Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (digenea) ký sinh ở cá chẽm (lates calcarifer bloch, 1790) nuôi ở khánh hòa (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------oo0oo-----------

NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN
LÁ SONG CHỦ (DIGENEA) KÝ SINH Ở
CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER BLOCH,
1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÕA

Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản
Mã số: 62620301

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Khánh Hòa – 2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Nha
Trang

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đỗ Thị Hòa
2. PGS.TS. Glenn Allan Bristow

Phản biện 1: PGS.TS. Vũ Ngọc Öt
Phản biện 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy
Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Thịnh

Luận án đƣợc bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp

cơ sở họp tại Trƣờng Đại học Nha Trang vào hồi
14 giờ ngày 20 tháng 12 năm 2016.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thƣ viện Quốc gia
Thƣ viện Trƣờng Đại học Nha Trang


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
CỦA LUẬN ÁN
1. Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá
song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai
phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân tử.
Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5
giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh
Khánh Hòa, Việt Nam.
Đặc biệt nghiên cứu này đã xác định được loài sán
Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên
vật chủ là cá chẽm;
2. Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các
loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;
3. Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1
loài sán lá song chủ Pseudometadena celebesensis có giai
đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi tại Khánh
Hòa.
Ngƣời hƣớng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

PGS. TS. Đỗ Thị Hòa

Nghiên cứu sinh
(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Võ Thế Dũng, Võ Thị
Dung, Glenn Allan Bristow, Đỗ Thị Hòa (2010), Thành
phần ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch,
1790) nuôi ở Khánh Hòa. Tạp Chí Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn, Số 6/2010, trang 59-63.ISSN: 0866-7020.
2. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Glenn Allan
Bristow, Phạm Thị Hạnh (2017), “Thành phần và mức độ
nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi
tại Khánh Hòa”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, 6/2017, tr. 90-94.
3. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn, Đỗ Thị Hòa, Đặng Thúy
Bình, Phạm Thị Hạnh, Trương Thị Oanh (2017), “Nghiên
cứu mối quan hệ phát sinh loài của sán lá song chủ ký sinh
trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh
Hòa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Trường Đại
học Nha Trang, 2/2017, tr. 63-70.


MỞ ĐẦU
Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) là đối tượng nuôi có giá
trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á và Thái
Bình Dương. Từ năm 2005, nghề nuôi cá chẽm mới phát triển nhanh
chóng ở một số tỉnh ven biển nước ta như Quảng Ninh, Hải Phòng,

Khánh Hòa, Vũng Tàu. Hiện nay, cá chẽm được nuôi thương phẩm
trong ao hoặc nuôi lồng trên biển.
Tuy nhiên, trong những năm qua nghề nuôi cá chẽm thường
xuyên gặp khó khăn do dịch bệnh. Ký sinh trùng (KST) là một trong
những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, gây tổn thất nhiều. Trong đó,
sán lá song chủ ( Digenea) gây ra các bệnh trên cá là c á c KST
có chu kỳ phát triển phức tạp, qua nhiều giai đoạn ấu trùng, đòi hỏi
có từ 1-2 ký chủ trung gian trong vòng đời, giai đoạn trưởng thành ký
sinh trùng này thường ký sinh trong các nội quan của cá như: máu,
gan, mật, ruột, dạ dày…. , làm chậm sự tăng trưởng, ảnh hưởng
đến chất lượng cũng như sản lượng cá nuôi.
Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định
danh phân loại đến giống loài của tác nhân gây bệnh ở cá (gồm vi
khuẩn và KST) bằng phương pháp truyền thống kết hợp với kỹ thuật
sinh học phân tử, nhằm phân loại chính xác đến loài của các ký sinh
trùng này và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Tuy nhiên,
dùng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại đến giống loài của tác
nhân gây bệnh như KST ở cá là lĩnh vực còn mới ở Việt Nam.
Xuất phát từ thực tế như trên, tôi đã được cở sở đào tạo cho phép
thực hiện đề tài nghiên cứu luận án “Nghiên cứu thành phần loài
sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer
Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa”.

1


Mục tiêu: Xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ
(Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer), đánh giá mối quan
hệ di truyền của các KST này cùng mức độ nhiễm của KST ở cá
chẽm nuôi và khả năng gây bệnh của các các loài sán song chủ đã

phát hiện được. Từ đó đánh giá khả năng gây bệnh của các loài sán lá
song chủ ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa.
Nội dung nghiên cứu:
1. Xác định thành phần sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi tại
Khánh Hòa.
2. Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền các loài sán lá song
chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học
phân tử.
3. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi ở
Khánh Hòa;
4. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán
Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá chẽm.
Ý nghĩa của luận án
- Ý nghĩa khoa học: Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần
giống loài, mức độ nhiễm và mối quan hệ di truyền của các loài sán
lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi thương phẩm
tại Khánh Hòa và làm cơ sở cho việc phát triển, mở rộng nghiên cứu
trên các loài ký sinh trùng khác.
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài này làm cơ sở
để đưa ra biện pháp phòng bệnh do sán lá song chủ gây ra trong
nghề nuôi cá chẽm.

2


Điểm mới của luận án:
- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ở
cá chẽm bằng phương pháp hình thái cấu tạo kết hợp với kỹ thuật
sinh học phân tử, kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ
thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm.

Ngoài ra đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là
ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm bằng kết hợp phân tích
đồng tiến hóa và các công trình nghiên cứu loài sán này.
- Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá
song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi.
- Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của loài sán lá
song chủ Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh
ở ruột của cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa.

3


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer)
Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) thuộc phân họ cá chẽm
(Latinae) của họ Centropomidae, thuộc bộ cá vược. Cá chẽm phân bố
rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương và
Ấn Độ Dương.
Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60
kg. Cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30g tốc độ
tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi cá đạt khoảng 4 kg.
Cá chẽm là loài chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là cá đực, lớn
chuyển sang cái.
1.2. Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thƣơng phẩm trên
Thế giới và Việt Nam
Cá chẽm được nuôi phổ biến ở nhiều nước thuộc khu vực Châu
Á – Thái Bình Dương, đặc biệt ở các nước trong khu vực Đông Nam
Á như Thái Lan, Phillipine, Đài Loan, Singapore, Malaysia. Theo
FAO thì đến năm 2009, sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 49.299
tấn với đạt giá trị gần 180 triệu USD, trong đó Thái Lan chiếm tới

36% tổng sản lượng, Đài Loan, Malaysia, Indonesia và Úc lần lượt
giữ các vị trí tiếp theo.
Nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam phát triển mạnh từ năm 2005
và được nuôi trong ao và nuôi lồng b , trong đó hình thức nuôi trong
ao phổ biến hơn. Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm thương phẩm hiện
này chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó dễ gây ô nhiễm môi trường và là
điều kiện để cá chẽm dễ bị nhiễm các loài giun sán có vòng đời phức
tạp như sán lá song chủ (Digenea).

4


1.3. Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm Lates calcarifer nuôi
Luận án đã sơ lược tình hình nghiên cứu và thành KST ở cá chẽm
trên thế giới từ châu Âu, châu Mỹ đến châu Á như nghiên cứu của
Velasquez (1962, 1975); Leong & Wong (1986, 1987, 1990); Liang
& Leong (1991); Marty et al., (2001); Anlan & Robir (2005)...
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về KST trên cá biển nói chung và
cá chẽm nói riêng còn hạn chế. Một số nghiên cứu KST trên chẽm
như Đỗ Thị Hòa và cs (2008); Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn và cs
(2010, 2015); Võ Thế Dũng và cs (2012).
Luận án cũng sơ lược tình hình nghiên cứu sán lá song chủ trên cá
biển trên Thế giới và Việt Nam:
Ở Châu Âu và Châu Mỹ
Một số công trình tiêu biểu gồm Möller & Anders (1986), Gibson
& Bray (1979); Paradiznik et al. (2007); Hollis & Manter (1957);
Hisao (1962); Dyer et al. (1986); Nahhas & Carlson (1994); Bullard
& Overstreet (2006); Braicovich et al. (2009).
Ở Châu Đại Dƣơng
Một số công trình nghiên cứu sán lá song chủ đã được công bố,

trong đó nổi bật có nhiều công trình về sán lá song chủ nhất là 2 nhà
khoa học Bray và Cribb, ví dụ như Cribb et al. (1992, 2002); Bray et
al. (1979, 1990, 1991, 1993, 1994); Bray & Palm (2009).
Ở Châu Á
Tại khu vực châu Á, Yamaguti là nhà khoa học đã công bố nhiều
công trình nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở các loài cá biển bao
gồm cả các bài báo và sách, trong đó phải kể đến công trình như
Yamaguti (1941, 1971). Một số nghiên cứu của các tác giả khác có thể
kể đên là Valasquez (1962, 1975); Madhavi (1982); Salam et al.

5


(1990); Nahhas & Sey (2002); Nahhas & Calson (1994); Shih et al.
(2004); Chai et al. (1984); Chai & Lee (2002); Chai et al. (2005).
Việt Nam
Nguyễn Thị Muội & Đỗ Thị Hòa (2004) đã công bố về kết quả
nghiên cứu KST ký sinh trên một số loài cá có giá trị kinh tế khai
thác được trên vùng biển Phú Khánh (nay là Khánh Hòa) trong thời
gian từ 1978- 1980, trong đó phát hiện 29 loài sán lá song chủ.
Arthur và Bùi Quang Tề (2006) đã phát hiện và công bố 453 loài
KST trên cá nước ngọt, lợ và mặn, trong đó có 112 loài sán lá song
chủ. Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn & cs (2010) đã phát hiện 4 loài
sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi. Võ Thế
Dũng và cs (2010, 2012) đã công bố 6 loài sán lá song chủ, 2 loại ấu
trùng metacercaria trên các loài cá mú thuộc giống Epinephelus và 2
loài sán lá song chủ trên cá chẽm (Lates calcarifer).
1.4. Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ
ký sinh
Luận án đã giới thiệu về khái niệm hệ thống học phân tử và hệ

thống học truyền thống, về các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di
truyền của gen nhân và gen ti thể, về ứng dụng các chỉ thị phân tử
trong nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá như:
Nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ ở cá có thể kể đến
nghiên cứu của Riutort et al. (1993); Blair et al. (1996); Ethes, (1984,
1985, 1986); Rohde et al. (1993,1994); Baverstock et al. (1991);
Blair et al. (1993); Nelles et al. (1984); Brook et al. (1989); Gibson
(1987); Pearson (1992); Blair et al. (1996); Carranza et al. (1997);
Fernandez et al. (1998); Littlewood et al. (1999); Olson et al. (2003);
Choudhury et al. (2007)...

6


Nghiên cứu về phân loại sán lá song chủ như Adlard et al. (1993);
Miller & Cribb (2008); Miller et al. (2010); Hunter et al. (2010).
Ngoài ra luận án cũng đã tổng quan những công trình nghiên cứu
về vòng đời sán lá song chủ trên cá biển, ví dụ như Koei (1977, 1986,
1990, 1992); Blair et al. (1996); Cribb et al. (1998); Anderson
(1999); Bartoli et al. (2000); Pina et al. (2009); Ana et al. (2012).
CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm
(Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa
2.1.2. Thời gian nghiên cứu: 2009-2014.
Thời gian thực hiện luận án từ năm 2009 đến năm 2014. Tuy
nhiên, tiến hành thu mẫu cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa để nghiên cứu
thăm dò sán lá song chủ ký sinh được thực hiện từ năm 2007.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu: Tỉnh Khánh Hòa.
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu đã sử dụng

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu cá chẽm nuôi: thu cá ngẫu nhiên từ ngư dân tại các lồng/ao
nuôi. Đã thu thập 875 cá chẽm nuôi ao và 205 cá chẽm nuôi lồng để
kiểm tra sán từ năm 2010 đến 2013. Ngoài ra trước đó từ 2007-2009,
169 mẫu cá chẽm được thu để nghiên cứu thăm dò.
- Thu mẫu ốc và cá tạp để khảo sát vòng đời sán lá song chủ: Thu
1255 mẫu ốc ở các ao nuôi cá chẽm thương phẩm bị nhiễm sán và 5
loài cá tạp gồm cá đối (Mugil sp.), cá hố (Trichiurus sp.), cá nục
(Decapterus sp.), cá liệt (Leiognathus sp.) và cá giò hay cá kình
(Siganus sp.)

7


2.2.2. Phƣơng pháp phát hiện, thu thập, bảo quản,cố định và làm
tiêu bản sán lá song chủ
Áp dụng phương pháp nghiên cứu KST của Dogiel (1929), được
bổ sung bởi Bychowskaija & Paploskaja (1969), Hà Ký (1969).
Thu thập sán lá song chủ: cạo nhớt da và lấy máu phết lên lam
kính; lấy não ép lên lam kính; cắt rời các vây, mang cho vào hộp lồng
đựng nước biển lọc sạch; mổ bụng, tách rời các nội quan cho vào các
hộp lồng đựng nước muối sinh lý.
Cố định, bảo quản và làm tiêu bản: theo hướng dẫn trong các
tài liệu Berland (2005).
2.2.3. Phân loại sán lá song chủ bằng phƣơng pháp hình thái
Phân loại sán lá song chủ theo khóa phân loại và các tài liệu: Sán
trưởng thành Velasquez (1958, 1961, 1962, 1975); Yamaguti (1941,
1952, 1965, 1971); Võ Thế Dũng và cộng sự (2012).
Phân loại ấu trùng sán lá song chủ được giới thiệu bởi Phan Thị
Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) dựa trên các tài liệu phân loại của

Pearson (1964), Yamaguti (1971), Hong et al. (2002), Bùi Quang Tề
(2006, 2007), Sohn (2009); Pinto et al. (2012); Frandsen and
Christensen (1984); Ginetsinskaya (1988); Murrell et al. (2005).
Tiến hành xác định thành phần, mức độ nhiễm sán lá song chủ
trên cá chẽm theo hình thức nuôi, theo thời gian nuôi và tính đặc hữu
ký chủ của từng loài sán tìm thấy.
2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu di truyền sán lá song chủ trên cá
chẽm
Phương pháp nghiên cứu gồm các bước: chuẩn bị mẫu, tách chiết
ADN, khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR, chạy điện di trên gel

8


Argarose và giải trình tự ADN. Từ đó tiến hành phân loại và xác định
mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm.
Sử dụng các cặp mồi từ các nghiên cứu: mồi 18S rRNA của
Littlewood et al. (1998); 28S rRNA của Olson et al. (2003); ITS1
rRNA của Bartoli et al. (2000).
2.2.5. Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh
trên cá chẽm
Khảo sát ký chủ trung gian thứ nhất: kiểm tra ấu trùng cercaria ký
sinh trong ốc thu từ ao nuôi cá chẽm.
Khảo sát ký chủ trung gian thứ 2: kiểm tra ấu trùng metacercaria ở
5 loài cá tạp và bố trí thí nghiệm cho cá chẽm giống (7-10cm) ăn. Thí
nghiệm gồm 5 nghiệm thức: cho ăn bằng cá đối, cá liệt, cá hố, cá nục,
cá giò và thức ăn công nghiệp (Đối chứng). Cá chẽm giống được
nuôi trong bể nhựa 200l, số lượng 50 con/bể. Thí nghiệm được lặp lại
3 lần. Sau 30 ngày thí nghiệm, kiểm tra cá chẽm.
2.3. Xử lý số liệu

Nhập toàn bộ số liệu thu được vào phần mềm Excell, sau đó tùy
thuộc mục đích sử dụng mà được xử lý trong các phần mềm khác
nhau.
- Xác định tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm theo công
thức;
- Xử lý dữ liệu di truyền sán lá song chủ: các trình tự ADN sán lá
song chủ được dóng hàng bằng phần mềm Bioedit, so sánh trình tự
tương ứng trên Genbank được xử lý và kết nối bằng phần mềm MEGA
6.06 (Kumar et al., 2009), sau đó kiểm chứng bằng chương trình
BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Xác định mức độ tương đồng và sự
khác biệt di truyền của các loài sán.

9


CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Phát hiện, thu thập, cố định và phân loại thành phần giống
loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng
phƣơng pháp truyền thống
Nghiên cứu đã phát hiện được 6 loài sán thuộc 6 giống, 4 họ, 1 bộ.
Bảng 3.2. Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh
Loài sán
Tranversotrema
patialanse
Erilepturus
hamati
Pseudometadena
celebesensis
Buccephalus
margaritae

Helicometra
fasciata*
Elytrophallus sp.*

của sán lá song chủ (n=1.080)
Vị trí ký
Tỷ lệ nhiễm
sinh
(%)

Cường độ nhiễm
(trùng/cá)
1,88 ± 2,26
(1 – 28)
4,84 ± 5,02
(1 – 37)
16,57 ± 22,24
(1 – 186)
1,33 ± 0,59
(1 – 3)

Da

15,19

Dạ dày

50,83

Ruột

40,65

Ruột

3,33

Ruột

-

-

Ruột

-

-

(Ghi chú: Trong ngoặc là giá trị lớn nhất và nhỏ nhất. Loài * phát
hiện 1 con nên không tính mức độ nhiễm và so sánh).
Bảng 3.1. Thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm
nuôi ở Khánh Hòa
Ngành

Lớp

Bộ

Plathelminthes

Plagiorchiida
Scheider, 1873 Trematoda
La Rue, 1957
Rudolphi,1808

Họ

Giống

Loài

Opecoelidae
Ozaki, 1925

Helicometra
Odhner, 1902

1. H. fasciata
Rudolphi, 1819

Bucephalidae
Poche, 1907

Bucephalus
Baer, 1826

2. B. margaritae
Baer, 1827

Erilepturus

Woolcock, 1952

3. E. hamati
Yamaguti, 1934

Hemiuridae
Luhe, 1901

10


Cryptogonimidae
Ciurea, 1933

Elytrophallus
Manter, 1940

4. Elytrophallus
sp.

Pseudometadena
Yamaguti, 1952

5. P. celebesensis
Yamaguti, 1952

Transversotrematidae Transversotrema 6. T. patialense
Witengberg, 1944 Soparkar, 1924
Yamaguti, 1954

Trong 6 loài sán được tìm thấy trong nghiên cứu này, loài có mức
độ cảm nhiễm cao nhất là Erilepturus hamati với TLCN và CĐCN lần
lượt là 50,83% và 4,84±5,02 trùng/cá; Tiếp theo là loài
Pseudometadena celebesensis với mức độ cảm nhiễm lần lượt là
40,65% và 16,57±22,24 trùng/ cá. Loài Buccephalus margaritae có
MĐN thấp nhất là 3,33 % và 1,33 ± 0,59 trùng/cá.
Giữa hai hình thức nuôi cá chẽm, qua 3 năm nghiên cứu (20102012), 3 loài có TLCN (%) khác nhau có ý nghĩa thống kê, chỉ có
loài B. margaritae khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên,
với CĐCN chỉ có một trường hợp khác nhau có ý nghĩa thống kê là
E. hamati giữa hai hình thức nuôi cá chẽm.
Hình thái cấu tạo: Tất cả sáu loài sán lá song chủ trong Bảng 3.2
đều được mô tả rõ ràng, k m theo các số liệu về kích thước cơ thể,
kích thước của các bộ phận dùng để định loại và thảo luận. Mỗi loài
sán đều có hình chụp và hình vẽ tổng thể và hình vẽ các bộ phận
trong luận án.
Tính đặc hữu vật chủ của sán lá song chủ (Host-specificity)
+ Tính đặc hữu của sán lá song chủ và cá chẽm được khảo sát
thông qua quá trình đồng tiến hóa. Kết quả kiểm tra giá trị P-value
cho thấy chỉ có loài Pseudometadena celebesensis và cá chẽm có xảy
ra quá trình đồng tiến hóa (P ≤ 0.05).

11


Bảng 3.8. Kết quả Parafit của các loài sán lá song chủ trên cá
chẽm. Giá trị P-value đƣợc tính toán sau khi phân tích 999 hoán
vị ngẫu nhiên
Vật chủ

Ký sinh trùng

P-value

Lates calcarifer

Transversotrema patialense

0.999

Lates calcarifer

Bucephalus margaritae

0.976

Lates calcarifer

Pseudometadena celebesensis

0.043*

Lates calcarifer

Helicometra fasciata

0.981

Lates calcarifer

Ertlepturus hamati

0.998

Lates calcarifer

Prosorhynchus pacificus

0.169

Dicentrarchus labrax

Bucephalus margaritae

0.390

Stereolepis gigas

Helicometra fasciata

0.426

Lateolabrax japonicus

Ertlepturus hamati

0.341

Paralabrax nebulifer

Prosorhynchus pacificus

0.185

Global test (Kiểm tra

0.008

tổng thể)

* Giá trị ý nghĩa (P ≤ 0.05)
+ Kết hợp với việc tìm hiểu và tham khảo nhiều công trình đã
công bố về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển cho thấy đa số các loài
thuộc sán lá song chủ đều có thể ký sinh trên 2 loài cá khác nhau như
loài H. fasciata, T. patialense, E. hamati đều được tìm thấy trên các
loài cá mú thuộc giống Epinephelus ở Việt Nam (Võ Thế Dũng,
2008, 2010). Trên thế giới, loài H. fasciata được tìm thấy ký sinh trên
nhiều loài cá biển khác nhau (Aken et al., 2006). Loài T. patialence
ký sinh ở dưới vảy cá cả cá nước ngọt và cá biển (Velasquez, 1961).
Loài E. hamati ký sinh trên nhiều loài cá biển khác nhau như đề cập
ở phần mô tả loài sán này. Loài B.margaritae được nhiều tác giả tìm

12


thấy trên nhiều loài cá biển khác nhau như Nahhas và Calson (1994)
tìm thấy trên cá Caranx latus, Velasquez (1975) tìm thấy trên cá
Carax sp. ở Philippine, Hisao (1962) phát hiện ở cá Centropomus
pectinatus ở Mexico. Loài Elytrophallus mexicanus được Rivera
(1995) tìm thấy trên cá mú Epinephelus labriformis ở vùng biển
Mexico.

Chỉ riêng loài P.celebesensis trong nghiên cứu này cũng được
nhiều tác giả phát hiện ký sinh trong ruột cá chẽm ở những vùng biển
khác nhau như Rukert et al. (2008) ở Celebes; Leong và Wong (1982,
1987, 1992) ở Malaysia, Singapore và Thái Lan; Supranee Chinabut
(1994) ở Thái Lan; Trong ruột cá chẽm ở vùng biển Philippine,
Velasquez (1962), Ruangpan (1982), Arthur et al. (1997) cũng công
bố tìm thấy loài sán này. Cho đến nay chưa thấy công trình nào trên
thế giới công bố bắt gặp loài P.celebensensis ký sinh ở loài cá biển
khác. Do vậy, với kết quả nghiên cứu và tất cả những điều đã thảo
luận ở trên, có thể kết luận rằng, cá chẽm (Lates calcarrifer) là vật
chủ ưa thích của loài sán này, hoặc có thể xem như loài P.
celebensensis ở giai đoạn trưởng thành là ký sinh trùng đặc hữu của
cá chẽm.
3.3. Phân loại và xác định mối quan hệ các loài sán lá song chủ ký
sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng sinh học phân tử
3.3.1 Khuếch đại, giải trình tự ADN sán lá song chủ ở cá chẽm
Sử dụng ADN tổng số đã tách chiết làm khuôn, Sản phẩm PCR
thu được có kích thước là 1790 bp (18S), 1200 bp (28S) và 900 bp
(ITS1) của rRNA.

13


Hình 3.8. Đoạn gen 18S và 28S

Hình 3.9. Đoạn gen ITS1

3.3.2 So sánh sự khác biệt trình tự giữa các loài sán lá song chủ
sinh trên cá chẽm
+ Giữa các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm, sự khác biệt di

truyền gen 18S rRNA nằm trong khoảng <2% đến 14,5%. Sự khác
biệt lớn nhất là giữa 2 loài Helicometra fasciata và Transversotrema
patialense và sự khác biệt nhỏ nhất là giữa Pseudometadena
celebesensis và Helicometra fasciata (2%). Tỷ lệ này cho thấy sự
khác biệt trình tự gen của các loài sán dao động giữa các giống và
giữa các loài trong cùng 1 giống.
Đối với gen 28S rRNA, sự khác biệt di truyền gen 28S rRNA nằm
trong khoảng giữa các loài SLSC trên cá chẽm là 25,6% đến 40,8%.
So sánh trình tự của gen 28S rRNA của 4 loài sán lá ký sinh ở cá
chẽm với các loài sán khác từ GenBank cho thấy loài
Transversotrema patialense có sự khác biệt với các loài cùng giống
dao động từ 4% (T. haasi) -16.6% (T. tragorum). Riêng loài sán P.
celebesensis có sự khác biệt 9 % và 10,3 % khi so sánh với loài cùng
họ là Caecincola parvulus và Siphodera vinaledwardsii. Loài
Helicometra fasciata ký sinh ở cá chẽm khác biệt với các loài cùng
giống lần lượt là 4,3% (H. manteri) và 8,8% (H. boseli); với loài
cùng giống Bucephalus, lần lượt là 27,3 và 25,8%. Loài Erilepturus

14


hamati khác biệt với loài cùng họ là Lecithochirium caesionis là 16,4
%. Sự khác biệt giữa các giống thấp nhất là 16,2% (giữa Ertlepturus
hamati và Lecithochirium spp.), cao nhất là 43,2% (giữa
Lecithochirium và Transversotrema spp.).
Riêng đối với gen ITS1 rRNA, sự khác biệt trình tự giữa các loài
là rất lớn (62,1-65,8%). Đa số các trình tự chỉ có sự tương đồng ở
phần gen 18S, còn lại đoạn gen ITS 1 đều thể hiện sự đa dạng rất lớn.
3.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài sán lá song chủ ký sinh trên cá
chẽm nuôi ở Khánh Hòa

3.3.3.1. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA

Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA của các loài
sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm; Loài Ediplozoon
nipponucun đƣợc sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup).
Bốn nhóm phụ được phát hiện bao gồm Nhóm 1 gồm loài P.
celebesensis có quan hệ gần gũi với loài Caecincola parvulus GB,
Siphodera vinaledwardsii (thuộc họ Cryptogonimidae) và E. hamati;

15


Nhóm 2 gồm loài Helicometra fasciata từ nghiên cứu này được sắp
xếp cùng nhánh với loài H.boseli từ GenBank và nhóm này có quan
hệ gần gũi với Peracreadium idoneum, 3 loài này đều thuộc họ
Opecoelidae; Nhóm 3 gồm loài Lecithochirium caesionis thuộc
giống Lecithochirium và loài Plerurus digitatus (thuộc họ
Hemiuridae); Nhóm 4 bao gồm loài Transversotrema patialense
thuộc giống Transversotrema và loài Transversotrema haasii từ
GenBank.
3.3.3.2. Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA

Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA của các loài
sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm; Dendritobilharzia
pulverulenta đƣợc sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup).
Ở cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA chia thành 2 nhánh
chính. Nhánh 1 lại được chia thành 4 nhóm phụ: Nhóm 1.1 gồm loài
Helicometra fasciata từ nghiên cứu hiện tại, thể hiện sự tương đồng

16

cao với loài cùng giống từ GenBank, được sắp xếp cùng với 2 loài
thuộc họ Opecoelidae (Peracreadium idoneum và Macvicaria
crassigula). Tiếp đó là nhóm 1.2 với các loài thuộc giống
Bucephalus spp. (Họ Bucephalidae). Nhóm 1.3 là loài P.
celebesensis sắp xếp với các loài cùng họ Cryptogonimidae. Cuối
cùng là nhóm 1.4 phân tách khỏi 3 nhóm gồm các loài thuộc giống
Transversotrema. Nhánh 2 bao gồm loài E. hamati nằm cùng nhánh
với loài Plerurus digatatus, và nhánh này có quan hệ gần gũi với các
loài thuộc giống Lecithochinium (Họ Hemiuridae).
3.4. Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi ở
Khánh Hòa.
3.4.1. Mức độ nhiễm sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi theo năm
nghiên cứu
Bảng 3.12. Tỷ lệ (%) nhiễm sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi tại
Khánh Hòa qua các năm nghiên cứu
Năm

Loài sán
P. celebesensis

T. patialense

H. hamati

B. margaritae

2010 (n=262)

12,98

41,60

38,93

2,67

2011 (n=325)

15,08

55,38

32,00

0,92

2012 (n=245)

18,78

57,14

49,39

5,31

2013 (n=248)

14,11

48,98

45,71

5,31

Nhìn chung, TLN của từng loài biến động theo năm không đáng
kể, các loài đều tìm thấy qua từng năm và những loài nội ký sinh bắt
gặp nhiều với TLN cao hơn loài ngoại ký sinh, ngoại trừ loài
B.margaritae.

17


Bảng 3.13. Cƣờng độ nhiễm trung bình (trùng/cá) của sán lá song
chủ ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu
Năm
2010
(n=262)
2011
(n=325)
2012
(n=245)
2013
(n=248)

Loài sán (trùng/cá)
T. patialense

2.29 ± 4.60
(1 – 28)
1.98 ± 1.18
(1 – 6)
1.83 ± 0.97
(1 – 4)
1.43 ± 0.61
(1 – 3)

H. hamati
3.89 ± 2.83
(1 – 15)
4.96 ± 5.30
(1 – 32)
4.56 ± 4.10
(1 – 26)
5.75 ± 6.72
(1 – 37)

P. celebesensis
18.22 ± 26.66
(1 – 132)
23.84 ± 32.37
(1 – 186)
12.53 ± 10.79
(1 – 55)
12.35 ± 11.07
(1 – 50)

B. margaritae

1.29 ± 0.49
(1 – 2)
1.00 ± 0,00
(1 – 1)
1.38 ± 0.65
(1 – 3)
1.38 ± 0.65
(1 – 3)

Kết quả thu được về tỷ lệ cảm nhiễm (%) và cường độ cảm nhiễm
trung bình (trùng/cá) của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm
không có sự biến động lớn qua 4 năm nghiên cứu (từ 2010-2013).
3.4.2. Mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá chẽm thu từ
hai hình thức nuôi khác nhau: nuôi trong ao đất và nuôi lồng

Hình 3.11. Tỷ lệ nhiễm (%) sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi ao và
nuôi lồng qua các năm nghiên cứu (từ 2010-2012)

18


Hình 3.12. Cƣờng độ nhiễm trung bình (trùng/cá) của sán lá song
chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi trong các ao đất và nuôi lồng
Kết quả ở hình 3.11 và 3.12 đã thể hiện, cá chẽm nuôi ao ven
biển hoặc nuôi lồng trên biển đều bị nhiễm 4 loài sán lá song chủ:
T.patialense, E.hamati, P.celebesensis và B. margaritae. Tuy nhiên
mức độ nhiễm của từng loài sán ở cá nuôi ao và cá nuôi lồng có sự
khác nhau rõ ràng và sự khác nhau này được lặp lại ở cả 3 năm
nghiên cứu, trong đó có 3 trường hợp khác nhau có ý nghĩa thống kê,
chỉ có loài B. margaritae khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa

cá nuôi ao và nuôi lồng qua các năm nghiên cứu.
3.4.3. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi thƣơng
phẩm ở các kích cỡ khác nhau của cá
Bốn nhóm cá được chia theo khối lượng thân như sau: nhóm 1:
<50g (578 con cá), nhóm 2: 50 – 100g (144 con cá), nhóm 3: >100 –
200g (174 con cá) và nhóm 4: >200g (142 con cá). Bốn loài SLSC la
T. patialense, E. hamati, P. celebesensis và B. margaritae đều được
phát hiện ký sinh ở 4 nhóm cá chẽm có kích cỡ khác nhau nhưng với
mức độ nhiễm khác nhau tùy từng loài, từng cỡ cá.

19


Nhóm cá > 200g có mức độ nhiễm cao nhất, trong đó loài P.
celebesensis có tỷ lệ và cường độ cảm nhiễm cao nhất lần lượt là
81,67% và 27,69±25,09 trùng/cá, tiếp theo loài E. hamati vơi 78,17%
và 8,24±6,53 trùng/cá. Ngược lại, nhóm cá có khối lượng nhỏ nhất
(<50g) bị nhiễm sán lá song chủ với mức độ nhiễm thấp nhất và loài
có mức độ nhiễm thấp nhất là B. margaritae (Tỷ lệ cảm nhiễm là
2,94% và cường độ cảm nhiễm là 1,24±0,66 trùng/cá). Như vậy,
trong phạm vi nghiên cứu này, ở cá chẽm có kích cỡ từ < 50g đến >
200g, cá có khối lượng càng lớn thì bị nhiễm SLSC với mức độ
nhiễm càng cao và ngược lại.
3.5. Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng sán
Pseudometadena celebesensis
Khảo sát ấu trùng cercaria trong ốc được thu trực tiếp tại các ao
nuôi cá chẽm bị nhiễm sán này với mức độ nhiễm cao ở Cam Ranh,
Khánh Hòa nhưng không tìm thấy;
Khảo sát ký chủ trung gian thứ 2: kiểm tra ấu trùng metacercaria ở
5 loài cá tạp: cá đối (Mugil sp.-họ Mugilidae), cá nục (Decapterus sp.họ Carangidae), cá liệt (một số giống loài thuộc họ Leiognathidae), cá

hố (Trihiurus sp.-họ Trihiuridae) và cá giò hay cá kình (Siganus sp.-họ
Siganidae) và bố trí thí nghiệm cho cá chẽm giống (6-9cm) ăn. Thí
nghiệm được thực hiện bắt đầu các ngày 28/3/2014, 3/5/2014 và
10/6/2014.
Các loài cá tạp được mua từ các chợ và trước khi thí nghiệm cho
cá chẽm ăn, kiểm tra ấu trùng sán lá song chủ ký sinh. Kết quả thu
được 3 dạng metacercaria M1 (Hình 3.12 luận án), M2 (Hình 3.13),
M3 (Hình 3.14) ký sinh trong cá đối và tiến hành mô tả, chụp hình,
vẻ và đo các bộ phận phân loại.

20


Bảng 3.18: Mức độ nhiễm hậu ấu trùng metacercaria
của sán lá song chủ ở cá đối (n=16)
Loại dạng metacercaria
Mức độ nhiễm

Ấu trùng
metacercaria

Dạng M1

Dạng M2

Dạng M3

Tỷ lệ nhiễm (%)

87,50

62,50

81,25

31,25

Cường độ nhiễm

7,79 ± 4,06

1,90 ± 0,74

6,23 ± 4,15

1,80 ± 0,84

(metacercaria/cá)

(3 – 14)

(1 – 3)

(1 -12)

(1 – 3)

Kết quả ở bảng 3.18 đã thể hiện rằng, cá đối bị nhiễm ấu trùng
metacercaria của sán lá song chủ với tỷ lệ cảm nhiễm rất cao
(87,50%).

Kết quả kiểm tra cá chẽm sau 30 ngày thí nghiệm được cho ăn cá
tạp thì chỉ thấy lô cá chẽm cho ăn bằng cá đối phát hiện sán lá song
chủ P. celebesensis trưởng thành. Tiến hành mô tả, chụp hình, vẻ và
đo các bộ phận phân loại (Hình 3.14 trong luận án).
Bảng 3.21. Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm cho ăn cá
đối
Mức độ nhiễm

Đợt 1

Đợt 2

Đợt 3

Số cá kiểm tra (n)

46

45

41

TLCN (%)

71.74

82.22

70.73

CĐCN (trùng/cá)

2.36 ± 1.25

2.32 ± 1.06

2.69 ± 1.14

Kết quả trong cả 3 đợt thí nghiệm, những bể cá cho ăn bằng cá
liệt, cá giò, cá hố, cá nục và bể đối chứng không tìm thấy sự hiện
diện của sán lá song chủ cũng như ấu trùng sán lá song chủ ký sinh.
Chỉ riêng bể cho ăn bằng cá đối cả 3 đợt đều phát hiện sán lá song
chủ P. celebesensis ký sinh trong ruột với mức độ nhiễm khá cao, cao

21