Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

CƠ SỞ LÝ THUYẾT
SẮC KÝ LỎNG

1


Mục tiêu học tập

1.

Trình bày được sơ đồ của máy HPLC và vai trò của từng bộ phận.

2.

Trình bày được nguyên tắc hoạt động của detector UV-VIS.

3.

Phân biệt được các loại pha tĩnh trên nền silicagel thường dùng trong HPLC và đặc
tính của chúng.

4.

Phân biệt được sắc kí lỏng phân bố pha thuận và pha đảo.

5.

Trình bày cách tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng.

2

1.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Bình đựng dm

Cột sắc kí

Hệ thống tiêm mẫu

Bơm

5

Thải


1.1.1. Hệ thống cấp pha động:

Bình thuỷ tinh chứa hỗn hợp 2-3 dung
môi

Loại bỏ bọt khí:

-

Lọc qua màng lọc 0,45 µm
Chạy siêu âm, sục khí trơ như heli...

8

* Chương trình dung môi (Gradient):

Thay đổi tỷ lệ thành phần MP nhờ bộ
trộn.
Hỗn hợp MP mỗi dung môi đựng trong
một bình khác nhau.

Thay đổi tốc độ dòng pha động nhờ
bơm

10


1.1.2. Hệ thống bơm:
- Bơm cao áp là bộ phận để đẩy pha động từ bình chứa dung môi đi qua cột bằng áp
suất cao (250-500 at).
- Có thể chịu được áp suất cao và không bị dung môi ăn mòn.

14


1.1.3. Hệ tiêm mẫu:

Dung dịch mẫu phân tích được tiêm thẳng vào
pha động bằng một xilanh qua van tiêm có
vòng chứa mẫu.

Sample loop có dung tích khác
nhau: 0,50 ÷ 20 µL.

16


Nguyên lí hoạt động của van tiêm mẫu

Tiêm mẫu
Lọ thải

17


18


Autosampler

Auto sampler chứa nhiều mẫu và tiêm lần lượt các mẫu vào hệ thống sắc kí theo chương
trinh đã chọn.
19


1.1.4. Cột và pha tĩnh:

Cột được chế tạo bằng thép không gỉ trơ với hoá chất và chịu được áp
suất cao.

20

1.1.4. Cột và pha tĩnh:

Trong cột nhồi pha tĩnh:
Pha tĩnh trên nền Nhôm oxyd
Pha tĩnh trên nền cao phân tử (Polystyren, Cellulo)
Pha tĩnh trên nền mạch carbon

Pha tĩnh trên nền Silicagel.
23


1.1.4. Cột và pha tĩnh:
CÁC THÔNG SỐ CỘT
Đường kính trong

Kích thước lỗ xốp
Bản chất pha tĩnh
Kích thước hạt nhồi
Chiều dài cột
24


- Hình dạng tiểu phân (Particle shape)

Hạt hình cầu (Spherical)

Hạt không đều (Irregular)
25

Độ xốp tiểu phân (Porosity particle)

29


1.1.4. Cột bảo vệ

Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, nhồi
hạt cùng loại và kích thước hạt lớn
hơn.

-

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để
loại các tạp chất có mặt trong pha
động.

31


Detector
huỳnh quang

Detector
UV-VIS

DETECTOR
Detector

Detector

đo chỉ số
khúc xạ

khối phổ

Detector
tán xạ
bay hơi
33


Detector UV-VIS

* Nguyên tắc hoạt động:

-

Detector loại này thực chất là một máy đo quang phổ UV-VIS.

- Dựa vào khả năng hấp thụ quang của chất PT tại bước sóng đã chọn để
định tính va định lượng chất phân tích.

34


Detector UV-VIS
Buồng đo là cuvet động
(flowcell: ống hình trụ 2R= 1mm, d= 10
mm).

Dung dịch đo là pha động chảy liên
tục qua buồng chứa mẫu.

35


1. Detector có bước sóng cố định
-

Nguồn sáng:

 Đèn thuỷ ngân áp suất thấp.
 Chỉ sử dụng duy nhất 1 bước sóng đã được lựa chọn (thường 254, 280, 334, 436
nm)

36


1. Detector có bước sóng cố định
- Hạn chế:

 Đối với các chất PT không hấp thụ quang tại bước sóng này thì không phát hiện
được .

 Đối với các chất hấp thụ quang yếu tại các bước sóng này thì giới hạn phát hiện
sẽ lớn.

37

2. Detector đo ở bước sóng thay đổi

- Nguồn sáng:

 Đèn D2- Deuterium (vùng UV: 190-360 nm)
 Đèn Wolfram (vùng VIS: 360-800 nm)
-

Ưu điểm:
Có thể đo ở bất kỳ bước sóng nào trong vùng UV-VIS (190 - 800 nm)

39


Sơ đồ detector đo ở bước sóng thay đổi.

41


3. DAD - (Diod Array Detector)
Mảng Diod

Cách tử kẻ vạch bằng lase

Nguồn sáng
Buồng đo

42

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH TÍNH

- Có thể chồng phổ chất thử với chất chuẩn để định tính được ngay chất PT theo thư
viện phổ.

45