Tổng hợp một số n hydroxypentanamid mang khung 1 (triazol 4 YL) methylindolin 2 on hướng tác dụng kháng ung thư

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

BÙI ĐỨC TÙNG
MÃ SINH VIÊN: 1201678

TỔNG HỢP MỘT SỐ
N-HYDROXYPENTANAMID
MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL)
METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG
TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

BÙI ĐỨC TÙNG
MÃ SINH VIÊN: 1201678

TỔNG HỢP MỘT SỐ
N-HYDROXYPENTANAMID
MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL)
METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG
TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
NCS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa
luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến những người đã
dạy dỗ, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Nguyễn Hải Nam và NCS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học
Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong
thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên
của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên
- Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - trường Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn
Quốc đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và
các em trong nhóm tổng hợp tại bộ môn Hoá Dược đã đồng hành, giúp đỡ tôi trong
thời gian thực hiện đề tài. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn Dương Tiến Anh,
bạn Nguyễn Minh Tuấn là những người đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất đến gia đình tôi, con
cảm ơn bố mẹ đã luôn yêu thương, che chở, tha thứ cho con, anh cảm ơn em trai luôn

bên cạnh anh suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Bùi Đức Tùng


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Histon deacetylase (HDAC) ...........................................................................2
1.1.1. Khái niệm và hoạt động của HDAC .........................................................2
1.1.2. Phân loại HDAC .......................................................................................2
1.1.3. Cấu trúc của HDAC ..................................................................................3
1.2. Các chất ức chế histon deacetylase (HDACi) ..............................................5
1.2.1. Cấu trúc HDACi ........................................................................................6
1.2.2. Tác dụng của HDACi ................................................................................6
1.2.3. Ứng dụng của các HDACi ........................................................................7
1.3. Một số hướng nghiên cứu tổng hợp các chất HDACi hiện nay .................9
1.3.1. Hướng ức chế chọn lọc .............................................................................9
1.3.2. Hướng ức chế kép (dual inhibitors) ........................................................11
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU .........................................................................................................16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...............................................................................16
2.1.1. Hóa chất ..................................................................................................16
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .....................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................17
2.2.1. Tổng hợp hóa học....................................................................................17
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được .........................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................17
2.3.1. Tổng hợp hóa học....................................................................................17


2.3.2. Thử tác dụng sinh học .............................................................................18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................20
3.1. Hóa học ..........................................................................................................20
3.1.1. Tổng hợp hóa học....................................................................................20
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết .............................................................................29
3.1.3. Xác định cấu trúc ....................................................................................30
3.2. Thử hoạt tính sinh học .................................................................................35
3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC....................................................................35
3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ...........................................35
3.3. Bàn luận ........................................................................................................36
3.3.1. Tổng hợp hóa học....................................................................................36
3.3.2. Khẳng định cấu trúc ................................................................................38
3.3.3. Thử hoạt tính sinh học.............................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)
1
H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)
AcOH
: Acid acetic
ADN
: Acid desoxyribonucleic
ADP
: Adenosine diphosphate
ARN
: Acid ribonucleic
AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người
d
: Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)
DCM
: Dicloromethan
dd
: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)
DMF
: Dimethylformamid
DMSO
: Dimethylsulfoxid
DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa
EGFR
: Yếu tố tăng trưởng (Epidermal growth factor receptor)
ESI

: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)
FBS
: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)
FDA
: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)
FOXP3 : Gen forkhead box P3
h
: Giờ
H (%)
: Hiệu suất
HAT
: Histon acetyltransferase
HDAC
: Histon deacetylase
HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)
HDLP
: Protein giống HDAC (Histone deacetylase-like protein)
HeLa
: Dòng tế bào được phân lập từ tế bào ung thư cổ tử cung
HER
: Yếu tố tăng trưởng (Human epidermal growth factor receptor)
HMGR : Enzym hydroxymethylglutaryl coenzym reductase
IC50
: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)
IR
: Hồng ngoại (Infrared)
J
: Hằng số ghép cặp trong phổ NMR.

KRIBB

: Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc
(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)
m
: Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)
MeCN
: Acetonitril
MeOH
: Methanol
MS
: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)
+
NAD
: Nicotinamid adenin dinucleotid
NCI-H23 : Dòng tế bào ung thư phổi người
NSCLC : Ung thư phổi không tế bào nhỏ (Non-Small Cell Lung Cancer)
PC-3
: Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người
Rf
: Hệ số lưu giữ trong TLC
RPMI
: Môi trường nuôi cấy tế bào
s
: Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)
SIRT
: Sirtuin
SAHA
: Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG
: Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)
SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người
t
: Vạch ba trong phổ NMR (Triplet)
td
: Vạch chẻ đôi ba lần trong phổ NMR (Triplet of doublet)
tºnc
: Nhiệt độ nóng chảy
TLC
: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
TMS
: Tetramethylsilan
TSA
: Trichostatin A
UV
: Tử ngoại (Ultraviolet)
VPA
: Valproic acid
ZBG
: Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)
δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR
ν
: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester

29

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d

30

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d

31

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d

32

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d

33

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d

34

Bảng 3.7. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-d

35

Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d

36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Phân nhóm HDAC

3

Hình 1.2. Chất 1 liên kết với HDAC-2

4

Hình 1.3. Cấu trúc một số chất ức chế HDAC

6

Hình 1.4. Các chất ức chế HDAC và topoisomerase

11

Hình 1.5. Các chất ức chế HDAC và thụ thể androgen/oestrogen

12

Hình 1.6. Các chất ức chế HDAC và tyrosin kinase

13

Hình 1.7. Các chất ức chế HDAC và tạo NO

14

Hình 1.8. Các chất ức chế kép khác

15

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung

20

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II

20

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất IVa

21

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất Va

22

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa

23

Sơ đồ 3.6. Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác CuI theo Hein và cộng sự

37

Sơ đồ 3.7. Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d

38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Gần đây các chất ức chế HDAC nổi lên như một liệu pháp điều trị ung thư
tiềm năng. Lý do căn bản của việc phát triển các chất ức chế HDAC (và các tác nhân
sửa đổi nhiễm sắc thể khác) như là phương pháp chống ung thư mới được xuất phát
từ việc hiểu rõ sự biến đổi gen, sự thay đổi ngoại gen của các enzym HDAC có thể
làm thay đổi kiểu hình và biểu hiện gen, làm rối loạn cân bằng nội mô từ đó góp phần
làm cho ung thư ngày càng phát triển. Hiện nay nhiều chất ức chế HDAC đã được
chấp thuận trong đơn trị liệu hoặc kết hợp với các liệu pháp chống ung thư khác, ví
dụ như: vorinostat (SAHA, Zolinza®), romidepsin (Istodax®), belinostat (Beleodaq®),
panobinostat (Farydax®), nhiều thử nghiệm lâm sàng đánh giá ảnh hưởng của các
chất ức chế HDAC trên huyết học và trên các khối u ác tính cũng đang được tiến hành
rộng rãi.
Theo hướng đi đó, nhóm nghiên cứu bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược
Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid
hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư có tiềm năng.
GS.TS. Nguyễn Hải Nam cùng cộng sự sử dụng khung 2-oxoindolin và 1,2,3-triazol làm
nhóm nhận diện bề mặt cho kết quả ức chế HDAC rất đáng mong đợi [1, 3, 25, 36, 42].
Dựa trên cơ sở này, chúng tôi tiếp tục thiết kế các dẫn chất mang khung 1-(triazol4-yl)methylindolin-2-on và tiến hành đề tài: “Tổng hợp một số N-hydroxypentanamid
mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với
hai mục tiêu:
1. Tổng hợp N-hydroxy-5-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanamid cùng 3 dẫn chất.
2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế HDAC của
các chất tổng hợp được.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Histon deacetylase (HDAC)
1.1.1. Khái niệm và hoạt động của HDAC
Hiện nay 377 enzym đã được tìm thấy trong cơ thể người nhờ vào việc biến
đổi nhiễm sắc chromatin bằng cách thêm, loại bỏ hay đọc các dấu hiệu di truyền biểu
hiện gen (epigenetic), những sự biến đổi thuận nghịch về mặt hóa học trên các histon
sẽ giúp xác định mã histon. ADN được methyl hóa bởi ADN methyl transferase,
demethyl hóa sau quá trình oxy hóa methyl bởi enzym Ten-Eleven Translocation và
theo sau là các cơ chế sửa chữa. Histon cũng có thể được methyl hóa bởi các enzym
lysin hay arginin transferase. Ngoài methyl hóa, các histon có thể bị biến đổi bởi
nhiều nhóm chức khác như acetyl hóa, acyl hóa, sumoyl hóa, N-acetylglucosyl hóa...
Đặc biệt quá trình acetyl hóa được quy định bởi hoạt động của enzym histon acetyl
transferase (HAT) và enzym có chức năng đối kháng là histon deacetylase (HDAC)
[8, 39].
Sự acetyl hóa nhóm ɛ-amin của những lysin đặc trưng ở đầu N của các histon
làm trung hòa điện tích dương trên lysin, điều này làm giảm ái lực của phức hợp
histon với ADN, tăng cường sự tiếp cận của các yếu tố phiên mã ADN. Mặt khác, sự
deacetyl dẫn đến sự co rút sợi nhiễm sắc từ đó ngăn cản quá trình phiên mã [26]. HAT
và HDAC là những enzym tham gia vào trong quá trình phát triển, biệt hóa, điều
chỉnh chu kì tế bào, đặc biệt quan trọng là enzym HDAC, do đó việc không bình
thường trong quá trình deacetyl hóa ở tế bào có liên kết chặt chẽ với ung thư [15, 26].
1.1.2. Phân loại HDAC
Đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 HDAC khác nhau, được chia
thành 4 nhóm nhờ vào sự tương đồng về cấu trúc, cơ chất đặc hiệu và cofactor phụ
thuộc [39, 40].
Nhóm I, II, IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc Zn2+; còn nhóm
III được gọi là HDAC phụ thuộc NAD+.

2


Hình 1.1. Phân nhóm HDAC [40]
1.1.3. Cấu trúc của HDAC
Các HDAC xúc tác cho quá trình deacetyl hóa lysin của các histon và các
protein khác bằng cách liên kết nhóm acetyl ở đầu N-ɛ của lysin với nguyên tử kẽm
ở trung tâm hoạt động. Sau khi kích hoạt, các nhóm N-acetyl bị tấn công bởi một
phân tử nước, tạo ra một N-ɛ lysin tự do và acid acetic. Nhìn chung cấu trúc của các
HDAC gồm trung tâm hoạt động và kênh enzym, sự khác biệt lớn ở phần còn lại được
tìm thấy ở cửa vào trung tâm hoạt động. Các HDAC nhóm I có thêm một khoang nội
(túi thứ cấp), được sử dụng cho việc loại bỏ nước và acid acetic. Túi thứ cấp này có
thể không tồn tại trong các HDAC nhóm II, nơi nước và acid acetic có thể sử dụng
một con đường khác để thay thế. Đối với các SIRT, nhóm acetyl được liên kết với
ADP-ribose lúc kết thúc phản ứng xúc tác. HDAC-6 thuộc nhóm IIb chủ yếu ở trong
tế bào chất, là HDAC duy nhất có chứa một nhân bản đầy đủ miền tương đồng chức
năng deacetyl, tiếp theo là vùng liên kết với ubiquitin đặc trưng [39].
Các nguyên tử kẽm trong trung tâm hoạt động được thâm nhập thông qua một
kênh enzym (kênh trung gian) chứa được 4 carbon của chuỗi lysin, trong khi bề mặt

3


bên ngoài tương tác với các chất còn lại của chất nền để acetyl hóa, góp phần vào sự
ổn định của cơ thể trong quá trình này [39].
Đột biến HDAC-1 ở khoang nội được nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự thoát
ion acetat. Thay thế những phần chính còn lại trong khoang này dẫn đến việc giảm
mạnh hoạt động xúc tác và nhấn mạnh vai trò quan trọng của Tyr23, Tyr24, Arg34,
Cis151 và đặc biệt Tyr303 (các HDLP). Thêm vào đó Val19, Met30, Ile35, Phe109

và Leu139 đóng vai trò quan trọng trong hình dạng của khoang để chứa các ion acetat.
Các chất ức chế mang tương đương với một ion acetat có thể xác định vị trí trong
khoang nội và từ đó nâng cao tính chọn lọc [39].
Trung tâm hoạt động được đặc trưng bởi một kênh thân dầu rộng khoảng 11Å
dẫn từ bề mặt protein tới vị trí hoạt động của của ion Zn2+ và được bao bọc bởi
Gly154, Phe155, Phe210 và liên kết giữa Zn2+ và His183. Trung tâm hoạt động được
đặc trưng bởi 1 hình khối liên kết phức tạp giữa nguyên tử kẽm và một số acid amin
quan trọng bao gồm Asp181 và His183. Hơn nữa, từ vị trí gắn kẽm, có một khoang
nội rộng khoảng14Å (cũng được gọi là khoang kị nước, chân túi) kéo dài về phía lõi
của protein và được xác định bởi một số acid amin bổ sung bao gồm Met35, Phe114
và Leu144 [45].
Wagner và cộng sự đã tìm ra với những nhóm thế ưa nước hơn trong khoang
14Å đã làm giảm tác dụng đáng kể trên HDAC-1,2,3 (> 10 lần) phù hợp với bản chất
thân dầu của vị trí này. Ngoài ra các vòng phenyl không có nhóm thế dẫn đến giảm 5
lần hiệu lực đối với HDAC-2 [45].

Hình 1.2. Chất 1 liên kết với HDAC-2 [45]

4


HDAC-1 và HDAC-2 có sự tương đồng cao và cùng tồn tại trong cùng một
phức hợp protein. Mặc dù chúng liên kết chặt chẽ nhưng mỗi enzym đều sở hữu
những chức năng riêng. Sự tăng bài xuất của HDAC-2 trong ung thư đại trực tràng
xuất hiện rất sớm ở giai đoạn polyp, xuất hiện nhiều và thường xuyên hơn HDAC-1.
Tương tự như vậy, trong khi các biểu hiện của HDAC-1 và HDAC-2 tăng lên trong
loạn sản cổ tử cung và ung thư xâm lấn, sự biểu hiện HDAC-2 cho thấy sự phân định
rõ về việc bao phủ rộng ở vùng chuyển tiếp của chứng loạn sản so với HDAC-1. Vào
lúc HDAC-2 bị bất hoạt, các tế bào cho thấy số lượng gia tăng của sự mở rộng tế bào
gợi nhớ sự biệt hóa tế bào. Đó cũng chính là sự gia tăng quá trình tự hủy, kết hợp với

gia tăng biểu hiện p21Cip1/WAF1, protein độc lập với p53. Kết quả cho thấy các HDAC,
đặc biệt là HDAC-2 là enzym quan trọng tham gia vào những diễn biến đầu tiên của
ung thư, điều đó làm cho chúng là những enzym được lưu tâm trong sự phát triển của
khối u và trong mục tiêu điều trị ung thư [26, 35].
Sự chọn lọc ức chế dược lý của HDAC-2 là khả thi và ức chế hoạt tính xúc tác
của enzym này có thể được ứng dụng như là một phương pháp điều trị theo hướng
tăng cường các quá trình học tập và ghi nhớ trong nhiều rối loạn thần kinh và tâm
thần [44].
1.2. Các chất ức chế histon deacetylase (HDACi)
Sự nỗ lực của các nhà khoa học trong hơn 20 năm qua đã đem lại sự chấp
thuận của FDA cho 4 chất mới dựa trên sự ức chế HDAC, nhiều thử nghiệm lâm sàng
đã được hoàn thành hoặc đang được tiến hành với nhiều thuốc tác động lên sự biểu
hiện gen (epigenetic), các HDACi được sử dụng một mình hoặc kết hợp để tăng hiệu
lực của các thuốc hiện có. Hợp chất đầu tiên được phê duyệt là vorinostat (SAHA,
acid suberoyl anilid hydroxamic) để điều trị u lympho tế bào T ở da, tiếp theo là
romidepsin trên các bệnh lý tương tự. Belinostat được chấp thuận cho điều trị ung thư
hạch bạch huyết tế bào T ngoại vi tái phát hay kéo dài. Panobinostat là chất mới nhất
được chấp thuận cho điều trị đa u tủy xương. Các chất ức chế HDAC được chủ yếu
sử dụng trong bệnh bạch cầu và kém thành công trong các khối u rắn. Chất thứ 5 được
sử dụng trong lâm sàng trong nhiều năm với mục đích chống động kinh là acid

5


valproic (VPA), một chất ức chế HDAC thường xuyên tham gia vào các thử nghiệm
lâm sàng vì hồ sơ lâm sàng nổi tiếng của nó. Những cải tiến lớn có thể đến ở một thế
hệ tiếp theo của các chất ức chế HDAC, miễn là chúng được nghiên cứu chuyển giao
một cách tối ưu [39].
1.2.1. Cấu trúc HDACi
Cấu trúc của các chất ức chế HDAC rất đa dạng nhưng nhìn chung đều gồm

3 phần chính [6, 17]:
- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface
recognition group, SRG): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề
mặt enzym.
- Vùng cầu nối sơ nước (linker): thường là những hydrocarbon thân dầu mạch
thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với kênh
enzym.
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (zinc binding group - ZBG): tương tác với ion
Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm
o-aminoanilin của benzamid...

Hình 1.3. Cấu trúc một số chất ức chế HDAC
1.2.2. Tác dụng của HDACi
Các chất ức chế HDAC tạo ra con đường đối kháng lại khối u bằng các cách
[29, 47]:

6


- Ngừng lại chu kì tế bào.
- Kích hoạt sự chết theo chương trình.
- Gây chết tế bào bằng tự thực.
- Phá hủy sự phân chia tế bào.
- Ức chế sự hình thành mạch.
- Hoạt hóa protein phosphatase 1.
- Phá vỡ chức năng của chaperoin HSP90.
1.2.3. Ứng dụng của các HDACi
Ngoài ứng dụng đáng kể trong lĩnh vực điều trị ung thư, các nhà nghiên cứu
ngày càng tìm ra nhiều lĩnh vực mà các chất ức chế HDAC thể hiện được những tiềm
năng to lớn.

1.2.3.1. Các chất ức chế HDAC trong mô hình tiền lâm sàng của bệnh thần kinh
Các chất HDACi có hiệu quả trong một số mô hình động vật của bệnh thoái
hóa thần kinh, bao gồm các bệnh như Alzheimer, Huntington, Parkinson, đột quỵ do
thiếu máu cục bộ, bệnh xơ cứng teo cơ một bên và teo cơ cột sống [14, 38]. Trong
hầu hết trường hợp, các HDACi phổ rộng đã được nghiên cứu, nhưng những HDACi
phổ hẹp chứng minh chúng hiệu quả hơn và ít độc tính hơn. Ví dụ sự ức chế mỗi
HDAC-3 là đủ để ngăn chặn bệnh Huntington kèm theo thoái thần kinh mắt trong mô
hình ruồi giấm thường (Drosophila melanogaster) và làm giảm sự biểu hiện gen liên
quan trong bệnh Huntington. Sự ức chế HDAC-1 cũng cho kết quả tương tự, như việc
làm ức chế panHDAC với vorinostat và butyrat trong mô hình ruồi giấm ở bệnh
Huntington [28].
1.2.3.2. Các chất HDACi để điều trị các bệnh thần kinh
Các chất HDACi đã được sử dụng trong chuyên khoa thần kinh trong nhiều
năm qua đặc biệt trong lĩnh vực tâm thần học và thoái hóa thần kinh trước khi các
mục tiêu phân tử của các loại thuốc này được xác định. VPA đã được cấp phép sử
dụng vào năm 1978 như một loại thuốc chống co giật để điều trị các cơn động kinh
vắng ý thức (absence seizures) cũng như rối loạn co giật cục bộ và toàn bộ, được đưa
vào thị trường Mỹ năm 1983. VPA vẫn được sử dụng rộng rãi như là một thuốc chống

7


co giật và an thần trong điều trị bệnh động kinh, rối loạn lưỡng cực, trầm cảm, tâm
thần phân liệt và chứng đau nửa đầu [17].
Hiện nay một thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III đang được tiến hành để đánh
giá sự kết hợp giữa VPA và levocarnitin ở trẻ em trong bệnh teo cơ cột sống. Ngoài
ra chất ức chế HDAC-3 mang tên RG2833 đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng
cho bệnh mất điều hòa Friedreich, là một bệnh di truyền gây nên tổn thương diễn tiến
ở hệ thần kinh [17].
1.2.3.3. Các chất ức chế HDAC trong mô hình tiền lâm sàng để điều trị bệnh viêm

Các HDACi đã cho thấy kết quả tích cực trong các bệnh viêm nhiễm ở mô
hình động vật gặm nhấm bao gồm viêm khớp, viêm ruột, tăng huyết áp, sốc nhiễm
trùng huyết, viêm đại tràng, bệnh ghép chống chủ do truyền máu (graft-versus-hostdisease) [21] và trong nhiều trường hợp kết quả này là do làm tăng số lượng và chức
năng của tế bào Treg [4]. Các chất ức chế chọn lọc HDAC nhóm IIa có thể thích hợp
nhất trong các bệnh viêm nhiễm. Các HDACi phổ rộng (trichostatin A (TSA) và
vorinostat) nhưng không phải HDACi chọn lọc nhóm I (entinostat) ngăn cản sự phát
triển và thúc đẩy sự tiêu tan của viêm đại trực tràng trong các mô hình chuột và điều
này phụ thuộc vào các tế bào FOXP3 Treg [4].
Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh hiệu quả của các HDACi trong mô
hình tiền lâm sàng của bệnh viêm khớp, làm nổi bật tiềm năng cho sự phát triển lâm
sàng của những chất này [24, 30].
1.2.3.4. Các chất ức chế HDAC trong điều trị kháng virus
Gần đây các chất ức chế HDAC còn là một hướng nghiên cứu tiềm năng trong
điều trị kháng virus. Một thách thức trong điều trị HIV là loại triệt để nguồn virus
tiềm ẩn. Nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC nhóm I làm tăng sản xuất HIV
trong in vitro [33]. Sự tái kích hoạt virus tiềm ẩn của các HDACi đã được nhìn thấy
trong những dòng tế bào bị lây nhiễm và trong tế bào T CD4+ của bệnh nhân được
điều trị bằng thuốc kháng virus [34]. Gần đây những kết quả tiền lâm sàng đã được
mô phỏng lại trong một nghiên cứu lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm HIV tiềm ẩn [7].
Điều trị bằng vorinostat dẫn đến sự gia tăng acetyl hóa tế bào và sản xuất ARN HIV

8


trong tế bào T CD4+ ở những bệnh nhân mà tình trạng virus huyết đã được ngăn chặn
hoàn toàn bằng liệu pháp kháng virus. Vorinostat, panobinostat và VPA đang được
thử nghiệm kết hợp với các phương pháp điều trị kháng virus khác nhau [17].
Điều trị bệnh nhân nhiễm virus herpes simplex (HSV) cũng có thể là một ứng
dụng khác của các HDACi qua việc trung gian loại bỏ nguồn virus tiềm ẩn nhờ vai
trò của HDAC-1 và 2 trong việc duy trì giai đoạn tiềm ẩn của HSV [50].

1.3. Một số hướng nghiên cứu tổng hợp các chất HDACi hiện nay
Trong xu hướng tổng hợp những chất HDACi ở những năm gần đây, nhóm
acid hydroxamic được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và tổng hợp nhiều nhất
do đặc tính dễ tổng hợp và dễ tạo phức với ion Zn2+ của enzym HDAC. Với 116 bài
báo tổng hợp HDACi tìm được từ năm 2011 đến nay, có đến 80 bài có đích là acid
hydroxamic, được quan tâm thứ hai là các chất benzamid với 13 bài. Vẫn tiếp nối
việc dựa vào công thức các thuốc đưa ra thị trường để đưa ra định hướng tổng hợp
tuy nhiên ngày càng có nhiều xu hướng mới trong tổng hợp các chất HDACi như việc
ức chế chọn lọc cũng được các nhà nghiên cứu chú tâm hơn, việc gắn thêm các khung
thuốc (artermisinin, colchinin…) để đích đến hướng tới không chỉ ức chế HDAC mà
còn ức chế đồng thời thêm một loại enzym khác.
1.3.1. Hướng ức chế chọn lọc
Nhóm acid hydroxamic tiềm năng nhất cũng không ổn định trong cơ thể sống
và nhanh chóng bị chuyển hóa. Ví dụ như SAHA có thời gian bán thải ngắn < 2h và
bị đào thải dưới dẫn chất liên hợp glucoronid. Nghiên cứu mới nhất chỉ ra rằng thế
hệ thứ ba của các chất ức chế sẽ xuất hiện liên quan đến sự ổn định của nhóm gắn
kẽm. Tuy nhiên các chất ức chế HDAC thường nhắm tới nhiều HDAC và hệ quả sinh
học thường không thể dự đoán trước từ đó bị đánh giá thấp cho các hoạt động hướng
đến nhiều HDAC. Do đó, các chất ức chế chọn lọc là cần thiết cho mỗi loại HDAC,
một số đang được thử nghiệm trong pha tiền lâm sàng; giai đoạn I hoặc II trong thử
nghiệm cho bệnh ung thư và các bệnh về thần kinh, các chất ức chế chọn lọc cũng
mở một lĩnh vực mới để chống lại các bệnh ký sinh trùng [5, 46].

9


Ví dụ bệnh sán máng là một trong những bệnh kí sinh nghiêm trọng bị con
người bỏ quên do loài từ chi Shistosoma với Schistosoma mansoni là loài phân bố
lớn nhất. Trên toàn thế giới có hơn 265 triệu người bị nhiễm và 280 nghìn trường hợp
tử vong được báo cáo hàng năm. Hiện nay không có thuốc phòng ngừa hiệu quả và

lựa chọn duy nhất là praziquantel, tuy nhiên với việc hiệu quả ngày càng giảm và sự
đề kháng với praziquantel ngày càng tăng dẫn đến phải cần có một loại thuốc điều trị
mới. Nghiên cứu cho thấy HDAC-8 của loài Schistosoma mansoni (smHDAC-8) là
HDAC phong phú nhất trong các HDAC nhóm I của loài kí sinh này, có một cấu trúc
khác trong túi hoạt động so với HDAC-8 tương đồng ở người. Dựa vào kiểm tra hóa
học cấu trúc, một vài chất đã được xác định có tác dụng ức chế chọn lọc smHDAC8
hơn cả các HDAC quan trọng ở người và có khả năng gây chết sán [22, 39].
Các nhà khoa học đã tìm ra sự chọn lọc có thể là kết quả của việc túi kị nước
tạo ra tương tác đặc trưng bên ngoài trung tâm hoạt động hoặc từ bất cứ tương tác
đặc trưng có thể khác. Chọn lọc HDAC-4 có thể được tạo ra từ halogen liên kết với
Tyr814 cùng với tương tác π giữa nhóm -NH ở Phe812 và vòng phenyl mang nguyên
tử halogen [11]. Một túi lớn được xác định bởi His842, Phe870-Phe871 và Pro942Leu943 có chứa các nhóm kỵ nước lớn có thể tạo ra liên kết với -NH của His842.
Một túi nhỏ hơn được xác định bởi Met810-Cys813 có thể chứa nhóm khóa hoạt động
của HDACi [11]. Điều tương tự cũng áp dụng với HDAC-7, khi mà thiết kế của các
chất ức chế có thể hướng tới các khoang kị nước được xác định bởi His531, His541Glu543, Ile628 và Phe679 [31].
Sự chọn lọc đối với HDAC-6 phụ thuộc vào nhóm khóa hoạt động nơi mà
tương tác bên ngoài trung tâm hoạt động tồn tại, như đối với tubacin [16]. Tubacin là
chất ức chế chọn lọc HDAC-6 theo một cấu trúc mà sinh ra sự va chạm trong không
gian nếu chồng lên vùng Phe870-Leu943 cho HDAC-4 và vùng Pro809-Leu810 cho
HDAC-7, các chuỗi tương ứng với Pro260 trong HDAC-6 được đẩy vào khu vực cao
hơn. Ngược lại các chất ức chế HDAC-4,7 cho đụng độ không gian với HDAC-6 ở
Tyr293 [39].

10


1.3.2. Hướng ức chế kép (dual inhibitors)
1.3.2.1. HDAC và topoisomerase
Chất ức chế topoisomerase là podophyllotoxin được ghép với SAHA, SAHA
được cho là góp phần duỗi xoắn chromatin và cải thiện hoạt động ức chế

topoisomerase. Chất 2 cho kết quả tốt nhất với các nồng độ nM trên HDAC-1,3,6
[48]. Geurrant và cộng sự đã kết hợp daunorubicin (DAU) và chất ức chế HDAC.
Một trong những giả thuyết là benzyl hóa nhóm -NH2 của đường làm cho DAU ít bị
bơm tống ra ngoài, chất 3 mạnh hơn so với SAHA về hoạt động ức chế HDAC và cả
topoisomerase II [20]. Alkylhydroxamat camptothecin được tổng hợp như là chất ức
chế cả HDAC và topoisomerase I. Chức năng của nhóm phenol được sử dụng như
một điểm giữ cho cấu trúc dài của SAHA, kết quả là hoạt tính topoisomerase thấp vì
nhóm hydroxyl này rất quan trọng cho việc liên kết với topoisomerase. Chất 4 cho
hoạt tính tương tự SAHA với sự ức chế HDAC toàn bộ là 56,2 nM ở dòng tế bào
được phân lập tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) và chọn lọc với HDAC-1 và HDAC6 hơn HDAC-8 [39].

Hình 1.4. Các chất ức chế HDAC và topoisomerase

11


1.3.2.2. HDAC và thụ thể androgen/oestrogen
Các chất tạo liên kết với thụ thể androgen (AR) và HDAC được đề xuất cho
điều trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt, AR tăng quá mức trong dòng tế bào ung thư trên.
Một loạt các chất ức chế AR-HDAC đã được tạo ra, dẫn đến chất tốt nhất là chất 5
mang hệ hống lutamid. Ức chế HDAC trong tế bào với nồng độ 10 µM đưa đến đáp
ứng IC50 trong ức chế HDAC và AR là 0,69 µM [18]. Trong cùng phạm vi đó, thụ
thể oestrogen (ER) cũng được sử dụng để thiết kế các chất ức chế kép. Gryder và
cộng sự đã báo cáo sự kết hợp của chất ức chế HDAC với estradiol hoặc tamoxifen.
Nhóm alkyl của estradiol được sử dụng cho phản ứng Click trong khi tamoxifen được
sửa đổi để phản ứng với nhóm chức của SAHA. Tất cả hợp chất đều thể hiện hoạt
tính ở mức µM cho ERα. Chất 6 thể hiện hoạt tính ở mức nM cho HDAC-1,6, gấp
103 lần HDAC-8 [19].

Hình 1.5. Các chất ức chế HDAC và thụ thể androgen/oestrogen

1.3.2.3. HDAC và tyrosin kinase
Các chất ức chế tyrosin kinase của các yếu tố tăng trưởng (EGFR, HER2) như
erlotinib được gắn thêm nhóm alkyl hydroxamat ức chế HDAC. Những chất này được
thử nghiệm cho sự ức chế HDAC và EFGR/HER2. Chất 7 được chứng minh là chất
nổi bật in vitro với sự kết hợp của erlotinib và SAHA, trong khi những thử nghiệm in
vivo cho thấy sự giảm kích thước khối u trên một vài giống chuột, bao gồm giống

12


ghép dị lai đề kháng lại erlotinib là A549 NSCLC. Chất này đã được đưa vào phát
triển lâm sàng [12]. Các dẫn chất của lapatinib được thử nghiệm trên các HDAC1,3,6,8 cho kết quả khả quan, trong đó chất 8 cho kết quả tốt nhất trong việc ức chế
cả 2 enzym [32].

Hình 1.6. Các chất ức chế HDAC và tyrosin kinase
1.3.2.4. HDAC và nitric oxid
Nitric oxid (NO) được tạo ra tự nhiên từ L-arginin bởi tác động của NO
synthase (NOS). Đó là tín hiệu quan trọng và tác động phân tử đóng vai trò then chốt
trong nhiều quá trình sinh học đa dạng. Nồng độ cao của NO gây ra khả năng gây độc
mạnh chống lại các tế bào ung thư của con người và làm tăng sự chết theo chu trình
của tế bào khối u, nồng độ NO cao cũng hạn chế sự di căn và làm tăng nhạy cảm của
tế bào khối u với hóa tri, xạ trị và liệu pháp miễn dịch [9]. Thật vậy, kết hợp các nhóm
giải phóng NO với các chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu ra để đem lại tác động
hiệp lực trong sự giảm kích thước khối u. Đặc biệt, HDAC-2 có thể được xúc tác sửa
đổi bởi tác nhân NO, dẫn đến sự nitrat hóa hoặc S-nitrosyl hóa Tyr. Hơn nữa, NO đã
được chứng minh cho phép bắt chéo giữa các HDAC nhóm I và III. Vài nghiên cứu
đã chỉ ra rằng các sự ức chế HDAC và NO là hiệp đồng trong bệnh phì đại tim và
chữa lành thương tích [27].

13

Entinostat được sửa đổi để thêm một nhóm cho NO với mục đích để hoạt hóa
guanylat cyclase cho chất 9 đặc trưng cho khả năng ức chế HDAC. Việc tạo ra NO
làm S-nitrosyl hóa HDAC-2, đẩy mạnh định vị HDAC-4 ở trong nhân và điều chỉnh
biểu hiện microRNA [10]. Những chất cho NO khác được tổng hợp bởi Tu và cộng
sự, chất 10 được xem là một trong những chất hứa hẹn nhất, với hoạt tính so sánh với
SAHA về tác động chống tăng sinh (IC50 trong khoảng 4,67-6,65 µM với các loại tế
bào ung thư khác nhau, IC50 = 0,18 µM với tế bào HeLa) và sinh ra NO ở mức cao
[43].

Hình 1.7. Các chất ức chế HDAC và tạo NO
1.3.2.5. HDAC và các đích khác
Tubulin là yếu tố quan trọng trong quá trình nguyên phân, nơi là mục tiêu của
một số thuốc can thiệp vào sự trùng hợp của nó tới vi ống. Với việc HDAC-6 chịu
trách nhiệm deacetyl hóa tubulin trong chu trình này, các chất ức chế kép đã được
thiết kế. Dẫn chất của Colchinin được báo cáo bởi Zhang và cộng sự, chất 11 có sự
ức chế HDAC mạnh nhất nhưng hiệu quả thấp hơn trong mô hình in vitro so với dẫn
chất 12, có thể là do tính thấm tế bào của chất 12 tốt hơn [49].
Kết hợp phần decalin của thuốc statin là lovastatin với nhóm gắn kẽm cho ra
chất 13, được đánh giá cho điều trị ung thư với sự ức chế HMGR-HDAC được cân

14


bằng ở mức nM. Nói chung, các hợp chất được thiết kế cho thấy tiềm năng gần gấp
10 lần cho HDAC-1 và HDAC-6 so với HDAC-2 [13]. Các folat thường được tìm
thấy trong một vài dòng tế bào ung thư mà có sự biểu hiện quá mức của thụ thể folat
(FR), đặc biệt là ung thư vú. Kết hợp các chất nền FR kinh điển và acid hydroxamic,
Carrasco và cộng sự thu được chất 14, 15 ức chế HDAC-8 ở người ở mức độ µM,

điều trị với tế bào HeLa cũng cho sự ức chế ở mức µM [37].

Hình 1.8. Các chất ức chế kép khác

15


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Các dung môi, hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thực nghiệm là loại
dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck. Các hóa
chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào. Bao
gồm:
- Các isatin:

- Propargyl bromid

+ Isatin

- Natri azid

+ 5-Fluoroisatin

- Methyl 5-bromopentanoat

+ 5-Cloroisatin

- Hydroxylamin hydroclorid

+ 5-Bromoisatin
Và các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid
(DMF), acetonitril (MeCN), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic
(AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC.
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình
nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình chạy sắc ký
lớp mỏng (TLC).
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu.
- Máy cất quay chân không Buchi R-200.
- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm.
- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR.

16