Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây lá đắng

BỘ Y TẾ.
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI.

NGUYỄN THỊ TRANG
1201635

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
CÂY LÁ ĐẮNG

HÀ NỘI-2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TRANG
MÃ SINH VIÊN: 1201635

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
CÂY LÁ ĐẮNG.
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ.
Người hướng dẫn:
PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dƣợc Học Cổ Truyền.

HÀ NỘI – 2017.

LỜI CẢM ƠN.
Với lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển-người thầy đã truyền cho tôi niềm yêu thích
nghiên cứu khoa học, người đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới:
-Thạc sĩ Phạm Thái Hà Văn- người thầy đã luôn sát cánh bên tôi, tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
-Các thầy cô tại Bộ môn Dược Học Cổ Truyền đã giúp đỡ và tạo điều kiện
cho tôi.
-PGS.TS Trần Văn Ơn, Th.S Nghiêm Đức Trọng và Bộ Môn Thực Vật .
-Những người bạn đã kề vai sát cánh cùng tôi trong suốt năm năm Đại học
nói chung và những ngày tháng làm khoá luận nói riêng. Cảm ơn các bạn đã
luôn bên cạnh nhắc nhở và ủng hộ tôi.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám Hiệu trường Đại học Dược Hà
Nội, cảm ơn tất cả các thầy cô trong trường- những người đã dìu dắt tôi đến
ngày hôm nay.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi- hậu phương
vững chắc của tôi.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 02/05/2017
Sinh viên:
Nguyễn Thị Trang.


MỤC LỤC
Tên mục

Trang

DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.....................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................3
1.1.

VỀ THỰC VẬT........................................................................3

1.1.1. Vị trí, phân loại và đặc điểm của chi Vernonia...................3
1.1.1.1. Vị trí phân loại...................................................................3
1.1.1.2. Đặc điểm............................................................................3
1.1.2. Loài Vernonia amygdalina Del..............................................4
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật..............................................................4
1.1.2.2. Phân bố và bộ phận dùng..................................................4
1.2.

VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC................................................5

1.3.

TÁC DỤNG DƢỢC LÝ............................................................6

1.3.1.Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, chống sốt rét..................6
1.3.2.Tác dụng chống ung thƣ, khối u.................................................8
1.3.3.Tác dụng chống oxi hoá..............................................................8
1.3.4.Tác dụng hạ đƣờng huyết và chống tiểu đƣờng.......................8
1.3.5.Tác dụng oxytocic........................................................................9
1.3.6.Tác dụng bảo vệ gan và thận.......................................................9
1.3.7.Tác sụng điều biến lipid huyết thanh........................................10

1.3.8.Một số tác dụng khác...................................................................10
1.3.9. Đặc tính gây độc của lá đắng.....................................................10
1.4.

VÀI NÉT VỀ LUTEOLIN..........................................................10

1.4.1. Một số tính chất và nguồn gốc của Luteolin...........................10
1.4.2. Tác dụng sinh học của Luteolin................................................11
1.4.2.1.Tác dụng chống oxi hoá...........................................................11
1.4.2.2.Tác dụng chống viêm................................................................11
1.4.2.3.Tác dụng kháng khuẩn..............................................................11
1.4.2.4.Tác dụng chống ung thƣ............................................................11
1.4.2.5.Tác dụng sinh học khác.............................................................11
1.4.3. Tác dụng không mong muốn của Luteolin................................12
1.4.4. Công dụng của Luteolin...............................................................12
1.5.ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU...12
1.4.5. Giới thiệu sơ qua về HPTLC............................................................12
1.4.6. Ứng dụng trong định lƣợng..............................................................13
1.4.7. Một số nghiên cứu ứng dụng trong HPTLC....................................13
CHƢƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........16
2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU.............................................................................16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu..........................................................................16
2.1.2. Hoá chất...............................................................................................16
2.1.3. Máy móc và dụng cụ nghiên cứu........................................................16
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................17
2.2.1. Nội dung nghiên cứu............................................................................17

2.2.1.1. Nghiên cứu về thực vật....................................................................17
2.2.1.2. Nghiên cứu về hoá học....................................................................17
2.2.1.3. Bán định lƣợng Luteolin bằng HPTLC..........................................17
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................17
2.2.2.1.Nghiên cứu về thực vật.....................................................................17
2.2.2.2.Nghiên cứu về hoá học.....................................................................18
2.2.2.2.1. Định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hoá học..........18
2.2.2.2.2. Định tính flavonoid bằng SKLM.................................................21
2.2.2.3.Bán định lƣợng Luteolin bằng HPTLC............................................21
2.2.2.4. Đánh giá một số chỉ tiêu quy trình bán định lƣợng......................23
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...........................................25
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT.......................................................................25
3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật................................................................25
3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu.................................................................26
3.1.2.1.Vi phẫu lá...........................................................................................26
3.1.2.2.Vi phẫu thân.......................................................................................27
3.1.2.3.Vi phẫu rễ...........................................................................................28
3.1.3. Đặc điểm soi bột...................................................................................29
3.1.3.1. Đặc điểm bột lá..................................................................................29
3.1.3.2. Đặc điểm bộ thân...............................................................................30
3.1.3.3. Đặc điểm bột rễ..................................................................................31
3.2. ĐẶC ĐIỂM HOÁ HỌC...........................................................................32


3.2.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học..........................33
3.2.2. Định tính flavonoid và luteolin bằng sắc kí lớp mỏng..................34
3.3. BÁN ĐỊNH LƢỢNG LUTEOLIN BẰNG HPTLC.............................35
3.3.1.Bán định lƣợng Luteolin trong lá.......................................................35
3.3.2.Bán định lƣợng Luteolin trong thân...................................................36
3.3.3. Đánh giá một số chỉ tiêu của phƣơng pháp HPTLC........................38

CHƢƠNG 4.BÀN LUẬN.............................................................................41
4.1. VỀ THỰC VẬT.....................................................................................41
4.2. VỀ HOÁ HỌC.......................................................................................43
4.2.1.Về định tính các nhóm chất chính......................................................43
4.2.2. Về định tính flavonoid và Luteolin...................................................44
4.3. VỀ BÁN ĐỊNH LƢỢNG LUTEOLIN BẰNG HPTLC........................44
4.3.1.Về phƣơng pháp HPTLC......................................................................44
4.3.2.Về kết quả bán định lƣợng...................................................................44
4.3.3.Về một số tiêu chí đánh giá quy trình HPTLC..................................45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..........................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................48
PHỤ LỤC......................................................................................................52.


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
HPTLC

High Performance Thin Layer Chromatigraphy.

TLC

Thin Layer Chromatigraphy

TN

Thí nghiệm.

TT

Thuốc thử.

SKLM

Sắc kí lớp mỏng.

UV

Utraviolet.

Mcl

microlit

Mcg

microgram.

Kg

kilogram.


DANH MỤC CÁC BẢNG.
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 3.1

Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học

33

Bảng 3.2

Số liệu đầu vào của quá trình bán định lƣợng Luteolin

36

trong lá.
Bảng 3.3

Kết quả bán định lƣợng Luteolin trong dịch chiết lá.

36

Bảng 3.4

Số liệu đầu vào của quá trình bán định lƣợng luteolin

37

trong thân
Bảng 3.5

Kết quả bán định lƣợng Luteolin trong thân

37

Bảng 3.6

Diện tích pic của 6 lần tiêm chuẩn

39

Bảng 3.7

Hàm lƣợng luteolin chuẩn và diện tích đáp ứng.

39

Bảng 4.1

Phân biệt Vernonia amygdalina Del. với một số loài

42

khác.
Bảng 4.2

Kết quả so sánh định tính các nhóm hợp chất trong mẫu

43

nghiên cứu với kết quả định tính các nhóm hợp chất
trong mẫu Vernonia amygdalina Del. đã đƣợc công bố
trƣớc đây.
Bảng 4.3

Hàm lƣợng Luteolin trong lá và thân tính theo dƣợc liệu
khô, tƣơi.

45


DANH MỤC CÁC HÌNH.
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc của các Vernonioside.

6

Hình 1.2

Cấu trúc hoá học của Luteolin.

6

Hình 2.1

Hình ảnh hệ thống HPTLC.

16

Hình 3.1

Đặc điểm hình thái thực vật cây lá đắng.

25

Hình 3.2

Vi phẫu lá Cây lá đ ắng.

27

Hình 3.3

Vi phẫu thân cây lá đắng

28

Hình 3.4

Vi phẫu rễ.

29

Hình 3.6

Bột lá và đặc điểm vi học bột lá

30

Hình 3.7

Bột thân và đặc điểm vi học bột thân

31

Hình 3.8

Bột rễ và đặc điểm vi học bột rễ

32

Hình 3.9

Kết quả định tính Luteolin trong lá bằng SKLM

34

Hình 3.10

Kết quả định tính Luteolin trong thân bằng SKLM

35

Hình 3.11

Hình ảnh pic của (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử

38

H ình 3.12

Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng và diện tích pic.

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lá đắng (Vernonia amygdalia Del.) có nguồn gốc từ Châu Phi, đƣợc di
thực vào Việt Nam, thƣờng đƣợc dân gian quen gọi dƣới nhiều tên khác nhau
nhƣ: cúc ban cƣu, khổ diệp thụ, mật gấu miền Nam hay Nam Phi diệp. Cây đƣợc
lƣu truyền rộng rãi trong nhân dân và đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ một loại rau
xanh ăn hằng ngày hay một thứ lá giải độc rƣợu hiệu quả. Lá đắng cũng đƣợc
biết đến nhƣ một loại thần dƣợc có thể phòng và điều trị nhiều bệnh nhƣ: tiểu
đƣờng, cao huyết áp, lipid máu, các bệnh chuyển hoá liên quan đến gan, ung
thƣ...Cách dùng loài cây này cũng rất đơn giản, lá đem nấu nhƣ một loại rau
xanh hoặc sử dụng lá, thân tƣơi hoặc phơi khô hãm uống nhƣ chè.
Tuy đƣợc cây lá đắng sử dụng phổ biến và có nhiều tác dụng đáng quý nhƣng
chƣa có một nghiên cứu khoa học chính thức nào về thành phần hoá học, tác
dụng dƣợc lý hay mô tả trong sách báo cũng nhƣ tài liệu dƣợc học của Việt
Nam. Vì vậy còn tồn tại nhiều nhầm lẫn không đáng có trong việc sử dụng loài
cây này. Việc thiếu những nghiên cứu chính thức cũng gây nhiều khó khăn trong
việc sử dụng và phát triển cây lá đắng nhƣ một cây thuốc mới.
Trong bối cảnh cây lá đắng đƣợc sử dụng ngày càng rộng rãi và đƣợc xem
nhƣ một loại “thần dƣợc mới” có thể chữa bách bệnh, những nghiên cứu về đặc
điểm thực vật và thành phần hoá học cây lá đắng sẽ giúp phân biệt, tránh đƣợc
những nhầm lẫn không đáng có giữa Vernonia amygdalia Del. và các loài khác,
tạo điều kiện cho việc sử dụng đúng cây thuốc nhằm tăng hiệu quả phòng và

chữa bệnh. Đồng thời nghiên cứu cũng sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp
theo.
Xuất phát từ bối cảnh đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm
thực vật và thành phần hoá học cây Lá Đắng” với các mục tiêu chính sau:
- Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học cây lá đắng.
- Xác định một số thành phần hoá học của cây lá đắng.
Để thực hiện mục tiêu đó, đề tài tiến hành một số nội dung chính sau:
Về mặt thực vật:
 Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học loài nghiên cứu.
 Giải phẫu, mô tả đặc điểm cấu tạo của lá, thân, rễ.

1


 Xác định và mô tả đặc điểm bột lá, thân, rễ.
Về mặt hoá học :
 Định tính các nhóm chất chính trong lá, thân bằng phản ứng hoá học.
 Định tính flavonoid trong lá, thân bằng Sắc kí lớp mỏng.
 Đinh lƣợng luteolin trong lá, thân.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

VỀ THỰC VẬT HỌC

1.1.1.Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Vernonia
1.1.1.1. Vị trí phân loại

Theo một số tài liệu, chi Vernonia đƣợc xếp vào vị trí phân loại nhƣ sau:
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ Cúc (Asterales)
Họ Cúc (Asteraceae)
Chi Vernonia.
Chi Vernonia gồm khoảng 1000 loài cây thân thảo và cây bụi trong họ Cúc.
Một số cây đƣợc biết đến nhƣ là cây gỗ. Một số loài ăn đƣợc và có giá trị kinh
tế [23].
Các loài của chi này thƣờng đƣợc tìm thấy ở Châu Á, Châu Phi, Bắc và
Nam Mĩ. Tại Ấn Đội, chi này có 56 loài và 17 thứ [30].
1.1.1.2.Đặc điểm
Cây lâu năm hoặc hằng năm hiếm khi là cây bụi, cây nhỏ, dây leo hoặc bò
sát, ít khi có nhựa mủ. Lông đơn, dạng chữ T, hình sao hoặc có tuyến [23].
Lá thƣờng xen kẽ, hiếm khi mọc đối hoặc chụm ba lá, đôi khi mọc hình hoa
thị đơn giản, không cuống hoặc có cuống. Lá thƣờng có gân lông chim. Toàn
bộ mép lá có dạng thuỳ hoặc đầy gai [23].
Hoa mọc thành cụm, cụm hoa có 1-200 hoa, cụm hoa thƣờng lƣỡng tính.
Lá bắc xếp chồng lên nhau, có khoảng từ 1 đến 12 lá [23].
Quả bế thƣờng có 10 gờ, đôi khi có 3-5 góc, hiếm khi lƣỡng hình. Hạt
phấn có đƣờng kính từ 37- 80 pm [23].
1.1.2.Loài Vernonia amygdalina Del.

3


1.1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao từ 1,5-3m. Thân vừa phải phân nhiều nhánh,
thân cây non có góc cạnh, gần nhƣ nhẵn ở dƣới, nhiều lông bao phủ bên ngoài
[16], [17].

Lá mọc cách, nhiều hình dạng và kích thƣớc, hình mác một số hình trứng,
kích thƣớc 3-17x 1,3-7cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có khía răng cƣa, mặt trên lá
nhẵn có nhiều lông mềm, mặt dƣới của lá và gân có màu nhạt hơn, có lông, vị
đắng. Cuống lá dài 1-4 cm, có nhiều lông mịn [16], [17] .
Cụm hoa hình đầu có nhiều lá bắc nhỏ, dài 0,1-0,2cm, có mùi thơm, có cuống
ngắn. Đầu mang hoa có 11-35 hoa lƣỡng tính, hình chuông rộng 0,2-0,5 cm,
đế hoa nhỏ dài 0,2-0,5cm, màu trắng kem. Tổng bao 25-30 lá bắc, xếp 4-5
hàng, hình trứng, hình trứng hoặc hình chữ nhật hoặc nhọn, dài 0,4-0,6cm,
màu xanh hơi nâu ở đỉnh, hình dải hẹp, vòng trong dài hơn vòng ngoài [15].
Tràng hoa thu hẹp dần bên dƣới. Bộ nhị dài 4,5- 5mm, với 5 chỉ nhị, bao
phấn dính nhau thành ống dài 3-4mm, dính nhau ở đuôi, chỉ nhị dài 11- 14,5
mm, bao phấn thuôn dài hình elip, kích thƣớc 2-2,5x 0,5-0,9mm, phía trên
tách ra mang hai đầu nhuỵ [15].
Quả bế hình elip thuôn dài, 3-4x 0,5-1mm, quả có 10 gân. Túm lông với
những sợi lông trắng loe ra ở đầu [15].
1.1.2.2. Phân bố và bộ phận dùng
Lá đắng có nguồn gốc từ Châu Phi [24].
Cây lá đắng đƣợc di thực vào Việt Nam. Cây rất dễ trồng, chủ yếu bằng
cách giâm cành. Ở khu vực càng nhiều ánh sáng cây phát triển càng mạnh.
Cây có khả năng chịu hạn, dù vậy nó vẫn phát triển tốt ở môi trƣờng có độ ẩm
cao [26]. Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân.
1.2.

VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

V.amygdalina chứa một lƣợng đáng kể các chất lipids [15]. Tỷ lệ protein
trong lá 6,71% và chất béo 34,03% [21] , chứa nhiều chất đạm cần thiết có
nhiều các acid amin, chất xơ [15], chất bột [35].
Trong 100g lá có 49,0 mg vitamin C; 21,5 IU vitamin A; 106,2 IU vitamin
E; 0,5mg thiamin; 0,13 mg riboflavin; 0,03mg niacin [21].

4


Khoáng chất có nhiều nhất trong lá đắng là sắt, hàm lƣợng sắt rất lớn
khoảng 468,16 mg/g, ngoài ra có Ca 3,324 mg/kg; Phospho 1,288mg/kg; Kali
2,009 mg/kg; Natri 3,746 mg/kg; Magie 1,1mg/kg; Mn 449,44 mg/kg; Cu
26,22 mg/kg; Zn 580,52 mg/kg [34] và một lƣợng nhỏ Se, Cr [21].
Một loạt các chất hóa thực vật oxalate, phytates cũng đƣợc báo cáo có
trong lá cây V. Amygdalina [15], [35], [18].Các hóa thực vật khác có trong lá
cây V. amygdalina là terpenes, coumarins, phenolic acids, lignans, xanthones
và anthraquinones [27].
Lá cây có alcaloid, saponin, tanin [34], [38] anthraquinon, flavonoid,
sesquiterpen lacton [28], [37], [36].
- Chất saponin nhóm Stigmastane- nhƣ vernoniosides A1, A2, A3 [31] ;
A4, B2, B3 [32];C, D và E [22] cũng có trong lá. Saponin thuộc Aseries làm cho lá có vị đắng của loài V. amygdalina. Các saponin
steroidal khác cũng đƣợc xác định trong cây này [19].
- Nhóm sesquiterpen lacton gồm có hydroxyvernolid, vernolide,
vernodalol, vernolepin, vernodalin [29].
- Nhóm flavonoid có 3 flavon là luteolin, luteolin 7-O-beta-glucosid,
luteolin 7-O-glucuronosid [37].
R1
R2
A1

β-OH, H

H

A2

α-OH, H

H

A3

O

H

B1

H, H

OH

Vernoniosides A1, A2, A3, B1
Hình 1.1. Cấu trúc của các Vernonioside.

5


Luteolin.
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của Luteolin.
Trong vỏ thân cây có saponin, tanin, alkaloid, flavonoid, hydrocianid [21],
[20]. Dịch chiết ethanol 80% từ vỏ thân có saponin 13,21%, alkaloid 7,02%,
flavonoid 1,02%, hydrocyanid 3,04% và một lƣợng nhỏ tanin [21].
1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ
1.3.1. Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, chống sốt rét
Dịch chiết lá đắng thể khả năng chống lại Staphylococus aureus,

Escherichia coli và Pseudomonas aeroginosa. Dịch chiết bằng methanol 60%
cho tác dụng chống lại Bacillus subtilis, vi khuẩn gây viêm phổi Klebsiella,
P.Aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae và S. Aureus. Cả
Vernodile và vernodalol đƣợc phân lập từ cây lá đắng đều thể hiện tác dụng
chống vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ Bacillus cereus, S.epidermidis, S. Aureus,
Micrococcus kristinae và Streptococcus pyrogens và vi khuẩn Gram âm nhƣ
Salmonella pooni. Tuy nhiên cả hai chất này đều không có tác dụng chống lại
vi khuẩn Gram âm E. coli, Serratia marcescens, P. aeruginosa và K.
Pneumonae [24].
Một số báo cáo chỉ ra rằng, dịch chiết lá đắng có khả năng chống amip
mạnh [24].
Chiết xuất từ lá đắng đƣợc thử hoạt tính kháng nấm. Dịch chiết nƣớc của
lá đắng đã thể hiện khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng mà không
ảnh hƣởng tiêu cực đến sự phát triển của cây trồng. Mặt khác, một số báo cáo
chỉ ra rằng, dịch chiết lá cây lá đắng bằng methanol 60% không có tác dụng
trên Candida albicans- một loại nấm bệnh cơ hội phổ biến ở ngƣời [24].

6


Một số báo cáo chỉ ra rằng, dịch chiết Ethanol của lá và vỏ rễ của lá đắng
làm giảm bệnh gây ra do tiêm Plasmodium berghei ở chuột từ 54-67% tƣơng
ứng trong 4 ngày. Dịch chiết nƣớc của lá cũng thể hiện tác dụng làm giảm
lƣợng P. Berghei ở chuột lên đến 73% khi tiêm trong ổ bụng trong 4 ngày.
Một số báo cáo cũng chỉ ra rằng, dịch chiết nƣớc của lá đắng có thuộc tính
giảm đau trung ƣơng và ngoại biên, điều này là cơ sở cho việc sử dụng lá
đắng trong quản lý sốt rét trong dân gian. Một số ý kiến cũng cho rằng các
hợp chất nhƣ saponin, flavonoid, alkaloid, sesquiterpene và steroid đóng vai
trò trong tác dụng chống loạn nhịp của lá đắng [24].
Tác dụng chống lại một số kí sinh trùng kí sinh trên ngƣời của dịch chiết

lá đắng cũng đã đƣợc nghiên cứu. Nghiên cứu trên in vitro sử dụng
Leishmania aethiopica cho thấy amastigotes nhạy cảm với dịch chiết lá đắng
hơn promastigotes, nó cũng cho thấy dịch chiết cloroform có tác dụng diệt kí
sinh trùng mạnh hơn dịch chiết methanol. Thêm nữa, các báo cáo cũng chỉ ra
rằng dịch chiết lá đắng có tác dụng chống lại sán máng. Những điều này thể
hiện rõ ràng rằng lá đắng có thể rất hữu ích trong việc chống lại kí sinh trùng
trên ngƣời [24].
1.3.2. Tác dụng chống ung thƣ, khối u
Ngƣời ta cho rằng coumarins, flavonid, lactones sesquiterpen, edotide là
các chất tạo ra khả năng chống ung thƣ của lá đắng. Các nghiên cứu cũng chỉ
ra rằng dịch chiết chloroform của lá đắng có tác dụng chống ung thƣ mạnh.
Hoạt tính pepid từ dịch chiết nƣớc của lá cây lá đắng có tác dụng quản lý ung
thƣ. [24].
Dịch chiết của Choloroform, Butanol, Ethyl acetat, hexan của lá đắng ức
chế sự phát triển tế bào ung thƣ vú ở ngƣời ngay cả ở nồng độ 0,1mg/ml. Ở
nồng độ 1mg/ml, tỉ lệ ức chế lên đến 98% với một số phần của dịch chiết
[24].
1.3.3. Tác dụng chống oxi hoá
Flavonoids đƣợc biết đến là chất chống oxi hoá tốt, và Luteolin (một
flavonoid đƣợc tìm thấy trong lá đắng) đã đƣợc báo cáo là một chất chống oxi
hoá. Khẳng định Luteolin là một chất chống oxi hoá mạnh hơn cả BHT, và

7


glucosides của nó Luteolin-7-O-β-glucuroniside và Luteolin-7-O-β-glucoside
cũng có hoạt tính chống oxi hoá [24].
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng khả năng chống oxi hoá của dịch chiết từ
Ethanol cao hơn dịch chiết từ nƣớc. Các tác giả kết luận rằng, flavonoids gây
ra tác dụng chống oxi hoá của lá đắng [24].

1.3.4.Tác dụng hạ đƣờng huyết và chống tiểu đƣờng
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết nƣớc của lá đắng có tác dụng hạ đƣờng
huyết. Các quan sát cho thấy dịch chiết nƣớc làm giảm đáng kể nồng độ
đƣờng máu của chuột bình thƣờng và chuột bị tiểu đƣờng, tƣơng đƣơng với
ảnh hƣởng của thuốc chuẩn chlopropamide. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng
dịch chiết ethanol lá đắng cũng có tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột khẳng
định các yếu tố trong lá đắng có tác dụng hạ đƣờng huyết có thể chiết đƣợc
bằng cả dung môi phân cực và không phân cực [24].
1.3.5.Tác dụng oxytocin
Một số báo cáo chỉ ra rằng các bà đỡ truyền thống ở Malawi sử dụng lá
đắng để tạo co bóp tử cung và kiểm soát xuất huyết sau khi sinh. Điều này gợi
ý cho việc nghiên cứu để kiểm tra tác dụng co cơ trơn tử cung của lá đắng.
Các nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết lá đắng gây co tử cung chuột, co thắt
cơ trơn ruột thỏ và có thể đó đó chính là biểu hiện tác dụng oxytocic của lá
đắng. Các nghiên cứu khác tiến hành trên lợn cho thấy dịch chiết nƣớc lá
đắng làm tăng sản lƣợng sữa và với liều 100mg/ml gây co tử cung biên độ
giống nhƣ ergometrine nhƣng biên độ co bóp cơ trơn vú thấp hơn ergometrine
[24].
1.3.6.Tác dụng bảo vệ gan và thận
Các hợp chất nhóm sesquiterpene đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thí
nghiệm gây độc gan chuột bằng tetrachloromethane. Một số nghiên cứu khác
chứng minh rằng chế độ ăn kết hợp với đƣợc bảo vệ bằng dịch chiết lá đắng
có tác dụng chống lại chất gây độc aflatoxin- B1 gây ra bởi hepatotoxicity trên
chuột bạch vừa cai sữa [24].

8


Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng lá đắng không chỉ bảo vệ gan khỏi tác
động gây độc gan của tetrachloromethane mà còn loại bỏ các tổn thƣơng gan

trên chuột [24].
Nghiên cứu về tác động của dịch chiết Ethanol của lá đắng trên một số chỉ
số của chức năng thận trên chuột kết luận rằng dịch chiết lá đắng có thể bảo
vệ thận chống lại suy thận nhƣng lại gây giảm natri huyết. Tuy nhiên khi kết
hợp dịch chiết lá đắng với một loại dịch chiết thực vật khác, tác dụng giảm
natri huyết không còn nhƣng lại xuất hiện tác dụng giảm tiểu cầu [24].
Sử dụng lá đắng ở liều cao với mục đích bảo vệ gan có thể dẫn đến độc
tính [24].
1.3.7.Tác dụng điều biến lipid huyết thanh
Chế độ ăn kết hợp với lá đắng làm giảm mức độ triacylglycerol và LDLcholesterol huyết thanh và tăng mức độ HDL-cholesterol [24].
Dịch chiết nƣớc lá đắng làm giảm mức dộ triacylglycerol và nồng độ
cholesterol bình thƣờng trong huyết thanh của chuột bị tiểu đƣờng. Dịch chiết
ethanol của lá đắng cũng đƣợc báo cáo là có khả năng duy trì mức độ lipid
trong giới hạn bình thƣờng khi dùng liều 100-1000mg/kg thể trọng. Dịch
chiết methanol của lá đắng cho tác dụng hạ lipid ở chuột có chế độ ăn giàu
cholesterol trong 9 tuần [24].
1.3.8.Một số tác dụng khác
Dịch chiết nƣớc của lá đắng có tác dụng gây tăng tiết dịch dạ dày và sự co
bóp của dạ dày phụ thuộc vào liều, nghiên cứu đƣợc tiến hành trên lợn [24].
Một nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết rễ của lá đắng có tác dụng ức chế
sinh sản [24].
1.3.9. Đặc tính gây độc của lá đắng
Dịch chiết nƣớc của lá đắng đƣợc báo cáo là có độc tính thực vật [24].
Bụi từ lá khô của lá đắng đƣợc báo cáo có hiệu lực diệt côn trùng, chống
lại một số loài ấu trùng [24].
1.4.VÀI NÉT VỀ LUTEOLIN
1.4.1. Nguồn gốc và một số tính chất của Luteolin

9

-

Tên khác: 5,7,3',4'-tetrahydroxy-flavone.
Công thức tổng quát: C15H10O6.
Phân tử khối: 286,239 g/mol.
Thể chất: Dạng rắn.
Nhiệt độ nóng chảy: 329,5 độ C.
Luteolin là flavonoid, chính xác hơn là một trong các flavonoids sinh
học của họ cam. Cũng giống nhƣ hầu hết các flavonoid, nó có tính chất
chống oxy hoá, chống viêm và chống khối u. Nó đƣợc tìm thấy với số
lƣợng lớn trong rau mùi tây, cỏ xạ hƣơng, bạc hà, rau húng quế, cần tây
và atisô.
1.4.2. Tác dụng dƣợc lý của Luteolin
1.4.2.1.Tác dụng chống oxi hoá
Khả năng chống oxi hoá của Luteolin có đƣợc là do cấu trúc có vòng B và
liên kết đôi C3- C4 liên hợp với nhóm oxo tại C4 [33].
Hoạt tính chống oxi hoá của Luteolin không chỉ đƣợc quan sát thấy trên in
vitro mà còn trên in vivo [33].
1.4.2.2.Tác dụng chống viêm
Luteolin, glycosides và cây có chứa luteolin đã đƣợc báo cáo là có tác dụng
chống viêm in Vitro và in vivo [33].
Tác dụng chống viêm của Luteolin liên quan đến một số cơ chế nhƣ:
- Kích hoạt các yếu tố hạt nhân-kappa B (NF-kappa B) làm tăng sự
biểu hiện của cytokine pro-inflammatory, Chemokine và enzyme (ví
dụ TNF, IL-1, IL-6, IL8, COX-2)
- Luteolin thể hiện khả năng ức chế hoạt động tổng hợp
thrombomboxan và leucotrien.
1.4.2.3.Tác dụng kháng khuẩn
Có rất nhiều báo cáo chỉ ra rằng luteolin, glycosides của nó, hoặc các cây

có chứa luteolin có kháng khuẩn, kháng vi-rút và hoạt tính chống nấm [33].
Luteolin cũng thể hiện tác dụng chống lại một số loại kí sinh trùng nhƣ
Lesmalia donovani và Plasmodium falciparum [33].
1.4.2.4.Tác dụng chống ung thư

10


Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng luteolin có thể ngăn ngừa sự thay đổi DNA
gây ra bởi các chất gây ung thƣ khác nhau cả trên in vitro và in vivo [33].
Luteolin đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật chống lại tia
cực tím [33], chống ảnh hƣởng của phóng xạ. Nghiên cứu đƣợc thực hiện trên
cả in vitro và in vivo [33].
1.4.2.5. Các hoạt tính sinh học khác
Dữ liệu thực nghiệm chỉ ra rằng luteolin, một số glycosides của nó hay thực
vật có flavonoid này có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch bằng cách giảm mức độ
huyết áp và cholesterol [33].
Ngăn ngừa bệnh đái tháo đƣờng bằng cách giảm mức glucose [33].
Ngăn ngừa các bệnh thoái hóa thần kinh bằng cách giảm Stress, giảm viêm
và sản sinh beta-amyloid [33].
Luteolin cũng cho thấy hoạt động chống dị ứng trên in vitro và in Vivo qua
các cơ chế khác nhau bao gồm ức chế giải phóng histamine [33].
1.4.3. Tác dụng không mong muốn của Luteolin
Một số báo cáo cho thấy ở một số nồng độ luteolin cụ thể có thể gây hiệu
ứng độc [33]. Một trong những báo cáo này gợi ý rằng những phản ứng độc
hại do luteolin gây ra có thể do khả năng gây ra thiệt hại DNA qua trung gian
topoisomerase II; Tác động này trên topoisomerase II đã đƣợc quan sát trên in
Vitro và in vivo [33]. Mặc dù sự suy thoái topoisomeraza II gây ra bởi
luteolin có thể dẫn đến chết tế bào ung thƣ và có ích về mặt trị liệu, nhƣng
mức độ tổn thƣơng DNA có thể tích tụ và gây độc về lâu dài [33]. Thật vậy,

sử dụng trên lâm sàng các chất độc topoisomerase II trong hóa trị liệu ung thƣ
có sự liên quan với việc tăng tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu [33]. Những dữ liệu này
gợi ý rằng nồng độ cao của Luteolin có thể gây ra tác dụng độc hại về dài hạn.
1.4.4. Công dụng của Luteolin
Hiện nay Luteolin thƣờng đƣợc dùng để điều trị, kiểm soát, phòng chống
và cải thiện những bệnh, hội chứng và triệu chứng sau:
-Tăng huyết áp.
-Rối loạn viêm.
-Chức năng thần kinh.
-Chức năng cơ bắp.

11


1.5. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƢỢC LIỆU
1.5.1. Giới thiệu sơ qua về HPTLC
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của
kĩ thuật sắc kí lớp mỏng (SKLM). Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển
khai sắc kí bán tự động: Máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, AST
4), thiết bị triển khai sắc kí (ADC 2), thiết bị soi và chụp ảnh (TLC
Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3,4) và bản mỏng hiệu năng cao
HPTLC [40].
Ƣu điểm của phƣơng pháp này so với SKLM:
- Khả năng phân tách tốt hơn (Bản mỏng hiệu năng cao có kích thƣớc hạt
nhỏ hơn, đồng đều hơn nên hấp phụ tốt hơn).
- Lƣợng chất đƣa lên bản mỏng ít hơn, đƣa đƣợc lên bản mỏng một
lƣợng mẫu chính xác, vết mẫu gọn.
- Độ lặp lại tốt do hệ thống máy giảm thiểu tối đa các ảnh hƣởng bên
ngoài lên kết quả.
- Có thể bán định lƣợng đƣợc hàm lƣợng Luteolin trong mẫu nhờ hệ

thống quét chụp và phần mềm xử lý hình ảnh.
1.5.2. Ứng dụng của HPTLC trong định lƣợng
Dựa trên diện tích pic hoặc dựa trên cƣờng độ màu (khi phun thuốc thử
hoặc khi soi UV) của các vết trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng
cao), nếu có mẫu chuẩn tƣơng ứng có thể định lƣợng một chất hay một nhóm
chất có trong mẫu thử. HPTLC đƣợc sử dụng trong bán định lƣợng bằng
phƣơng pháp so sánh. Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác
nhau đƣợc pha sẵn. Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và
diện tích pic đáp ứng của chất đó trên sắc kí đồ để xây dựng đƣờng chuẩn
định lƣợng. Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong
mẫu thử và nội suy nồng độ chất cần phân tích từ đƣờng chuẩn đã xây dựng ở
trên [2].
1.5.3. Một số nghiên cứu ứng dụng HPTLC
Trƣớc đây và cho đến nay, phƣơng pháp HPTLC đã đƣợc sử dụng trong
nhiều nghiên cứu trong tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, cao thuốc, thuốc từ dƣợc
liệu trên thế giới và cả trong nƣớc. Một số nghiên cứu đã đƣợc công bố:

12


- Năm 2011, DS.Nguyễn Thị Hồng Hạnh đã nhận biết sâm Ngọc Linh
bằng HPTLC [6]: kết quả sắc ký đồ bản mỏng HPTLC các mẫu sâm
trong dịch chiết ethanol cho thấy có sự khác nhau rõ rệt giữa sâm Ngọc
Linh và sâm Hàn Quốc. Từ đó có thể sơ bộ kết luận mẫu sâm Ngọc
Linh.
- Năm 2013, Nguyễn Ngọc Tú đã xác định sự tƣơng đồng về thành phần
hóa học của một số loài trong chi Gymnena R. Br trồng tại một số nơi
khác nhau và dừa vào đó để xây dựng cây phân loại thực vật chí [10].
- Năm 2010, nghiên cứu định lƣợng berberin bằng HPTLC đƣợc tiến
hành ở Ấn Độ. Kết quả hàm lƣợng berberin là khoảng 4,0%. Thẩm

định độ chính xác và độ lặp lại của phƣơng pháp cho RSD lần lƣợt là
3,0% và 2,7% [10]. Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012, Nguyễn
Thị Thu Hằng cũng đã định lƣợng berberin trong thân và rễ của một số
cây loài Berberis. Bằng phƣơng pháp HPTLC. Kết quả hàm lƣợng
berberin trong mẫu rễ là 3,98% và trong mẫu thân là khoảng 1,6% đến
3,1% [10].
- Quy trình định lƣợng tetradrine trong củ S.tetrandra S.More (phòng kỷ
- họ Tiết dê – Menisperaceae) bằng phƣơng pháp HPTLC là một trong
số các bộ quy trình định lƣợng đang đƣợc hãng Camag xây dựng [10].
Tetrandine là thành phần hoạt chất chính, có tác dụng lợi tiểu và làm
giảm tình trạng thấp khớp. Dƣợc điển Trung Quốc quy định hàm lƣợng
của tetrandine trong dƣợc liệu phải trên 0,7%. HPTLC không chỉ giúp
xác định nhanh hàm lƣợng tetrandine mà hình ảnh sắc ký đồ còn giúp
phân biệt vị thuốc này với một vị thuốc khác cũng có tên là phòng kỷ
nhƣng thuộc họ Mộc thông (Aristolochiaceae), trong thành phần có
chứa acid độc aristolochic là chất gây ra suy thận và ung thƣ [10].

13


- Quy trình định lƣợng hàm lƣợng oxostephania trong cây Củ Dòm –
Stephania dielsiana Y.C.Wu – thu hái tại Ba Vì. Oxostephania là một
alcaloid có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thƣ. HPTLC đã
đánh giá nhanh đƣợc hàm lƣợng oxostephania giữa các mẫu lá, thân và
củ của cây, giữa cây trồng có nguồn nhân giống vô tính và hữu tính
[10].
- Dựa vào “dấu vân tay” hóa học của dƣợc liệu, năm 2014, tại hội nghị
Khoa học tuổi trẻ của trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Phạm Thị Việt
Hồng đã đánh giá nhanh đƣợc hàm lƣợng rotundin trong một số loài
Bình vôi thu hái tại Việt Nam bằng phƣơng pháp HPTLC, kết quả thu

đƣợc tại một số loài nhƣ sau: Stephania brachyandra Diels (6,25%);
Stephania sinica Diels (3,05%); Stephania glabra (Roxb) Miers
(4,03%); Stephania kwangsiensis H.S.LO (3,61%); Stephania dielsiana
Y.C.Wu (0,2%); Stephania venosa (0,43%) [10].
- Năm 2015, Dƣợc sĩ Tống Xuân Quang đã đánh giá hàm lƣợng rutin
trong các mẫu hoa hòe qua các thời kỳ phát triển hoa. Kết quả thu đƣợc
nhƣ sau: hàm lƣợng đo đƣợc trong nụ non cao nhất là 29,86% tính theo
phần trăm khối lƣợng khô, hàm lƣợng rutin trong quả thấp nhất là
2,34%. Đồng thời đã đánh giá hàm lƣợng rutin biến đổi trong các mẫu
nụ trƣớc và sau chế biến theo YHCT. Qua chế biến nụ hoa hòe theo
YHCT đã làm giảm lƣợng rutin xuống và chuyển dạng rutin trong nụ
thành các thành phần khác làm thay đổi tác dụng của vị thuốc. Giảm
nhiều nhất là sao đen, hàm lƣợng rutin giảm đi 23,21% so với ban đầu,
sao vàng giảm đi 7,13% so với ban đầu [10].

14


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Rễ, thân, lá cây Lá Đắng thu hái tại huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam ngày
15-03-2016.
Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu đƣợc làm tiêu bản cây khô và lƣu tại
phòng tiêu bản, trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội. Mã số tiêu bản:
HNIP/18498/17.
Mẫu nghiên cứu về hoá học đƣợc phơi khô, sấy ở nhiệt độ 55-60 độ C cho
đến khi hàm ẩm đạt dƣới 8%, bảo quản ở nơi khô ráo thoáng mát.
2.1.2. Hoá chất
Toluen, ethylacetat, acid formic, butanol, acid hydroclorid, cloroform,

aceton, nƣớc, Ethanol, HCl, NaOH, Toluen, N-hexan, Acid sulfuaric.
Thuốc thử: Mayer, Dragendoff, Buchardat, FeCl3, NaOH 10%, HCl, Chì
acetat, dd gelatin, nƣớc Brom.
Chất chuẩn Luteolin, hàm lƣợng trên 98%, nguồn gốc Trung Quốc.
2.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Camag gồm: Máy Linomat 5, ADC
2, TLC visualizer, Phần mềm WinCATS, phần mềm VideoScan.
Tủ sấy WiseVen WOF.
Máy đo hàm ẩm Precisa HA 60.
Cân phân tích Shimadzu (AY 220).
Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
Bình chiết hồi lƣu.
Bình triển khai sắc kí Camag.
Nồi đun cách thuỷ.
Máy đo độ ẩm MB45- OHAUS- USA.
Dụng cụ thuỷ tinh các kích thƣớc khác nhau: cốc có mỏ, ống nghiệm, bình
nón, phễu thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, pipep chính xác, bình nón, ống đong...
2.2.NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.1. Nghiên cứu về thực vật

15