất nhiều hoa, hoa tầng tầng lớp lớp giống như những cơn sóng
biển cuộn trào, là cây thân leo, mùi thơm benzen đặc trưng vì trên cây có rất nhiều tinh
dầu.

a

b

c

Hình 1.1: Cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên

a. Cây Dã yên thảo đơn
b. Cây Dã yên thảo kép
c. Cây Dã yên thảo lượn sóng
Chú ý: Đối với hoa Dã yên thảo kép thì thường sẽ bền hoa hơn hoa Dã yên thảo đơn.


6
1.1.4 Nhân giống và kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo
1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo
Có hai cách để nhân giống hoa Dã yên thảo: thứ nhất là nhân giống bằng phương pháp
truyền thống (hạt và giâm cành), thứ hai là nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy
mô.

- Nhân giống bằng phương pháp truyền thống:
Đối với việc trồng bằng hạt thì cần chú ý đến một số điểm như sau:
+ Dụng cụ gieo hạt: Có thể sử dụng khay, vỉ, chậu trồng,…
+ Làm đất kỹ trước khi gieo hạt, nên bổ sung thêm sơ dừa vào đất để tạo nên độ thông
thoáng cho đất.
+ Đủ ánh sáng khi gieo hạt.
+ Gieo hạt sau 5 - 7 ngày thì sẽ cho ra cây con, sau khoảng 20 ngày thì có thể đem cây con
ra vườn ươm. Sau một tháng có thể chuyển cây con ở trong vườn ươm ra ngoài thị trường.
Ưu điểm của việc nhân giống bằng hạt là đơn giản, dễ dàng thực hiện, dụng cụ đơn
giản dễ tìm, dễ vận chuyển. Nhưng bên cạnh còn tồn tại một số nhược điểm như sau:
Việc thu hoạch hạt của cây Dã yên thảo rất phức tạp, hạt nhỏ, khó bảo quản. Tỷ lệ lên của
hạt phụ thuộc hoàn toàn vào môi trường, tốn nhân công trong việc làm đất, chăm sóc cây
con,…
Đối với việc trồng bằng cách giâm cành cần chú ý đến một số điểm sau:
+ Cây Dã yên thảo dùng để giâm cành thì cần sử dụng những cành khỏe, không bị
bệnh, không thối thân. Không nên lựa chọn cây Dã yên thảo quá già để giâm cành sẽ
ảnh hưởng đến sức sống của cây và chất lượng của cây sau này.
+ Tiến hành cắt cành và giâm cành vào lúc trời mát như vậy sẽ tránh làm cho cây bị
héo, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây sau này. Nếu lúc cắt cành mà chưa thể tiến
hành giâm cành luôn có thể cho cành vào trong lọ nhỏ có chứa một ít nước để tránh
làm mất nước của cành giâm.
+ Độ dài cành giâm phải tối thiểu là ba đốt lá, có thể tỉa bớt đốt lá cuối để dễ dàng cho
thao tác giâm xuống giá thể. Vết cắt nên cắt vát để cây có thể dễ dàng hút nước, chất
dinh dưỡng và rễ cây dễ phát triển hơn.
+ Nên bổ sung thêm sơ dừa và trấu hun vào trong đất dùng để giâm cành cũng như đất
để trồng cây Dã yên thảo.
+ Sau 5 - 7 ngày là rễ đã phát triển tốt có thể đưa ra trồng.


7

Ưu, nhược điểm của phương pháp giâm cành là đây là một phương pháp cổ điển, dựa
vào kinh nghiệm người lao động là chính, tương đối dễ làm, dụng cụ đơn giản, tỷ lệ
cây sống cao. Nhưng với cách làm này không đủ để cung cấp cây hoa cho thị trường vì
cần phải có một số lượng cành giâm rất lớn. Bên cạnh đó, số lượng nhân công lao
động cần dùng nhiều, tốn thời gian, và sẽ làm cho giá thành của hoa tăng lên trong khi
chất lượng giống không đồng đều.
- Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô: Khắc phục được những nhược điểm
trên của phương pháp nhân giống truyền thống (trồng bằng hạt, giâm cành). Phương
pháp nuôi cấy mô đã tạo được giống có một chất lượng đồng đều, sạch bệnh, thời gian
nhân giống ngắn nhưng tạo ra một số lượng cây lớn đủ cung cấp cho nhu cầu của thị
trường. Hoa tạo ra thì đẹp, bền màu, không cần nhân công quá nhiều, giảm giá thành
cho người tiêu dùng. Nhưng phương pháp này có thao tác tương đối phức tạp, dụng cụ,
thiết bị đắt tiền,…nên cần những người có chuyên môn, kinh nghiệm, tinh thần trách
nhiệm.
1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo
- Thường ngắt ngọn khi cây còn nhỏ để gia tăng số lượng về mầm.
- Không trồng trong chậu quá nhỏ, đất thịt, đất cát mịn vì sẽ không bền cây.
- Khi cây quá già thực hiện cắt bớt phần thân ngọn, gìn giữ phần thân (nên thực hiện
vào những ngày mát). Nếu muốn thay đất cho chậu hoa thì nên thực hiện vào mùa
xuân, bổ sung thêm chất dinh dưỡng cây sẽ bật nhiều mầm, trong một thời gian ngắn
lại tiếp tục ra hoa, bởi vì cây được trẻ hóa.
- Tránh đặt chậu hoa ở những nơi có gió to vì sẽ làm tổn thương cây hoa.
- Khi cây già cỗi có biểu hiện lá nhỏ, cành gầy, sắc hoa không thắm thì cần bổ sung
thêm phân giàu đạm (có thể là nước tiểu pha loãng) và tổng hợp dinh dưỡng vi lượng.
- Tưới nước thường xuyên vừa đủ, vì đất quá khô hay quá nhiều nước đều ảnh hưởng
không tốt đến cây.
1.1.5 Nhược điểm của hoa Dã yên thảo
- Là cây thân thảo, nhạy cảm đặc biệt với sự thay đổi nhiệt độ và thời tiết của mùa hè.
- Không chịu được mưa nhiều, không chịu úng (chậu hoa nên để ở những nơi không
chịu mưa trực tiếp).

- Bộ rễ rất nhạy cảm với nhiệt độ ngoại cảnh, trên 360C thì cần phải che chắn chậu hoa
nếu không rễ sẽ bị nẫu.


8
- Bị nhiễm nấm làm nhũn thối cổ rễ, hoặc khô teo lại tại gốc giữa những cành liên kết
với thân chính do tổn thương khi đóng gói vận chuyển.
- Cây sẽ chết ngay khi bị mất nước, cây bị mất nước có hiện tượng héo rũ, bổ sung
nước lại cũng rất khó phục hồi như trước do cây có lá mỏng, hoa, lá nhiều, thân rỗng.
Vì vậy cần quan tâm bổ sung nước một cách đầy đủ. Có thể kiểm tra cây đã đủ nước
hay chưa khá đơn giản chỉ bằng cách dùng một que tre cắm xuống bầu đất:
+ Que ướt: thừa nước
+ Que se ẩm: nước thích hợp
+ Que sáng màu: thiếu nước
1.2 Sơ lược về nhân giống in vitro
1.2.1 Lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật
Được chia làm ba giai đoạn:
- Khởi đầu: 1902 – 1933: Haberlandt G. (1902), nhà thực vật học người Đức, tìm ra
“Tính toàn năng của tế bào thực vật”. Tuy nhiên, ông đã không thành công với các tế
bào mô mềm, biểu bì do chúng không phân chia được.
- Giai đoạn 1934 – 1965:
+ Phát hiện ra hormon tăng trưởng thực vật đầu tiên.
+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5.
- Giai đoạn 1965 – 1978 - đến nay: Phát hiện ra kỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa: tạo
cây đơn bội, nuôi cấy tế bào trần,…
1.2.2 Ý nghĩa của việc NCMTBTV
Ưu điểm của NCMTBTV
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính.
Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp
khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ

vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng
hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các
phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo
quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các
cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson,
1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo
dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm


9
giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất
lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu
không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh
dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành
phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng
tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %;
cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh
dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray,1960)…
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp
dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân
giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm
lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì
được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho
sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều
kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo
dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép)
vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và
phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3
(Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân
giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền
thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở
Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm
nổi trội như:
Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng
triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012/
năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8
tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên
một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với
sinh sản hữu tính (Senez, 1987).


10
Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với
cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể
tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.
Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các
nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm
hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và
Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận
gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and
Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý
nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus
A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis,
1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).
Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong
những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 10 - 15 năm mới cho
thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng
bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con

giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky,1970).
Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng,
nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục. Tạo
được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội. Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Nhược điểm của NCMTBTV
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành
nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật.
Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao
động có tay nghề.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma,
đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy
từ callus). Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản
biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính
khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là


11
tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả
các thực vật.
1.2.3 Hiện trạng NCMTBTV ở Việt Nam
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta năm 1960 ở miền
Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển những năm 1980.
Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân
giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Hiện nay có rất nhiều phòng nuôi cấy mô ở các
Trường Đại học, các Viện Nghiên cứu, các Sở Khoa học và Công nghệ ở các Tỉnh,
Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ
cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ. Đà Lạt đã trở thành một trung tâm sản
xuất rau, hoa quả lớn nhất của cả nước.
1.2.4 Một số thành tựu trong NCMTBTV ở Việt Nam
Phương pháp chọn giống nuôi cấy mô đã được áp dụng lâu đời, bởi các nhà trồng

hoa, các nhà chọn giống muốn nhân nhanh các giống đặc cấp cải thiện hiệu quả của
từng thời kỳ chọn lọc.
Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm và đưa giống ra sản xuất
đại trà nhanh chóng hơn nhiều so với phương pháp truyền thống. Nhờ kết quả này mà
một người có thể sản xuất ra 130000 cây hồng/năm từ một gốc hồng. Chỉ có ba người,
Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo ra
500000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng.
Với công nghệ mới này năng xuất của người nông nghiệp tăng thêm 2500 lần –
không có lĩnh vực công nghệ nào sánh nổi.
Ở miền Bắc, nhân bản vô tính thực vật được ứng dụng ở hầu hết các nông, lâm
sản, bảo tồn thành công giống gene của các loại gỗ quý: Cây Đăng lấy gỗ, Chè vang –
một loại chè rất khó trồng. Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn
DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía,… Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến
bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật để nhân giống cây Lô hội – một loại dược liệu quý của địa phương. Từ năm
2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp đến hàng vạn
cây Bạch Đàn Europhylla.
Bước sang 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới. Nhân
giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý


12
hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài Lan Hài hồng - loài lan hài có duy nhất
hương thơm trên thế giới.
Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt đã sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
1.2.5 Thuận lợi và khó khăn trong NCMTBTV ở Việt Nam
Thuận lợi: Đảng và nhà nước luôn tạo mọi điều kiện giúp đỡ. Đội ngũ cán bộ
nghiên cứu ngày càng được nâng cao cả về chất lượng và số lượng. Bên cạnh đó, có
điều kiện làm việc học hỏi với cán bộ tổ chức nghiên cứu, đào tạo nước ngoài.
Khó khăn: Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ: Các đề tài/dự án được

xây dựng và đưa vào triển khai trên cơ sở đề xuất của các cá nhân và đơn vị nghiên
cứu khoa học tương tự như các đề tài/dự án khác do Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn quản lý. Chưa có các đơn đặt hàng và yêu cầu của các cơ quan quản lý của
các Bộ/ngành địa phương và doanh nghiệp.
1.2.6 Thành phần dinh dưỡng trong NCMTBTV
Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng
và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết, tất cả các loại môi trường đều gồm các nhóm chính
sau đây:
1. Nguồn cacbon
2. Các loại muối khoáng
3.Vitamin
4. Các chất điều khiển sinh trưởng
5. Các nhóm chất bổ sung
6. Chất làm thay đổi trạng thái của môi trường – agar
7. Các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy
Các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và
phân hóa của thực vật trong nuôi cấy in vitro. Việc sử dụng môi trường nuôi cấy rất
khác nhau phụ thuộc vào một số yếu tố sau:
- Đối tượng cây trồng và mô nuôi cấy khác nhau sẽ có nhu cầu khác nhau về môi
trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương pháp nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo
phôi hóa hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần, dịch lỏng tế bào, vi nhân giống,…).
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng).
- Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy.


13
1.2.6.1 Nguồn Cacbon
Đường sacharose là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong
hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả là các mẫu nuôi cấy có màu xanh có khả

năng quang hợp. Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều
kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi
trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Đường vừa là nguồn
cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm
thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50 – 70% vào khả năng thẩm thấu của
môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Nguồn cacbon thông dụng nhất đã được kiểm
chứng là saccharose, nồng độ thích hợp là 2 - 3%. Nồng độ đường này có thể thay đổi
phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy, 0,2% đối với chọn dòng tế bào và tăng đến 12% để
cảm ứng stress nước. Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay được đưa vào môi
trường nuôi cấy. Khi khử trùng đường saccharose bị thủy phân một phần, tạo điều kiện
thuận lợi cho cây hấp thu. Saccharose bị thủy phân tạo ra glucose và fructose, đầu tiên
cây sẽ sử dụng glucose sau đó đến fructose. Các loại đường khác như fuctose, lactose,
galactose,…cũng đã được thử nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng cho
các trường hợp đặc biệt.
1.2.6.2 Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng được dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế
bào thực vật được phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: Nhóm đa lượng
và nhóm vi lượng.
- Nhóm đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm khoảng 0,1 - 1,5% khối lượng
khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ.
Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid
amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận
chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…
+ Nito (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau.
Nito trong cây có chức năng là kiến tạo nên các acid amin, amit, protein, acid nucleic,
nucleotid, các coenzyme,…
+ Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4, các dạng ion khác SO2 hoặc SO3
thường kém tác dụng, thậm chí còn độc. Lưu huỳnh trong cây có chức năng là thành

14
phần của cystein, cystin, metionin và protein. Tham gia cấu tạo acid lipoic, coenzyme
A, thiamin pyrophosphat, glutathion, biotin, adenosin 5 phospho sulfat, 3 phosphat
adenosin.
+ Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu sử dụng phospho rất cao.
Phospho là một trong những thành phần cấu trúc phân tử nucleic acid. Ngoài ra khi
phospho ở dạng H2PO4- và HPO42- còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer)
làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy. Chức năng của phospho
trong cây là tham gia cấu tạo của các phosphat đường, acid nucleic, các nucleotid, các
coenzyme, các phospho lipid, acid phytic, …có vai trò chìa khóa trong các phản ứng
có liên quan đến ATP.
- Nhóm vi lượng: Các nguyên tố này có hàm lượng nhỏ hơn 0,1% khối lượng chất
khô. Các nguyên tố vi lượng bao gồm các nguyên tố là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni,
Co….
+ Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Sắt thường tạo phức hợp với
thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi phức hợp này thường mất khả năng
giải phóng sắt cho các nhu cầu trao đổi sắt trong tế bào. Tốt nhất là nên sử dụng sắt ở
dưới dạng phức chelet với citrate hoặc với EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid).
Từ các phức chất này, Fe được giải phóng ra trong một phạm vi pH rộng. Sắt trong cây
có chức năng thiết lập các cytochrom và các protein có chứa sắt không có cấu tạo hem
có liên quan đến quang hợp, hô hấp, cố định nito.
+ Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các aminom acid tự do và DNA
tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào.
Mangan có chức năng trong cây là cần cho hoạt động của một số ezyme
dehydrogenase, decacboxylase, kinase, oxidase, peroxidase. Có liên quan đến enzyme
hoạt hóa caion khác và sự thải oxy trong quang hợp.
+ Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên các biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B
làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện
hóa mô sẹo nhiều, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mộng nước, kém tái sinh. B có

chức năng trong cây là phức hợp với manitol, mannan, acid poly manuronic, và các
cấu tử khác của thành tế bào có liên quan đến ựu kéo dài tế bào và sự trao đổi acid
nucleic.


15
+ Molypden (Mo): Là ion đóng vai trò co - factor trong hệ thống nitrat reductase, như
vậy Mo đóng vai trò trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật. Mo có
chức năng trong cây là tham gia vào nitrogenase, nitrat reductase, xanthin
dehyrogenase.
+ Đồng (Cu): Có chức năng trong cây là cấu tử của enzyme oxydase acid ascorbic,
tyrosinase, monoaminoxydase, uricase, cytochromoxydase, phenolase, laccase,
lactocyamin.
1.2.6.3 Vitamin
Các viamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong
nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và
myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Mặc dù các loại mô và
tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp vitamin, nhưng
thường không đủ về lượng, nên thường được bổ sung từ bên ngoài vào, đặc biệt là các
vitamin nhóm B.
1.2.6.4 Các chất điều hòa sinh trưởng
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều CĐHTTTV là hết sức cần thiết. CĐHSTTV là thành phần môi trường khắt khe
trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. CĐHSTTV được sử dụng
thông thường là các hormon thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự như chúng, phổ
biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó, auxin và
cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.
- Auxin là phytohocmon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934. Trong cây,
nó chính là acid  - indol acid (IAA). Con người đã tổng hợp rất nhiều chất có bản chất
hóa học khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự IAA gọi là auxin tổng

hợp. Có bốn loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô là:
+  - Indo accetic acid (IAA) tồn tại tự nhiên.
+ Naphthyl acetic acid (NAA).
+ 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid (2,4 – D).
+ Indoly butyric acid (IBA).


16

z - Indo accetic acid (IAA)

Naphthylacetic acid (NAA)

Indolybutyric acid (IBA).

Hình 1.2: Công thức hóa học của một số auxin

Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA; 2,4 – D; IBA là các auxin nhân tạo,
thường thì auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng
nên các auxin oxy hóa auxin (auxin – oxydase) không có tác dụng. Auxin là nhóm chất
tăng trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng
để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh
hình thái, đặc biệt là khi nó được kết hợp với các chất của nhóm cytokine. Sự áp dụng
loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
- Kiểu tăng trưởng và phát triển cần nghiên cứu.
- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
- Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và ngoại sinh.