Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây hoa chuông (sinningia speciosa)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
-------------------------o0o--------------------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa)

Giảng viên hướng dẫn : TS. PHẠM THỊ MINH THU
Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN VĂN TIẾN

Mã số sinh viên

: 55131960

Lớp

: 55SH1

Khánh Hòa: 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------------------------o0o--------------------------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CÂY HOA CHUÔNG (Sinningia speciosa)

GVHD: TS. Phạm Thị Minh Thu
SVTH: Nguyễn Văn Tiến
MSSV: 55131960

Khánh Hòa, tháng 6/2017


i
==============================================================

LỜI CẢM ƠN
Là một trong những sinh viên thuộc viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường,
lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể Ban Giám Hiệu trường Đại học Nha
Trang, Ban lãnh đạo và các thầy cô tại văn phòng khoa đã tạo mọi điều kiện cho em nói
riêng và tập thể lớp 55 CNSH nói chung trong suốt quá trình, thời gian học tập tại trường
có nhiều cơ hôi được học tập, thực hành kỹ năng và rèn luyện bản thân. Và em luôn tự
hào khi được là sinh viên của trường.
Đồng thời em xin cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học và
Môi Trường đã hết mình chỉ bảo, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức cũng như kỹ
năng cho em trong suốt thời gian học tập và thực hành tại trường.
Em chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Minh Thu và cô Khúc Thị An đã tạo điều kiện
cho em được thực tập tại trường ĐH Nha Trang, cảm ơn cô đã dành nhiều thời gian và
công sức để hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian làm và hoàn thiện đề tài tốt
nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả các anh, chị phòng thí nghiệm công nghệ cao đã

tạo điều kiện và giúp đỡ đồng thời đã bỏ qua cho những sai sót, phiền phức mà chúng
em đã gây ra. Em xin chúc các anh chị luôn luôn mạnh khỏe và vui vẻ.
Tôi cũng đặc biệt cảm ơn những người bạn cùng lớp và hai em Giang, Kiều đã
cùng làm việc với tôi. Tuy chúng tôi đã có những tranh luận bất đồng với nhau nhưng
nhờ vậy mà chúng tôi đã thân thiết hơn, hiểu nhau hơn sau những tháng làm việc với
nhau và giúp đỡ nhau tận tình. Cảm ơn các bạn và các em đã trao cho tôi khoảng thời
gian quý giá tự hào này mà không biết có cơ hội nào lăp lại lần nữa hay không.
Cảm ơn những người tôi yêu thương nhất chính là gia đình tôi. Con xin cảm ơn ba
mẹ đã cố gắng làm việc cực khổ để tạo mọi điều kiện cho việc học tập cũng như nơi ở
xa nhà được tốt nhất. Cảm ơn anh chị đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian
học tập xa nhà. Cảm ơn toàn thể gia đình đã cho tôi một gia đình thật sự được gọi là
hạnh phúc và ấm áp vô cùng.
Cảm ơn tất cả mọi người và chúc toàn thể được hạnh phúc luôn vui vẻ mạnh khỏe!


ii
==============================================================

TÓM TẮT
Hoa chuông (Sinningia speciosa) có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt
đới của Brazil ở Nam Mỹ) được người châu Âu chọn và tạo ra nhiều giống hoa mới
ngày nay là một trong những loài hoa nhập nội có giá trị về kinh tế cũng như đáp ứng
được xu hướng ưa thích các loài hoa mới lạ của người chơi hoa và sự quan tâm của
người trồng hoa.
Cây hoa chuông trong tự nhiên có thể được nhân giống bằng hạt, đoạn thân, lá và
củ. Phương pháp nhân giống truyền thống này cho hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn
cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết …. Ngày nay, phương pháp
nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành phương pháp
nhân giống rất có hiệu quả với hệ số nhân giống cao, cây giống tạo ra hoàn toàn sạch
bệnh, đồng nhất về kiểu hình, ổn định về tính di truyền và có thể sản xuất được ở quy

mô lớn.
Nghiên cứu này, nhằm với mục đích đưa ra phương pháp, qui trình để nhân rộng,
nhanh chóng thông qua sự hình thành chồi ngẫu nhiên từ các bộ phận khác nhau (lá,
đoạn thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh). Giai đoan đầu tiên là việc tạo vật liệu in vitro từ
mẫu tự nhiên. Các mẫu cấy sau khi được sử lý sơ bộ sẽ được khử trùng bằng cồn 70% (2
phút), NaOCl 2% (10 phút) cho kết quả tốt nhất đối với đoạn thân mang mắt ngủ với tỷ
lệ tái sính mẫu đạt 36,36% trên môi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP. Môi trường
nuôi cấy tối ưu giúp cho hệ số nhân chồi, chất lượng chồi tốt nhất là MS cơ bản có chứa
1,00 mg/l BAP + 0,10 mg/l NAA với mẫu cấy là đoạn thân mang mắt ngủ cho hệ số
nhân chồi đạt 6,60 (lần). Môi trường khoáng MS thích hợp cho sự phát triển của chồi
trong giai đoạn cấy chuyền. Quá trình tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,20 mg/l
NAA cho kết quả tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy để tạo cây giống in vitro hoàn chỉnh. Giá
thể đất - trấu - xơ dừa tỷ lệ (1: 1: 1) giúp tăng tỷ lệ sống lên đến 91,67%, đồng thời giúp
cây có thể phát triển tốt nhất, cho ra hoa sau 50 ngày chăm sóc.
Với việc áp dụng qui trình trên từ một bình môi trường nuôi cấy chứa 3 mẫu đoạn
thân mang mắt ngủ sau 4 tuần nuôi cấy sẽ có hệ số nhân chồi là 6,60 (lần) cũng như số
lượng cây con in vitro hoàn chỉnh. Số cây thương phẩm đạt được gấp 6,05 (lần) so với
số lượng mẫu cấy ban đầu.


iii
==============================================================

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG .....................................................................................................vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................4
1.1

Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu ...............................................................4
1.1.1 Phân loại ..............................................................................................4
1.1.2 Đặc điểm thực vật học .........................................................................5
1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa chuông .............................................6
1.1.4 Tình hình sản xuất và giá trị thương mại .............................................7

1.2

Các phương pháp nhân giống truyền thống cây hoa chuông .........................9
1.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính.......................................................9
1.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính .......................................................10

1.3.

Phương pháp nhân giống in vitro .................................................................10
1.3.1. Sơ lược về nhân giống in vitro ..........................................................10
1.3.2. Ưu nhược điểm của nhân giống in vitro ............................................11
1.3.3. Các giai đoạn trong qui trình nhân giống in vitro .............................14
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống in vitro....................17
1.3.5. Vai trò, tác dụng của các chất ĐHTTTV ...........................................21

1.4.
Các nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Hoa chuông (Singningia
speciosa) trong và ngoài nước. ......................................................................................24
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................27

2.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................27
2.1.1 Thời gian ............................................................................................27
2.1.2 Địa điểm.............................................................................................27

2.2

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................27

2.3

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................27

2.4

Phương pháp nghiên cứu..............................................................................27


iv
==============================================================

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông.27
2.4.2 Nội dung 2: Chăm sóc cây con ngoài vườn ươm. .............................35
2.5

Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định ...........................................37
2.5.1 Các chỉ tiêu trong nuôi cấy in vitro ...................................................37
2.5.2 Các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển ................................................38
2.5.3 Phương pháp đánh giá chất lượng chồi in vitro và cây giống in vitro

………………………......................................................................................38

2.6

Phương pháp xử lý số liệu............................................................................38

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................39
3.1.

Khảo sát qui trình nhân giống in vitro cây hoa chuông. ..............................39
3.1.1. Khảo sát thời gian khử trùng trên các bộ phận khác nhau (lá, đoạn
thân mang mắt ngủ, chồi đỉnh).....................................................................39
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên sự
phát sinh chồi bất định từ các bộ phận khác nhau (lá, đoạn thân mang mắt
ngủ, chồi đỉnh). ............................................................................................43
3.1.3. Khảo sát môi trường khoáng lên sự sinh trưởng và phát triển của
chồi….. .........................................................................................................52
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính và auxin (NAA, IAA) lên sự
phát sinh rễ. ..................................................................................................54

3.2.

Chăm sóc cây con ngoài vườn ươm. ............................................................58

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................62
4.1.

Kết luận ........................................................................................................62
4.1.1. Xác định được qui trình nhân giống cây hoa chuông in vitro. ..........62
4.1.2. Xác định được giá thể phù hợp cho ươm cây in vitro ở giai đoạn

vườn ươm …... .............................................................................................62

4.2.

Kiến nghị ......................................................................................................62

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................64
PHỤ LỤC .....................................................................................................................67


v
==============================================================

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây hoa chuông. .....................................................................6
Hình 1.2. Sự phong phú về màu sắc hoa chuông....................................................9
Hình 1.3. Công thức hóa học của một số chất ĐHTTTV. ....................................24
Hình 2.1. Nguyên liệu vào mẫu. ...........................................................................28
Hình 2.2. Mẫu cây được tái sinh từ thí nghiệm 1. ................................................30
Hình 2.3. Mô chồi được tái sinh từ thí nghiệm 2..................................................32
Hình 2.4. Mẫu cây sau khi cấy chuyền ở thí nghiệm 3. .......................................34
Hình 2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống của
cây. .........................................................................................................36
Hình 3.1. Sự tái sinh của mẫu (đoạn thân mang mắt ngủ) sau 3 tuần (a), 4 tuần (b)
nuôi cấy. ................................................................................................41
Hình 3.2. Mẫu nhiễm nấm sau 2 tuần cấy mẫu. . .................................................42
Hình 3.3. Mẫu chết hóa đen sau 3 tuần cấy mẫu. .................................................42
Hình 3.4. Sự phát sinh chồi sau 4 tuần trên các nồng độ BAP khác nhau. ..........45
Hình 3.5. Sự phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên các nồng độ BAP khác
nhau. ......................................................................................................46

Hình 3.6. Một số mẫu chồi đạt chất lượng tốt ở các nồng độ khác nhau. ...........48
Hình 3.7. Một số mẫu cây đạt chất lượng tốt ở các nồng độ khác nhau...............51
Hình 3.8. Kết quả cấy chuyển trên môi trường khoáng MS và MS 1B sau 4 tuần.
...............................................................................................................53
Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của MS0 và than hoạt tính lên sự phát triển của rễ
sau 4 tuần. ..............................................................................................55
Hình 3.10. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ sau 4 tuần.......57
Hình 3.11. Kết quả ảnh hưởng của IAA lên sự phát triển của rễ sau 4 tuần. ......56
Hình 3.12. Kết quả ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống và phát triển của cây theo
thứ tự các loại giá thể từ 1 – 5 sau 4 tuần. .............................................60
Hình 3.13. Sơ đồ qui trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây hoa chuông bằng nuôi
cấy đoạn thân mang mắt ngủ. ................................................................61


vi
==============================================================

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian xử lý nấm khuần bề mặt mẫu. ...........................18
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo nguồn
vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro cây hoa chuông. ....................29
Bảng 2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi bất định từ các
bộ phận (lá, thân, chồi đỉnh). .................................................................30
Bảng 2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng sự phối hợp giữa BAP và NAA đến sự phát sinh
chồi bất định từ các bộ phận (lá, thân, chồi đỉnh). ................................31
Bảng 2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng sự phối hợp giữa BAP và IAA đến sự phát sinh
chồi bất định từ các bộ phận (lá, thân, chồi đỉnh). ................................32
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo nguồn
vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro cây hoa chuông. ....................40
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn thân mang

mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh. .......................44
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của (BAP và NAA) lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn
thân mang mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh. .....47
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của (BAP và IAA) lên sự phát sinh chồi bất định từ đoạn
thân mang mắt ngủ và kích thước hình thái chồi sau khi phát sinh. .....49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các chất ĐHTTTV (BAP, NAA, IAA) lên sự phát sinh
chồi bất định từ đoạn thân mang mắt ngủ cho kết quả tốt nhất ở các khảo
sát trong giai đoạn nhân nhanh chồi. .....................................................52
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự phát triển của chồi. ...........52
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của MS0, than hoạt tính và (NAA và IAA) lên sự hình thành
và phát triển của rễ. ...............................................................................54
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các loại giá thể và cách phối trộn lên tỉ lệ sống và sự
phát triển của cây con ngoài vườn ươm. ...............................................59


vii
==============================================================

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ĐHTTTV – Điều hòa tăng trưởng thực vật
ATP - Adenosin triphotphat
BAP - 6-benzyl adenine phosphat
ABA - Axit abscicic
BVTV - Bảo vệ thực vật
cs – Cộng sự
đ/c - Đối chứng
GA3 - Gibberellic axít
GA - Giberrellin
IAA - Axit indolylacetic
IBA - Axit indolyl butyric

lux - đơn vị đo cường độ ánh sáng
MS - môi trường Murashige và Skoog
NAA- naphthylacetic acid
2, 4 - D - Axit diclorophenoxy acetic
TPHCM – Thành phố Hồ Chí Minh


1
==============================================================

LỜI MỞ ĐẦU
Nhân giống cây trồng có ý nghĩa và tầm quan trọng vô cùng to lớn với mục đích
cao nhất là tạo ra được số lượng lớn các cá thể cây giống từ lượng mẫu giống hạn chế
ban đầu. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật cũng như công nghệ sinh
học và các kỹ thuật nuối cấy mô. Đã tạo ra nhiều nguyên liệu hóa chất cũng như tạo
được điều kiện nuôi cấy lý tưởng nhất, giúp cho hệ số nhân chồi không chỉ dừng lại ở
con số một hạt, một cành lên một cây mà có thể tăng đến con số 100, 1000, 2000… hoặc
tăng cao hơn. Với mức độ tăng số lượng theo lũy thừa sẽ đáp ứng đầy đủ việc cung cầu
của giống cây cần thiết.
Từ trước đến nay, hoa cảnh được xem như là một loại cây cảnh có nhu cầu sử dụng
lớn cho con người cũng như các loại cây cảnh các loại. Thay vào đó, nhu cầu của con
người ngày càng thay đổi theo nhiều chiều hướng khác nhau. Trong đó có sở thích làm
đẹp và trang trí bằng hoa cảnh.
Hoa chuông (Sinningia speciosa) là giống hoa thuộc họ Tai voi (Gesneriaceae),
bộ hoa môi (Lamiales), có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực rừng nhiệt đới của Brazil
ở Nam Mỹ). Là một trong những loại hoa được nhập về Việt Nam và khá được ưa thích
trong thời gian gần đây. Hoa có thời gian sinh trưởng ngắn, có thể ra hoa trong vòng 5
tháng khi gieo bằng hạt. Đặc biệt, vì cố nguồn gốc nhiệt đới nên hoa khá phù hợp với
điều kiện khí hậu của nhiều vùng tại Việt Nam như: Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Thành
phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang.

Tại Việt Nam, hoa chuông là một trong những loại hoa mới được nhập nội với
nhiều ưu điểm: màu sắc, hình dáng hoa đa dạng, hương thơm thanh dịu, độ bền tự nhiên
của hoa dài và được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: trang trí làm đẹp nhà
cửa, văn phòng hay kể cả công viên... Chính vì nhiều ưu điểm đó, hoa chuông đã nhanh
chóng trở thành một trong những loại hoa thương phẩm về kinh tế và tinh thần, đáp ứng
được nhiều nhu cầu ưa thích các loài hoa mới lạ của người chơi hoa và nỗ lực tạo ra
giống hoa tốt nhất của người trồng hoa.
Hoa chuông tự nhiên có thể được trồng bằng hạt, đoạn thân, lá hoặc củ. Những
phương pháp nhân giống truyền thống này vừa cho hệ số nhân thấp đồng thời lượng
giống có chất lượng không đồng đều, kèm theo nhiều mối nguy về nhiễm bệnh, tốn thời


2
==============================================================

gian, phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh nhiều như nhiệt độ - độ ẩm và dễ bị thoái hóa
trong thời gian nuôi trồng sau này.
Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống cũng
như việc đảm bảo nguồn cung cấp cây giống có chất lượng cao và đồng đều về mẫu mã.
Phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã ra đời và
trở thành phương pháp nhân giống có hiệu quả rất cao với hệ số nhân giống cao, cây
giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về kiểu hình, ổn định về tính di truyền và
có thể sản xuất được ở qui mô lớn đồng thời cung cấp lượng giống tốt nhất và đồng đều
nhất phù hợp với yêu cầu con người.
Gần đây, đã có nhiều báo cáo khác nhau về qui trình nhân giống in vitro hoa chuông
ở các trường đại học khác nhau cũng như sự sinh trưởng ở các vùng miền khác nhau cho
thấy được sự thích ứng của hoa là khá rộng, trong đó có luận án tiến sĩ Lã Thị Thu Hằng
năm (2012); Lê Nguyễn Lan Thanh năm (2014).
Thành phố Nha Trang hiện nay có diện tích tự nhiên là 251 km² là một thành phố
ven biển và là trung tâm chính trị, kinh tế, văn hóa, khoa học kỹ thuật và du lịch của

tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam. Nha Trang có khí hậu nhiệt đới xavan chịu ảnh hưởng của
khí hậu đại dương. Khí hậu Nha Trang tương đối ôn hòa, nhiệt độ trung bình năm là
26,3⁰C. Có mùa đông ít lạnh và mùa khô kéo dài. Mùa mưa lệch về mùa đông bắt đầu
từ tháng 9 và kết thúc vào tháng 12 dương lịch, lượng mưa chiếm gần 80% lượng mưa
cả năm (1.025 mm). Khoảng 10 đến 20% số năm mùa mưa bắt đầu từ tháng 7, 8 và kết
thúc sớm vào tháng 11.
Trong khi đó Trường Đại học Nha trang là một trong những trường có diện tích
rộng và đang trong quá trình cải tạo cảnh quan cho trường với mục đích nhằm tăng sự
hấp dẫn cho các người trong trường mà cả với người ngoài trường, và việc sử dụng cây
hoa cảnh để phục vụ cho trường là rất cần thiết và cần thực hiện ngay, không những về
chủng loại mà cả số lượng cần phải lớn. Theo con số thống kê của Trung tâm phục vụ
trường học - Thầy Nguyễn Đình Khương cho biết, mỗi năm nhà trường phải tốn khá
nhiều tiền cho việc mua giống cây trồng từ các cơ sở để phục vụ cho nhu cầu cảnh quan
toàn trường. Nhưng thay vào đó lượng giống cây không được ổn định phụ thuộc nhiều


3
==============================================================

vào khí hậu cũng như lượng cung cấp từ cơ sở kèm theo các mầm bệnh do nhân giống
bằng các phương pháp truyền thống là chính.
Trong khi đó, hoa chuông (Sinningia speciosa) cũng có thể được nhân giống in
vitro khá đơn giản, có phản ứng khá nhanh và cho thấy đặc điểm phát triển cũng như
việc tái sinh chồi với các điều kiện nuôi cấy in vitro và dể dàng và đạt hiệu quả cao bằng
các phương pháp khác nhau. Trong đề tài này chúng tôi thiết lập một qui trình nhân
giống nhanh bằng cách tạo chồi bất định từ cá bộ phận của cây trưởng thành như (lá,
thân, cuống, chồi đỉnh) trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực
vật phù hợp cho cây phát triển.
Việc này đem lại nhiều lợi ích to lớn vừa có thể giải quiết được nguồn hoa cảnh
cho trường, tiết kiệm chi phí đồng thời mang đến tiềm năng kinh tế cũng như việc cung

cấp giống hoa cảnh cho thị trường Khánh Hòa sau này.
Xuất phát từ những vấn đề đã nêu trên, tôi thực hiện đề tài “Hoàn thiện qui trình
vi nhân giống cây hoa chuông (Sinningia speciosa)


4
==============================================================

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu

1.1

Hoa chuông có nguồn gốc từ Brazil - là một trong những loại hoa nội thất có hình
dáng lạ, màu sắc đa dạng, rất được ưa chuộng trên thế giới và được tìm thấy đầu tiên tại
rừng nhiệt đới Brazil năm 1785. Là một trong những loại hoa nhập nội tương đối mới lạ
trên thị trường hoa cảnh Việt Nam, nên hoa chuông có giá thành cao, nguồn cung cấp
không ổn định, độ bền lại giảm do thay đổi điều kiện sống.
Cho đến năm 1815, hoa được trồng ở Anh và được gọi tên là Gloxinia speciosa
năm 1817 từ một người làm vườn ở Anh có tên Conrat Lddiges. Năm 1825, hoa chuông
được đổi tên thành Sinningia speciosa do được xác định thuộc loài S. speciosa. Năm
1877, nhà thực vật học Hiern xác định thấy hoa có nhiều màu khác nhau và có cấu trúc
đối xứng. Cho đến ngày nay hoa chuông vẫn giữ nguyên tên cũ và có tên khoa học là
Sinningia speciosa.
Các loại hoa chuông hiện nay hầu như được tạo ra nhờ sự lại tạo bởi các nhà vườn
Scotland từ hai loài hoa Sinningia speciosa và Sinningia maxima ở rùng nhiệt đới Brazil
Nam Mỹ.
Thông qua quá trình lai tạo và chọn lọc, các giống hoa chuông hiện nay có nhiều
ưu điểm để phù hợp với thị hiếu của những người yêu thích hoa cảnh. Là loại hoa mới
nội nhập vào nước ta gần đây hoa còn có nhiều các tên gọi khác nhau như: hoa tình yêu

(valentine), hoa thánh, tứ quý, tử la lan, đại nhâm đồng, hồng xiêm….
1.1.1

Phân loại

Hoa chuông (Sinningia speciosa) là loại cây sống tự dưỡng, củ nằm dưới mặt đất
và là loại cây thân thảo lưu niên thuôc:
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)
Lớp: Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)
Bộ: Lamiales (Bộ Hoa môi)


5
==============================================================

Họ: Gesmeriaceae (Họ Tai voi)
Chi: Sinningia (Chi Hoa chuông)
Loài: Sinningia speciosa.
Sinningia speciosa thuộc một họ lớn là Gesmeriaceae. Họ này có trên 2.500 loài.
Hầu hết được phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng thường được tìm
thấy ở những nơi đất mùn, khe đá và rừng phủ mùn, đa dạng về màu sắc hoa và hình
dạng hoa, kích thước bộ lá… Chi Sinningia có khoảng 40 - 50 loài và vô số các loài lai.
Hiện nay Sinningia speciosa được trồng phổ biến trên thế giới như: Mỹ, Châu Âu, Trung
Quốc, Nhật, Thái Lan, Brazil, Ấn Độ, Philippin....
1.1.2

Đặc điểm thực vật học

Sinningia speciosa là loại hoa thân mềm, kích thước không cao nhỏ nhắn, xinh xắn

nhưng còn có màu sắc hoa rực rỡ và đa dạng và bạn sẽ bị lôi cuốn ngay bởi vẻ đẹp của
hoa ngay từ cái nhìn đầu tiên trong khi bạn chưa biết gì về đặc điểm thực vật học của
chúng. Hình dáng hóa chuông được thể hiện trong Hình 1.1.
Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2004); Dương Tấn Nhựt và cs (2005); Lã Thị
Thu Hằng (2012); Ioja-Boldura và Ciulca (2013); Lê Nguyễn Lan Thanh (2014), một số
đặc điểm thực vật học của cây hoa chuông đã được mô tả cụ thể như sau:
Rễ- củ: Rễ cây hoa chuông thuộc loại rễ chùm phát sinh từ củ hoặc thân phía dưới
đất, phần lớn phát triển theo chiều ngang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 cm. Kích thước các
rễ trong bộ rễ chệnh lệch nhau không nhiều, số rễ tương đối nhiều nên khả năng hút
nước và dinh dưỡng của cây rất mạnh. Rễ phát sinh từ mầm rễ của hạt, từ củ, thân, cuống
lá và những cơ quan sinh dưỡng tiếp xúc trực tiếp với đất.
Thân: Thuộc loại cây thân thảo có nhiều đốt giòn dễ gãy. Thân dạng đứng hoặc
bò. Kích thước thân to hay nhỏ, cao hay thấp, cứng hay mềm tùy thuộc vào giống và
thời vụ trồng và có chiều dài thân từ 4 - 6 cm ở cây trưởng thành. Trên thân có các mắt
ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân.
Lá: Cây có lá đơn mọc đối trên thân, phiến lá mềm mỏng, có thể to hay nhỏ hình
thuôn hoặc oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanh nhạt, xanh phớt hồng...) tùy
thuộc vào giống. Cây có ít lá, mặt trên lá bao phủ một lớp lông tơ mượt như nhung, mặt


6
==============================================================

dưới nhẵn, gân lá hình mạng, trung bình một chu kỳ sinh truởng của cây có từ 5 - 18 lá
trên thân chính.
Hoa: Hoa hình chuông, cánh mướt như nhung và viền cánh hoa có gợn sóng. Hoa
khoe sắc, mọc ra từ nách lá, đơn lẻ hoặc thành chùm nhiều bông. Thời gian nở hoa dài.
Màu sắc hoa rất đa dạng, hầu như có tất cả các màu trong tự nhiên (trắng, tím, đỏ hồng...).
Một bông có thể có một màu hoặc nhiều màu pha trộn. Hoa có hai dạng là hoa đơn và
hoa kép, hoa kép có nhiều vòng cánh, các cánh xếp xen kẽ nhau. Đường kính bông hoa

tùy thuộc vào giống và thời vụ trồng, trung bình khoảng 3 - 7 cm.
Quả và hạt: Quả có dạng quả nang (khi chín sẽ nứt ra theo 3 đường nứt dọc để
giải phóng các hạt), hạt nhiều và nhỏ (12.000 hạt/g), có nội nhũ.

Hình 1.1. Hình ảnh cây hoa chuông.
1.1.3

Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa chuông

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2004); Dương Tấn Nhựt và cs (2005); Lã Thị
Thu Hằng (2012); Lê Nguyễn Lan Thanh (2014), quá trình sinh trưởng và phát triển của
hoa chuông chịu tác động của một số yêu cầu ngoại cảnh như:
Đất: Hoa chuông là cây trồng cạn, bộ rễ ăn nông. Vì vậy, yêu cầu đất trồng phải
cao ráo, thoát nước tốt, tơi xốp và nhiều mùn, thích hợp với đất có pH từ 5,80 – 7,50.


7
==============================================================

Nhiệt độ: Hoa chuông có nguồn gốc nhiệt đới nên đa số các giống hoa chuông
được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp dao động từ 18 - 240C.
Trong giai đoạn ra hoa, nhiệt độ 16 - 180C sẽ kéo dài thời gian ra hoa. Nhiệt độ nhỏ hơn
100C cây ngừng sinh trưởng, gây tổn thương đến lá và hoa, khi nhiệt độ lớn hơn 270C
cây sinh trưởng nhanh.
Độ ẩm và nước tưới: Hoa chuông là cây trồng cạn nên không chịu được úng nước.
Cây hoa chuông sinh trưởng, phát triển thuận lợi nhất trong điều kiện độ ẩm đất từ 65 80%, độ ẩm không khí từ 60 - 75%. Trong thời kỳ nở hoa nếu độ ẩm quá cao gây thối
hoa và sâu bệnh phát triển mạnh làm giảm chất lượng hoa và độ bền của hoa. Cây bị
úng trong giai đoạn ra hoa, các núm hoa bị rụng và có thể gây chết. Khi cây ở giai đoạn
ngủ nghỉ, giảm lượng nước tưới cho cây. Bảo quản củ trong giai đoạn ngủ nghỉ ở điều
kiện mát mẻ nhưng phải khô ráo. Khi trồng nên sử dụng chậu thoáng và thoát nước tốt.

Tưới nước mỗi ngày phụ thuộc vào cường độ ánh sáng và nhiệt độ. Nên tưới nước vào
lúc sáng sớm, tưới nước xung quanh gốc cây, không tưới quá đẫm vì cây dễ bị thối và
nhiễm bệnh. Thiếu nước cây sinh trưởng kém, rút ngắn chu kỳ sinh trưởng.
Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và sự nở hoa
của cây hoa chuông. Hoa chuông ưa ánh sáng tán xạ. Ánh sáng trực tiếp sẽ làm cháy lá,
trong thời kỳ ngủ nghỉ cây không cần ánh sáng. Quang kỳ thích hợp nhất để hoa chuông
phát triển là khoảng 12 - 16 giờ chiếu sáng/ngày. Cường độ ánh sáng thấp (270 lux)
được chấp nhận với nhiệt độ mát 180C, mức ánh sáng từ 0,50 – 1,10 Klux hoặc cao hơn
được khuyến cáo để cây phát triển số lượng nụ và hoa tốt hơn. Vì vậy, trong sản xuất
chúng ta có thể điều chỉnh thời gian và cường độ chiếu sáng cho cây hoa chuông bằng
cách dùng lưới đen che nắng, thắp đèn để điều chỉnh sinh truởng phát triển của cây,
nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao nhất.
1.1.4

Tình hình sản xuất và giá trị thương mại

Việt Nam có số lượng diện tích trồng hoa chiếm khoảng 0,06% trong diện tích đất
tự nhiên đa số tập trung tại các vùng có truyền thống trồng hoa lâu đời như: Ngọc Hà,
Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long
(Quảng Ninh), Gò Vấp, Hóc Môn (TP. Hồ Chí Minh), Đà lạt, Đức Trọng (Lâm Đồng),
Sapa (Lào Cai)... tổng diện lích trồng khoảng trên 13 000 ha.


8
==============================================================

Việc trồng hoa tại Việt Nam phần lớn là dự vào kinh nghiệm và phụ thuộc khá
nhiều vào yếu tố tự nhiên kèm theo vấn đề giống cũng được nhân giống bằng các phương
pháp truyền thống như: giâm, chiết, hạt, củ… Điều này mang lại nhiều nhược điểm cho
việc trồng hoa, năng suất giảm, chất lượng không đều thêm vào đó là các vấn đề về

nhiễm bệnh nguy hại là nguy cơ nhiễm virut và có thể nguy hại trên diện rộng. Trong
thời điểm phát triển hiện nay ở các nước tiên tiến nói chung một số vùng trồng hoa trên
qui mô lớn ở nước ta nói riêng đã biết sản xuất hoa bằng cách áp dụng kỹ thuật thâm
canh cao (trồng hoa trong điều kiện nhà lưới và sử dụng nguồn giống có chất lượng cao
- cây giống cây mô...) đã được triển khai nhưng đối với nước ta vẫn còn ở qui mô nhỏ
và vừa chưa được đầu tư mạnh để thúc đẩy phát triển.
Việt Nam được biết đến với nhiều vùng trồng hoa về đa dạng các loài như: cúc,
lan, thọ, dạ yến thảo, ly…Tuy nhiên, hoa chuông chưa được trồng phổ biến do các giống
hoa chuông mới được nhập vào nước ta, nguồn cung cấp giống bị động nên diện tích
trồng còn rất ít, chủ yếu phục vụ công tác nghiên cứu và tập trung ở Hà Nội, Đà Lạt, TP
Hồ Chí Minh,... Ở khu vực miền Trung, cây hoa chuông chưa được tiến hành trồng thử
nghiệm để mở rộng diện tích.
Trên thế giới, sản xuất hoa đang được phát triển mạnh và được xem là một ngành
thương mại lớn mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Diện tích trồng hoa trên các nước vẫn
tiếp tục được mở rộng và tăng cao. Sản xuất hoa trên thế giới tiếp tục phát triển mạnh
mẽ ở các nước châu Á, châu Phi, châu Mỹ. Mục tiêu sản xuất hoa hướng tới là giống
chất lượng cao và giá thành thấp. Châu Âu và Bắc Mỹ là thị trường tiêu thụ hoa lớn nhất
thế giới.
Hoa chuông được phát hiện ở Brazil từ rất sớm (năm 1785), hiện nay với nhiều
màu hoa đa dạng phong phú được thể hiện ở Hình 1.2. Hoa chuông được trồng phổ biến
ở nhiều nước trên thế giới như: Anh, Đức, Hà Lan, Thái Lan, Trung Quốc... Tuy nhiên,
những thông tin thống kê cụ thể về diện tích trồng và tình hình tiêu thụ cây hoa chuông
ở các nước trồng hoa chưa được công bố riêng. Vì vậy, diện tích trồng và tình hình tiêu
thụ cây hoa chuông nói riêng cũng nằm trong xu thế phát triển chung của các loại hoa ở
các nước trồng hoa lớn.
Trong mười năm qua, 5 nước xuất khẩu hoa đứng hàng đầu thế giới là Hà Lan,
Colombia, Kenya, Ecuador và Ethiopia. Điều này nói lên sự chênh lệch về trình độ khoa


9

==============================================================

học kỹ thuật, sự khác biệt về điều kiện môi trường sinh thái nên ở mỗi nước có tốc độ
phát triển công nghệ trồng hoa khác nhau dẫn đến sản lượng và năng suất chất lượng
khác nhau ở các nước.

Hình 1.2. Sự phong phú về màu sắc hoa chuông
1.2

Các phương pháp nhân giống truyền thống cây hoa chuông

Hoa chuông là loại hoa khá dễ chịu về việc nhân giống. Trong tự nhiên hoa có thể
nhân giống bằng cả hai phương pháp là hữu tính và vô tính. Tuy nhiên, ở mỗi phương
pháp nhân giống trên đều có sự khác biệt rõ rệt và đem lại ưu nhược điểm riêng.
1.2.1

Phương pháp nhân giống hữu tính

Là hình thức thụ phấn giữa 2 cây bố mẹ để tạo hạt, cây con được mọc lên từ hạt.
Hạt giống được hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn) với giao tử
cái (noãn). Cây con mang đặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn
chéo), nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối). Cây con mọc lên
từ hạt, thường tạo thành cây giống khỏe, có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, khả năng
chống chịu cao (sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh). Đồng thời cũng mang lại những
nhược điểm như dễ thoái hóa giống do bản chất là thế hệ lai có thể mang các kiểu gene
khác nhau mà biểu hiện kiểu hình khác nhau về sau chất lượng sẽ giảm dần, làm khó
kiểm soát được các phẩm chất của cây con do có thể có hiện tượng biến dị di truyền.


10

==============================================================

Cây có thời gian sinh trưởng dài kèm theo khả năng thụ phấn kém khi gặp điều kiện
không thuận lợi. Dẫn đến chất lượng sản phẩm thấp mang lại giá trị kinh tế không cao.
1.2.2

Phương pháp nhân giống vô tính

Nhân giống vô tính là từ một phần của các cơ quan dinh dưỡng (như rễ, thân, lá
dùng phương pháp nuôi nhân tạo để mọc ra cây - mới, còn gọi là nhân giống sinh dưỡng.
Hoa chuông cũng có thể được nhân giống từ các cơ quan, bộ phận sinh dưỡng của cây
như thân, lá, củ... nhân giống vô tính phổ biến ở nhiều loại cây trồng hiện nay không chỉ
ở cây cảnh mà còn các loại cây ăn quả hay các loại cây trồng khác.
Ưu điểm của phương pháp:
 Thời gian nhân giống nhanh.
 Giữ được những đặc tính di truyền của cây mẹ.
 Cây giống sau trồng sớm ra hoa.
 Các đột biến có lợi khó bị mất đi do không phải trải qua quá trình phân
bào giảm nhiễm.
Nhược điểm của phương pháp:
 Cây giống nhanh bị thoái hóa (sinh trưởng phát triển không đều, giảm giá
trị thương phẩm).
 Hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thược
vào điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh tác lâu dài.
 Cây mẹ truyền bệnh virus sang cho cây con.
1.3.

Phương pháp nhân giống in vitro
1.3.1. Sơ lược về nhân giống in vitro

Để phát huy những ưu điểm và hạn chế nhược điểm của phương pháp nhân giống
vô tính truyền thống, công nghệ nhân giống in vitro cần được ứng dụng, để tạo ra cây
giống đồng nhất về kiểu hình, ổn định về di truyền, sạch bệnh. Đây là kỹ thuật nhân
giống đã được ứng dụng rộng rãi ở các nước có ngành sản xuất hoa tiên tiến.


11
==============================================================

Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng lớn trong nhân giống nhanh với những giống
hạn chế về số lượng (giống quý, khó nhân giống) hoặc những cây có nhu cầu lớn, những
giống cây mới, cần mở rộng diện tích một cách nhanh chóng và có thể cung cấp lượng
giống lớn trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc vào tùy giống,
càng cấy chuyền nhiều lần càng tạo biến dị. Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một
chồi chuối đưa vào nuôi cấy có thể nhân ra 2000 cây chuối giống, từ một chồi dứa có
thể tạo hàng triệu cây dứa giống, nếu qua con số này thì tỷ lệ biến dị cao.
Đặc biệt, nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực sự đáp ứng được tính thời
vụ của nhu cầu. Đối với nhu cầu cây cảnh nói chung và hoa nói riêng, sự biến đổi xảy
ra rất nhanh. Đặc biệt với những giống hoa mới, nhu cầu thường tăng cao trong thời gian
ngắn sau khi xuất hiện. Ngày nay khi nhu cầu cây cảnh của con người ngày càng tăng,
một loại cây dễ tính như Sinningia speciosa phải nên được đưa vào đầu tư và phát triển
mạnh nhằm nhân rộng số lượng cây kể cả số nơi trồng cây. Đặc biệt, Sinningia speciosa
có khả năng phản ứng rất nhanh với các điều kiện nuôi cấy in vitro nên cần phải có sự
quan tâm nghiên cứu để đưa vào sản xuất giống trên qui mô lớn.
1.3.2. Ưu nhược điểm của nhân giống in vitro
Theo Bùi Trang Việt (2000), Nguyễn Đức Thành (2000), Nguyễn Quang Thạch
và cs (2009), phương pháp nhân giống in vitro có những ưu nhược điểm sau:
Ưu điểm
 Đưa ra sản phẩm nhanh hơn:
Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể cây có độ đồng đều cao

với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt
di truyền.
 Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao:
Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh
cực kỳ cao, từ một cây có thể cho ra hàng triệu cây từ các bộ phận của cây gốc như lá,
thân, đỉnh… trong vòng 1- 2 năm.
 Chủ động trong quá trình nuôi cấy:
Quá trình nhân giống tiến hành trong phòng thí nghiệm, có thể kiểm soát một số
yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, sử dụng các chất ĐHTTTV…, nên không bị phụ
thuộc vào mùa vụ hay điều kiện khí hậu như các phương pháp nhân giống truyền thống.


12
==============================================================

 Tiết kiệm không gian:
Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời
tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện
tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên ruộng đồng và trong nhà kính theo phương
pháp truyền thống.
 Tạo giống sạch bệnh, nâng cao chất lượng giống:
Đây là vấn đề ngày càng được quan tâm trên thế giới. Có thể nói cùng với sự phát
triển về khoa học kỹ thuật là sự phát triển mạnh mẽ của dịch bệnh và ngày càng khó trị.
Nó sẽ làm giảm năng suất, chất lượng sản phẩm. Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu
hiệu để loại trừ các bệnh kể cả virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây
giống sạch bệnh tạo ra bằng hương pháp này thường tăng 15 – 30% so với cây gốc điều
này có ý nghĩa hết sức to lớn trong phạm trù giống sạch hiện nay.
Giống sạch bệnh có thể được tạo ra một cách hiệu quả nhất thông qua nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng vì đây là bộ phận có tốc độ phân chia nhanh, được che chắn bởi những
sơ khởi lá kèm theo đó là hệ thống mạch chưa liên kết tới.

 Cải tiến các giống cây trồng bằng chọn lọc dòng soma, gây đột biến,
chuyển gen:
Tạo ra các biến đổi trong di truyền cần thiết trong chọn và nhân giống. Đối với các
phương pháp truyền thống, giống mới có thể được tạo ra một cách ngẫu nhiên bằng sự
lai hữu tính và có tính thành công không cao, chưa nói đến là tạo ra các biến đổi kém
hơn giống cũ. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật việc tao ra các đột biến là
khá dễ dàng và nhanh chóng hơn. Nuôi cấy mô có thể cảm ứng nhanh và nhiều biến dị
trong các cây con tái sinh và những biến dị đó gọi là biến dị dòng soma, somaclonal
variation (Jain, 2001). Năm 1969, biến dị soma đầu tiên được báo cáo trên cây mía bởi
nhà nghiên cứu của Mỹ. Đi kèm sau đó là hàng loạt các báo cáo trên các đối tượng khác
nhau. Sau đó người ta có thể kích thích các biến dị soma bằng cách nuôi cấy mô sẹo,
huyền phù tế bào, tăng thời gian nuôi cấy và điều chỉnh nồng độ các chất ĐHTTTV.
 Phương pháp nhân giống in vitro có thể duy trì và nhân nhanh các kiểu
gen quý:
Nhân giống in vitro có thể duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý cũng như nhân
nhanh được các cây hoa, cây dược liệu… khó trồng bằng hạt hay các biện pháp nhân
giống truyền thống, ngoài ra còn rất nhiều các ưu điểm khác vượt trội hơn so với các


13
==============================================================

phương pháp truyền thống. Ngày nay, trên 50 quốc gia sử dụng hơn 1800 giống cây mới
được tạo ra trực tiếp từ các đột biến hoặc gián tiếp qua lai tạo những cây đột biến đó
(Ahloowalia và Maluszynski, 2001). Năm 1983 được xem như một cột mốc quan trọng
trong lịch sử của kỹ thuật nuôi cấy mô. Đó là sự ra đời của kỹ thuật chuyển gen, mở ra
một tương lai mới mẻ cho công tác chọn giống và tạo giống, tiến tới khả năng tạo được
giống thực vật đạt mọi tiêu chí mà con người mong muốn là dựa trên nguyên tắc chuyển
các đoạn gen cần được biểu hiện mong muốn vào đối tượng cần tạo nên.
Nhược điểm:

Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống
thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc quí hiếm
vẫn chưa được nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen,
điều này gây hạn chế về nguồn sản phẩm.
 Tính bất định về mặt di truyền:
Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo xuất hiện nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy
chồi đỉnh. Kết qủa là cây con không giữ được các đặc tính qúy của cây bố mẹ. Ngoài ra,
khi nuôi cấy kéo dài, tăng số lần cấy chuyển tùy theo loài, cũng như tăng hàm lượng
chất ĐHTTTV sẽ gia tăng hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả dẫn tới cây con xuất
hiện đột biến về hình thái hoặc ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất cây.
Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý và khắc phục nhằm đảm bảo tạo ra nguồn giống
số lượng lớn đồng nhất về mặt di truyền.
 Sự nhiễm mẫu:
Một số loài vi khuẩn như Agrobacterium, Corylabacterium, Pseudomona… có thể
xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và gây ra tác hại khi mô bắt đầu phân chia. Có
thể sử dụng một số kháng sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng mô thực vật rất
mẫn cảm với kháng sinh và chất kháng sinh có thể phản ứng lên kiểu gen. Ngoài ra, mẫu
cấy có thể nhiễm virus hay viroid. Sự xâm nhiễm có thể không gây ra sự hoại mẫu nhưng
ảnh hưởng đến chất lượng cây giống sản xuất.
 Sản xuất các chất độc hại từ mô:
Trong quá trình nuôi cấy, mô của một số loài thực vật sinh ra các chất tanin hoặc
hydroxyphenol gây hóa nâu, hóa đen mẫu cấy và có thể khắc phục hiện tượng hóa nâu,
hóa đen bằng một số biện pháp sau:
o

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy.


14
==============================================================

o

Sử dụng mô non.

o

Ngâm mô vào dung dịch acid ascorbic hoặc acid citric vài giờ trước

khi cấy.
o

Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng

trong 1-2 tuần.
o

Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trường mới, khoảng cách giữa

các lần cấy chuyền tùy theo loài thực vật.
 Chi phí sản xuất cao:
Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản
phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép hay bằng hạt
tiến tới giá thành rẻ hơn.
1.3.3.

Các giai đoạn trong qui trình nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2006), Vũ Quang Sáng và cs (2007), George và
cs (2008), qui trình nhân giống in vitro cho tới hiện nay đã được áp dụng cho nhiều loại

cây trồng. Giáo sư Murashige của trường Đại học California đã chia qui trình nhân giống
in vitro thành các giai đoạn như sau:
 Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy:
o

Chọn lọc mẫu từ cây bố mẹ:

Việc lựa chọn cây mẹ khỏe mạnh, không có triệu chứng mang bệnh,… có thể giúp
giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng và phát triển của mẫu, giúp tăng hiệu
quả qui trình nhân giống. Các mô được chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng
tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Việc
lựa chọn nguồn mô cũng tùy thuộc vào loài thực vật, phương pháp, điều kiện và mục
đích nuôi cấy, có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu và hiệu quả của qui trình vi
nhân giống.
o

Tạo mẫu và môi trường vô trùng cho nuôi cấy in vitro:

Được gọi chung là giai đoạn khử trùng mẫu cấy nhằm tạo nên vật liệu khởi đầu
cho quá trình nuôi cấy. Mục tiêu, cần phải có tỷ lệ mẫu thành công cao, nhiễm thấp, tái
sinh một cách định hướng mẫu nuôi cấy, phát sinh hình thái cơ quan như chồi, cụm chồi,
rễ hoặc hình thành callus, phôi vô tính hoặc protocorm, protocorm like body tùy thuộc
vào nguồn mẫu, loại thực vật và mục đích nghiên cứu, hệ số tái sinh chồi cao và chất


15
==============================================================

lượng tốt để có nguồn mẫu khởi động cho quá trình tiếp theo của qui trình nuôi được
thuận lợi.

Tùy theo các loại mẫu hoặc giống hay các bộ phận khác nhau mà đưa ra các phương
pháp khử trùng khác nhau nhằm đạt hiệu quả tốt nhất. Mẫu cấy thông thường được khử
trùng bởi các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn như HgCl2, Ca(OCl)2,
NaOCl, H2O2,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào nồng độ chất khử trùng, thời gian
khử trùng và khả năng xâm nhập của chất khử trùng vào mẫu. Khả năng xâm nhập của
chất khử trùng vào mẫu có thể được tăng bằng cách rửa mẫu bằng xà phòng sau đó sử
dụng cồn 700 để rửa lại mẫu trước khi sử dụng chất khử trùng hoặc thêm vào chất khử
trùng các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80,… để tăng khả năng khử
trùng mẫu. Sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng và được nuôi cấy trên môi
trường tái sinh chồi dưới điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm phù hợp. Giai đoạn này
thường kéo dài từ 4 – 6 tuần nuôi. Giai đoạn tái sinh chồi chịu tác động của các thành
phần dinh dưỡng môi trường, các yếu tố vật lý và nồng độ các CĐHTTTV.
 Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro:
Giai đoạn nhân nhanh chồi trong nuôi cấy in vitro ảnh hưởng lớn đến kết quả của
quá trình nhân nhanh giống, nhằm tạo ra số lượng lớn chồi, cụm chồi cũng như tạo số
lượng lớn cây giống sau này. Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra
hệ số nhân cao nhất. Ở quá trình này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều
chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Quá trình này chịu ảnh
hưởng lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các yếu tố vật lý, nồng độ các chất ĐHTTTV,
trong đó quan trọng là cytokynin nên cần phải tạo điều kiện tốt nhất lẫn bên trong và
bên ngoài một cách tốt nhất.
Thời gian nhân nhanh chồi thường kéo dài 1-2 tháng trong một lượt nhân, tùy từng
loại cây và mô phát sinh chồi. Sau đó được cấy truyền trong khoảng thời gian nhất định
tùy thuộc vào loại cây và mô cấy, tuy nhiên không nên kéo dài quá lâu, tránh biến dị tế
bào soma.
 Tạo cây hoàn chỉnh - ra rễ:
Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây
giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin
được giảm xuống và tăng nồng độ auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ cho cây giống

16
==============================================================

cũng như tập trung kéo dài và phát triển chồi đạt kích thước nhất định. Giai đoạn này
cần 2-8 tuần là các cây con ra rễ được xem là chất lượng để chuẩn bị cho giai đoạn kế
tiếp.
 Chuyển cây ra điều kiện vườn ươm:
Đây là quá trình chuyển cây được sống trong điều kiện tối ưu ở phòng thí nghiệm
ra ngoài tự nhiên là giai đoạn cuối cùng của qui trình vi nhân giống. Cây có khả năng
thích nghi cao mang lại tỷ lệ sống cao, đem lại hiệu quả cao cho qui trình vi nhân giống.
Sự biến động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh, ánh sáng, nhiệt độ… gây
nhiều khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên. Do đó, trong quá
trình thích nghi, vườn ươm cần che chắn bằng lưới hoặc nylon để giảm thiểu nắng và
gió, phun sương cung cấp đủ nước và độ ẩm cho cây nhằm hiệu chỉnh nhiệt độ, độ ẩm
cho cây và môi trường cũng như cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng các yếu tố vi lượng
và đa lương cho cây để cây có thể phát triển tốt có sức sống cao tạo năng suất chất lượng
cây tốt…
Cây giống in vitro khi đưa ra môi trường tự nhiên sẽ gặp một số vấn đề như:
 Bộ máy quang hợp và lục lạp kém phát triển.
 Rễ của các chồi không có khả năng đồng hóa cacbon và thường bị chết
do rễ được hình thành từ callus thân, cho nên mối liên kết rễ - không bào và thân
không tốt.
 Cây sẽ bị mất nước do cấu trúc lá có lớp cutin trên bề mặt ít.
Theo TS Lã Thị Thu Hằng (2012) đã khắc phục các hạn chế trên bằng cách huấn
luyện cây giống, bằng các biện pháp như:
 Giảm thể nước của môi trường.
 Giảm độ ẩm trong bình nuôi cấy.
Thực hiện các biện pháp như: đậy nút chai bằng các vật liệu có thể thoát hơi nước
như báo, giấy lọc,… mở nắp bình trước khi trồng vài ngày, khi cho cây ra rễ in vitro cần

điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ cao hơn các quá trình trước…
Như vậy, tất cả các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro bắt đầu từ mẫu in vivo cho
đến khi trở thành in vitro và quay trở lại thành in vivo đều có vai trò quiết định đến sự
thành công của quá trình nhân giống in vitro. Điều khó khăn trong qui trình nhân giống