Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải Keratin trong chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

QUÁCH TH TH NH T M

PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN
PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã ngành: 62 42 01 07
CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH

HÂN

CẦN THƠ, 2017


MỤC LỤC
Trang
LỜI ÁM ƠN ........................................................................................................ii
TÓM LƢỢ

........................................................................................................ iii

ABSTRACT ........................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ...........................................................................................xii
ANH SÁ H ẢNG ........................................................................................ xiv
ANH MỤ TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. xix
hƣơng 1 GI I THI U ........................................................................................ 1
1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu ............................................................ 1

1.2 Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 3
1 4 Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN T I LI U................................................................. 5
2.1 Sơ lƣợc về chất thải lông .................................................................................. 5
2.2 Sơ lƣợc về keratin ............................................................................................. 6
2.3 ác phƣơng pháp ph n giải keratin .................................................................. 7
2.3.1 Phƣơng pháp lý hóa ...................................................................................... 7
2.3.2 Phƣơng pháp sinh học .................................................................................... 8
2.4 Keratinase ......................................................................................................... 8
2 5 ơ chế ph n giải keratin của vi khuẩn ............................................................ 12
2.6 Vi khuẩn ph n giải keratin .............................................................................. 13
2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 13
2 6 2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ................................................................ 18
2.7

ác yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng ph n giải keratin,
sự tạo keratinase và mật số của vi khuẩn ph n giải keratin ....................... 18

2 7 1 Ảnh hƣởng của chất dinh dƣ ng trong môi trƣờng nuôi cấy ...................... 19
2 7 2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH .................................................................... 22

vii


2.7.3 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy .............................................................. 24
2.8

Nhu cầu dinh dƣ ng của gia cầm ................................................................ 25

2.8.1 Nhu cầu về protein ...................................................................................... 25
2.8.2 Nhu cầu về năng lƣợng ............................................................................... 27
2.8.3 Nhu cầu về chất xơ ..................................................................................... 27
2.8.4 Ảnh hƣởng của các khẩu phần protein lên năng suất
sinh trƣởng và chất lƣợng th n th t của gà ................................................... 28
2.9

ột lông gia cầm (bột lông vũ) ..................................................................... 29

HƢƠNG 3 VẬT LI U V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU ....................... 33
3.1 Sơ đồ khối tổng quát nội dung luận án ........................................................... 33
3.2 Nội dung 1: Khảo sát thực trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia súc
gia cầm tại thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp .......................... 34
3 3 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải
keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm ............... .34
3.3.1.Vật liệu ......................................................................................................... 34
3.3 2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 37
3.3 3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 2 .............................................. 45
3.4 Nội dung 3 Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát
triển, khả năng ph n hủy lông và hàm lƣợng protein của chủng sàng đƣợc
tuyển từ Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2 . ....................................................... 45
3.4 1 Vật liệu ......................................................................................................... 45
3.4 2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 45
3.4.3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 3 .............................................. 49
3.5 Ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 ..................... 49
3 6 Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn ph n hủy mạnh
lông gia cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến lông gà thành
thức ăn bổ sung protein cho gà th t ............................................................... 51
3.6 1 Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 51
3.6 2 Phƣơng pháp thí nghiệm ............................................................................. 55

3.6 3 ác ch tiêu theo d i .................................................................................... 56
3.6 4 Ph n tích hóa học ......................................................................................... 59

viii


3.6.5 Ph n tích thống kê nội dung 4 .................................................................. 60
HƢƠNG 4 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN....................................................... 61
4.1 Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải lông gia súc, gia cầm tại Thành
phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp ....................................................... 61
4.1.1 Kết quả khảo sát ........................................................................................... 61
4 1 2 ách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ ............................................. 63
4.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn
hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải
chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm ....................................................... 64
4 2 1 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số
chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của
lông gia cầm từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia cầm .......................... 64
4 2 2 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng
vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của lông gia súc từ
chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc........................................................ 70
4 2 3 Kết quả ph n lập một số chủng vi khuẩn ch u nhiệt có
khả năng ph n giải keratin .......................................................................... 77
4.2.4 Kết quả đ nh danh các chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh .................. 84
425

y phát sinh loài và mối tƣơng quan trình tự 16S rRNA của
vi khuẩn ph n giải keratin ........................................................................... 91

4 3 Nội dung 3: Kết quả ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng

nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng ph n giải
keratin của một số chủng vi khuẩn ................................................................ 95
4 3 1 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến
sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của 2 chủng
vi khuẩn ph n giải keratin mạnh nhất ......................................................... 95
4 3 2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn
đƣa vào đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của
chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn
Brevibacillus parabrevis Kr110 .............................................................. 103
4.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon
đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn
Brevibacillus parabrevis Kr110 .............................................................. 106

ix


4.3.4 Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ
đến sự phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc
và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn
Brevibacillus parabrevis Kr110 ............................................................... 110
4 3 5 Ảnh hƣởng của thời gian đến sự ph n hủy sợi lông nguyên của
2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và
Brevibacillus parabrevis Kr110 ............................................................... 115
4.4 Tiềm năng ứng dụng của chủng VK ph n giải keratin trong luận án ........... 117
4.5 Phƣơng thức bảo quản bộ giống – các chủng vi khuẩn ph n giải keratin .... 119
4.6 Kiểm tra tính ổn đ nh hoạt tính sinh học của các chủng VK đã đ nh danh .. 119
4.7 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn ph n hủy mạnh
lông gia cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành

thức ăn bổ sung protein cho gà th t ............................................................. 120
4.7.1 Tính an toàn sinh học của chủng Bacillus megaterium K79 .................... 120
4.7.2 Sử dụng chủng Bacillus megaterium K79 để ủ lông gia cầm
thành thức ăn bổ sung protein cho gà ta thả vƣờn .................................... 121
4.7.3 Kết quả kiểm tra Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột lông sinh học
thu đƣợc từ lông gia cầm ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 ................. 122
4.7.4 Thành phần hóa học và giá tr dinh dƣ ng của bột lông sinh học thu
đƣợc từ lông gia cầm đƣợc ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 ............... 122
4 7 5 Kết quả thí nghiệm nuôi gà ........................................................................ 125
HƢƠNG 5 KẾT LUẬN V ĐỀ NGH ......................................................... 131
5 1 KẾT LUẬN................................................................................................... 131
5 2 ĐỀ NGH ...................................................................................................... 131
T I LI U THAM KHẢO
PHỤ LỤ 1

Hình ảnh trong khi làm thí nghiệm;- ác phƣơng pháp thực
hiện; - anh sách 35 nhóm vi khuẩn của hệ thống ph n loại
Bergey; - Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia súc,
arcsin tỷ lệ ph n hủy lông gia súc của các chủng vi khuẩn ph n
giải keratin; - Mẫu phiếu điều tra tình hình chất thải tại các cơ
sở giết mổ gia súc – gia cầm; - Kết quả đo O 26 mẫu NA ly
trích đƣợc.

x


PHỤ LỤ 2

Khảo sát các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến
sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lƣợng protein hòa tan

của 2 chủng vi khuẩn K79 và Kr 110.

PHỤ LỤ 3

Thí nghiệm nuôi gà.

PHỤ LỤ 4

Kết quả giải trình tự gen 16s RNA của một số chủng vi khuẩn
đại diện chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh

PHỤ LỤ 5. Thống kê tỷ lệ ph n hủy lông và hoạt độ keratinase của 429
chủng vi khuẩn bản đ a đƣợc ph n lập
PHỤ LỤ 6

Thống kê khảo sát các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng
đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lƣợng protein hòa
tan của 2 chủng VK K79 và VK Kr110

PHỤ LỤ 7

Thống kê thí nghiệm nuôi gà

PHỤ LỤ 8

TIÊU HUẨN VI T NAM T VN 7136:2002

PHỤ LỤ 9 TH ÔN G TƢ 14 /2011/TT-BNNPTNT

xi

DANH SÁCH HÌNH
......................................................................................................................... Trang
Hình 2.1: ấu trúc keratin. .................................................................................... 6
Hình 2.2: ấu trúc keratinase ............................................................................... 10
Hình 2.3: Khuẩn lạc của Streptomyces sp. ........................................................... 14
Hình 2.4 a. Hình chụp (SEM) của Fervidobacterium islandicum AW-1
b. Sự ph n hủy cọng lông gà nguyên của F. islandicum AW-1. .......... 17
Hình 2 5: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự ph n huỷ lông và sự phát
triển của Bacillus megaterium .............................................................. 24
Hình 3 1: Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 33
Hình 3 2: Sơ đồ kiểm tra khả năng ch u nhiệt của các chủng vi khuẩn
đã ph n lập ............................................................................................ 40
Hình 3 3: Sơ đồ ph n nhóm vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm ......................... 41
Hình 3.4: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que của vi khuẩn Gram âm ..... 42
Hình 3.5: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que của vi khuẩn
Gram dƣơng .......................................................................................... 42
Hình 3.6: hu kỳ gia nhiệt của phản ứng P R..................................................... 44
Hình 3 7: Quy trình tăng sinh khối vi khuẩn ph n hủy cơ chất chứa keratin ....... 49
Hình 3 8: Quy trình xử lý chất thải chứa keratin làm thức ăn chăn nuôi ............. 50
Hình 4.1: hủng VK K14 đƣợc tuyển chọn ......................................................... 69
Hình 4.2: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn bản đ a đƣợc ph n lập ................. 85
Hình 4.3: Kết quả chạy điện di sản phẩm P R trên gel agarose của 26 chủng
vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ................................................................... 87
Hình 4.4: Đa dạng về loài của các chủng vi khuẩn ph n giải
keratin đƣợc tuyển chọn ..................................................................... 92
Hình 4.5:

y phát sinh loài thể hiện mối liên hệ di truyền của các chủng vi

khuẩn bản đ a ph n giải keratin tốt với các chủng vi khuẩn có trong
Gen ank (N I) dựa vào trình tự 16S rRNA ................................... 93

Hình 4.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng ph n
hủy bột lông gia cầm và hàm lƣợng protein hòa tan
của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 .................................. 97

xii


Hình 4 7: Mối tƣơng quan giữa pH và mật số vi khuẩn của chủng K79 ............. 98
Hình 4 8: Mối tƣơng quan giữa pH và tỷ lệ ph n hủy lông của chủng K79 ....... 98
Hình 4 9: Mối tƣơng quan giữa pH và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng
K79 ..................................................................................................... 98
Hình 4 10: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng ph n
hủy bột lông gia súc và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng
Brevibacillus parabrevis Kr110 ....................................................... 102
Hình 4.11: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến hiệu suất ph n
hủy bột lông gia cầm và hàm lƣợng protein của chủng VK K79 .... 104
Hình 4 12: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến hàm lƣợng
protein hòa tan, sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia súc của
chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 ............................. 105
Hình 4 13: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến
sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi
khuẩn Bacillus megaterium K79 ...................................................... 107
Hình 4 14: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến
sự phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lƣợng protein
hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 ......... 109
Hình 4 15: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến mật số
của vi khuẩn, tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm và hàm lƣợng protein

hòa tan của chủng Bacillus megaterium K79 ................................... 111
Hình 4 16: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ và nồng độ đến sự
phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lƣợng
protein hòa tan của vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 ........ 114
Hình 4.17: Sợi lông gà nguyên sau 10 tuần ở 2 nghiệm thức ........................... 115
Hình 4.18: (A) hất thải lông gia cầm; ( ) Lông gia cầm trƣớc khi ủ
( ) lông gia cầm sau khi ủ 10 tuần với chủng K79 bản đ a
( ) sản phẩm bột lông sinh học thu đƣợc ..................................... 121
Hình 4 19: Gà thí nghiệm nghiệm thức L5 lúc 14 tuần tuổi ............................ 130
Hình PL4.1: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K14
Hình PL4.2: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K15
Hình PL4.3: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K79
Hình PL4.4: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Kr110
Hình PL4.5: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng V18

xiii


Hình PL4.6: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc39
Hình PL4.7: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc71

xiv


D NH SÁCH BẢNG
......................................................................................................................... Trang
ảng 2 1:

Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến sự ph n hủy
lông gia cầm của Bacillus megaterium F7-1 .................................... 20

ảng 2 2:

Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến sự ph n hủy lông
gia cầm của Bacillus megaterium F7-1 ............................................ 21

ảng 2 3:

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến mức độ phát triển của một
số chủng Bacillus trong môi trƣờng nuôi cấy ................................... 25

ảng 2 4:

Nhu cầu acid amin của gà th t ở các giai đoạn ................................. 26

ảng 2 5:

Thành phần hóa học của bột lông vũ ............................................... 31

ảng 2 6:

So sánh tỷ lệ tiêu hóa acid amin thật của bột lông vũ với một số
thực liệu d ng cho gia cầm ............................................................... 32

ảng 3 1: Số lƣợng mẫu thu đƣợc ở các cơ sở giết mổ ở Vĩnh Long, thành
phố ần Thơ và Đồng Tháp .............................................................. 35
ảng 3 2:

ác thiết b , dụng cụ và hóa chất đƣợc d ng trong nội dung
nghiên cứu 2 ...................................................................................... 35

ảng 3 3:

Môi trƣờng ph n lập VK ph n hủy lông gia cầm cũng là môi
trƣờng tách ròng (MT1) .................................................................... 36

ảng 3 4:

Môi trƣờng tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia cầm (MT2) . 36

ảng 3 5:

Môi trƣờng ph n lập VK ph n hủy lông gia súc cũng là môi
trƣờng tách ròng (MT3) ................................................................... 36

ảng 3 6:

Môi trƣờng tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia súc (MT4) . 36

ảng 3 7:

Thành phần của phản ứng P R ......................................................... 43

ảng 3 8:

Thành phần hóa học của các thực liệu d ng trong thí nghiệm ......... 52

ảng 3 9:

ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dƣ ng của

các khẩu phần thí nghiệm ở gà giai đoạn 5-10 tuần tuổi .................. 53

ảng 3 10:

ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dƣ ng của
các nghiệm thức thí nghiệm ở gà giai đoạn 11-14 tuần tuổi ............. 54

ảng 3 11: Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 55
ảng 3 12: L ch tiêm vaccine phòng bệnh .......................................................... 56

xv


ảng 4 1:

Số lƣợng cơ sở giết mổ ở thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và
Đồng Tháp ......................................................................................... 61

ảng 4 2:

ông suất các cơ sở giết mổ gia súc ở thành phố ần Thơ,
Đồng Tháp và Vĩnh Long ................................................................. 62

ảng 4 3:

Công suất các cơ sở giết mổ gia cầm ở thành phố ần Thơ, Vĩnh
Long và Đồng Tháp .......................................................................... 62

ảng 4 4:

ách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ ở thành phố ần
Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp ......................................................... 63

ảng 4 5:

Nguồn gốc các chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của
lông gia cầm ph n lập đƣợc .............................................................. 64

ảng 4 6:

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn
ph n lập đƣợc .................................................................................... 65

ảng 4 7:

Kết quả kiểm tra hoạt tính keratinase của 115 dòng VK ph n giải
keratin lông gia cầm ......................................................................... 66

ảng 4 8:

Tỷ lệ ph n hủy bột lông gia cầm của 115 chủng vi khuẩn sau một
tuần nuôi lắc ở 37oC .......................................................................... 68

ảng 4 9:

Nguồn gốc các chủng vi khuẩn ph n lập đƣợc có khả năng ph n
giải keratin lông gia súc .................................................................... 70

ảng 4 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn ph n hủy
lông gia súc ph n lập đƣợc ................................................................ 71

ảng 4 11: Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase b ng cơ chất
azokeratin của 225 chủng VK ph n giải keratin lông gia súc........... 72
ảng 4 12: Kết quả đánh giá khả năng ph n hủy lông gia súc của 225 chủng
VK ph n giải keratin lông gia súc ..................................................... 74
ảng 4.13: Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase b ng cơ chất
azokeratin của 89 chủng VK ch u nhiệt ph n giải keratin ................ 78
ảng 4 14: Khả năng ch u nhiệt của 89 chủng vi khuẩn đƣợc ph n lập ............ 79
Bảng 4.15: Khả năng ph n hủy lông gia cầm của 89 chủng vi khuẩn ch u
nhiệt sau một tuần nuôi lắc ở 45oC ................................................... 81
Bảng 4.16: Khả năng ph n hủy bột lông gia cầm của 18 chủng vi khuẩn ch u
nhiệt sau một tuần nuôi lắc ở 50oC ................................................... 82

xvi


Bảng 4.17: Khả năng ph n hủy lông gia cầm của 7 chủng vi khuẩn ch u nhiệt
sau một tuần nuôi lắc ở 55oC ............................................................ 83
ảng 4 18: Đặc điểm của 26 chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn .......................... 84
ảng 4 19: Ph n biệt các đặc tính khác nhau giữa các chi trong nhóm 18 ....... 86
ảng 4 20: Kết quả mối tƣơng quan di truyền giữ 26 chủng vi khuẩn ph n
giải keratin đạt hiệu quả cao với các chủng vi khuẩn từ gen ank
(N I) (sắp xếp theo khả năng ph n giải keratin) ........................... 88
ảng 4 21: Kết quả mối tƣơng quan di truyền 26 chủng vi khuẩn ph n giải
keratin đạt hiệu quả cao với các chủng vi khuẩn có trong gen ank
(N I) (sắp xếp theo nhóm vi khuẩn) .............................................. 91
ảng 4 22: Đa dạng về loài của các nhóm vi khuẩn ph n giải keratin đƣợc
tuyển chọn ......................................................................................... 92
ảng 4.23: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng ph n
hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium K79 .............. 96
ảng 4 24: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng ph n

hủy lông gia súc của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis
Kr110 .............................................................................................. 101
ảng 4 25: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến sự phát triển
và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium K79 ........................................................................... 103
ảng 4 26: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến sự phát triển
và khả năng ph n hủy lông gia súc của chủng vi khuẩn
Brevibacillus parabrevis Kr110 ..................................................... 105
ảng 4 27: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến sự phát triển
và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium K79 ............................................................................ 106
ảng 4 28: Kết quả ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến sự
phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc (lông heo) và hàm
lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus
parabrevis Kr110 ........................................................................... 108
ảng 4 29: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến sự phát triển và
khả năng ph n hủy bột lông gia cầm, hàm lƣợng protein hòa tan
của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 .............................. 111

xvii


ảng 4 30: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến sự phát triển,
khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lƣợng protein hòa tan của
chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 ........................... 113
ảng 4 31: Mật số vi khuẩn, khả năng ph n hủy bột lông gia cầm và hàm
lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium
K79 ở tuần thứ 10 .......................................................................... 116
ảng 4.32: Mật số vi khuẩn, khả năng ph n hủy bột lông gia súc và hàm lƣợng
protein hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis

Kr110 ở tuần thứ 10 ...................................................................... 116
ảng 4 33: Hoạt tính keratinase và tỷ lệ ph n hủy bột lông của chủng K79 và
chủng Kr110 ......................................................................................... 117
ảng 4.34: Kết quả ph n tích mật số Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột
lông sinh học .................................................................................. 122
ảng 4 35: Thành phần hóa học, giá tr năng lƣợng, tỷ lệ tiêu hóa protein và
acid amin của bột lông sinh học thu đƣợc từ lông gia cầm đƣợc
ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 ................................................. 123
ảng 4 36: Ảnh hƣởng của thức ăn thí nghiệm lên khối lƣợng, tăng trọng của
gà ta Gò ông.................................................................................. 125
ảng 4 37: Số lƣợng dƣ ng chất tiêu thụ của gà ta Gò ông ........................... 127
ảng 4 38: Ảnh hƣởng của thức ăn thí nghiệm lên các ch tiêu th n th t ở các
nghiệm thức ..................................................................................... 129
ảng PL1 1: anh sách 35 nhóm vi khuẩn của hệ thống ph n loại ergey
ảng PL1 2: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm, arcsin tỷ lệ ph n
hủy lông gia cầm của 115 chủng vi khuẩn ph n giải keratin lông
gia cầm
ảng PL1 3: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia súc, arcsin tỷ lệ ph n
hủy lông gia súc của 225 chủng vi khuẩn ph n giải keratin lông
gia súc
ảng PL1 4: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 45oC,
arcsin tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 45o của 89 chủng
vi khuẩn ch u nhiệt ph n giải keratin lông gia cầm
ảng PL1 5: Tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 50o , arcsin tỷ lệ ph n
hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 50o của 18 chủng vi khuẩn ch u
nhiệt ph n giải keratin lông gia cầm

xviii

ảng PL1 6: Tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 55o , arcsin tỷ lệ ph n
hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 55o của 7 chủng vi khuẩn ch u nhiệt
ph n giải keratin lông gia cầm
ảng PL1 7: Mẫu phiếu điều tra tình hình chất thải tại các cơ sở giết mổ gia
súc – gia cầm
ảng PL1 8: Kết quả đo O 26 mẫu NA ly trích đƣợc
ảng PL2.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy
lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79
ảng PL2 2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy
lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110
ảng PL2 3: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến sự phát triển,
tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi
khuẩn K79
ảng PL2 4: Ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến sự phát triển,
tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi
khuẩn Kr110
ảng PL2 5: Ảnh hƣởng của nguồn carbon đƣa vào đến sự phát triển, tỷ lệ
ph n hủy lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn
K79
ảng PL2 6: Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy
lông và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110
ảng PL2 7: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông
và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79
ảng PL2 8: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông
và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110
ảng PL3 1: Khối lƣợng, tăng trọng, tiêu tốn thức ăn, hệ số tiêu tốn thức ăn
của gà ở các nghiệm thức
Bảng PL3 2: Vật chất khô ăn vào, Protein thô ăn vào, bột lông ăn vào, năng
lƣợng ăn vào của gà ở các nghiệm thức
ảng PL3 3: h tiêu khảo sát th n th t gà ở các nghiệm thức.

ảng PL4 1: Nguồn gốc 26 chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh.
ảng PL4 2: Đặc tính sinh học của 26 chủng VK đ nh danh của đề tài

atin

xix


D NH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CFU

Colony Forming Unit

CS

ơ sở

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

ddNTP

Dideoxynucleotide

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxy Nucleoside Triphosphate

Đ S L

Đồng

Đ

Đối chứng

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium Bromide

HSP

Heat Shock Protein

LB

Luria Bertani

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

rDNA

ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic Acid

rpm

rotation per minute

rRNA

ribosomal ribonucleic acid

SMA

Skim Milk Agar

TAE

Tris Ammonium acetate Ethylenediaminetetraacetic acid

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris Ethylenediaminetetraacetic acid

Tm

melting Temperature

VK

Vi khuẩn

ng Sông ửu long

xx


CHƢƠNG 1. GIỚI THI U
1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu
Hàng năm, ngƣời d n Việt Nam tiêu thụ hàng triệu tấn th t gia súc, gia
cầm đƣợc nuôi trong nƣớc và nhập khẩu Tính đến tháng 10 năm 2016, th t
tr u đạt 86,6 nghìn tấn, tăng 1% so với c ng thời điểm năm trƣớc; sản lƣợng
th t bò đạt 308,6 nghìn tấn, tăng 3,1%; sản lƣợng th t heo đạt 3,7 triệu tấn, tăng
5%; sản lƣợng th t gia cầm đạt 961,6 nghìn tấn, tăng 5,9% (Tổng cục thống kê
Việt Nam, 2016) Tƣơng ứng với số lƣợng đó là hàng ngàn tấn lông gia súc,
gia cầm thải loại ra môi trƣờng mà chƣa có biện pháp xử lý hiệu quả Tính đến
tháng 12/2016, cả nƣớc có trên 28.000 điểm giết mổ gia súc, gia cầm ( ục
Thú y, 2016) Mặc d từ năm 2005, nhà nƣớc đã ban hành nhiều văn bản về
quy hoạch x y dựng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm tập trung ác t nh
cũng ch đạo đẩy mạnh quy hoạch, x y dựng các cơ sở giết mổ tập trung trên
đ a bàn Tuy nhiên, cho đến nay mô hình này vẫn chƣa đƣợc triển khai mạnh ở
các t nh; các cơ sở giết mổ nhỏ l vẫn còn chiếm ƣu thế Tại các cơ sở này do
chƣa có quy trình xử lý chất thải, g y ô nhi m môi trƣờng trầm trọng, làm ảnh
hƣởng đến các ngành sản xuất khác và sức khỏe của ngƣời d n sống quanh đó
Với nguồn chất thải này, ph n và nƣớc thải có thể đƣợc xử lý b ng hầm biogas
tạo khí gas để phục vụ sinh hoạt. Do lông gia súc và lông gia cầm có thành
phần chính là keratin, rất khó ph n hủy (Gupta and Ramnani, 2006), lại chiếm
t lệ khá lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ nên mức độ ô nhi m càng
nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra cách để xử lý chất thải lông tại các lò mổ gia
súc gia cầm là rất cần thiết.
Hiện nay, chất thải chứa keratin thƣờng đƣợc xử lý b ng các phƣơng
pháp chôn và đốt, g y ô nhi m đất, mạch nƣớc ngầm và không khí (Nguy n
Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng, 2001). Trong keratin chứa những acid
amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc, ph n hữu cơ, gas sinh

học (Nguy n Thu Hiền và ctv., 2013) Tuy nhiên, phƣơng pháp vật lý hay hóa
học hiện đang đƣợc sử dụng trong các quy trình chế biến d làm phá hủy
những acid amin, tiêu thụ rất nhiều năng lƣợng và tạo ra những chất g y ô
nhi m cho môi trƣờng (Matikevičienė et al., 2009) o đó, tìm ra một phƣơng
pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng
đối với ngành chăn nuôi do vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá tr kinh
tế, lại vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm Trong những
năm gần đ y, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm b ng phƣơng pháp sinh
học rất đƣợc quan t m và chú trọng

huyên ngành Vi sinh vật h

1

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


Trên thế giới hiện có rất nhiều công trình nghiên cứu ph n giải keratin
b ng vi sinh vật và đã ph n lập đƣợc rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng
ph n giải keratin nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn (Sangali and randelli,
1999). Các phƣơng pháp chế biến bột lông vũ thủy phân b ng cách chủng vi
khuẩn nhƣ Bacillus licheniformis PWD-1 đã cải thiện đƣợc tăng trƣởng của gà
(William et al., 1991).
Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật có những điều kiện thuận lợi cho sự sinh
trƣởng và phát triển khác nhau Nếu điều kiện thay đổi bất lợi g y ảnh hƣởng
xấu đến vi sinh vật khiến cho vi sinh vật chết hoặc ngừng phát triển, còn nếu
điều kiện thuận lợi vi sinh vật sẽ sinh trƣởng và phát triển tốt (Nguy n L n
ũng và ctv., 2012) Vì vậy, khảo sát những điều kiện thuận lợi cho sự sinh

trƣởng và phát triển của những chủng vi khuẩn ph n giải keratin đã đƣợc ph n
lập có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng những chủng vi khuẩn này vào
xử lý keratin trong thực tế với hiệu quả cao nhất Điều này càng giúp việc ứng
dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn thuận lợi hơn trong việc chế biến
lông gia súc gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc gia cầm từ
đó giảm đƣợc ô nhi m môi trƣờng, n ng cao giá tr dinh dƣ ng của sản phẩm
protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với các phƣơng pháp vật lý và hóa học
hính vì vậy, việc ph n lập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi cấy ph
hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm để tận
dụng nguồn chất thải này sẽ tạo ra những sản phẩm có giá tr cao, đồng thời
góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý môi trƣờng với giá thành thấp
Ở Việt Nam, những năm gần đ y ch mới có một vài nghiên cứu về một
số chủng vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin từ chất thải lông gia cầm.
Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng (2001) đã tiến hành phân lập
đƣợc từ đất ở cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có
hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có
khả năng giải lông gà mạnh. Nguy n Huy Hoàng và ctv. (2010) cũng đã tiến
hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng
thủy ph n lông vũ từ một số v ng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam- vùng
khí hậu khá khác biệt với miền Nam Việt Nam. Những nghiên cứu này vẫn
còn đang trong giai đoạn khảo sát đặc tính các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc, chƣa thấy có công bố ứng dụng các vi sinh vật này Hơn nữa, miền Nam
Việt nam chiếm ƣu thế trên cả nƣớc về sự phát triển của chăn nuôi Điều này
kéo theo số lƣợng lông gia súc gia cầm thải ra lớn, đồng thời nhu cầu thức ăn
chăn nuôi bổ sung đạm cho vật nuôi cũng cao Xuất phát từ thực tế trên, đề tài
―Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn
nuôi‖ đƣợc tiến hành.

huyên ngành Vi sinh vật h

2

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


1 2 Mục tiêu của đề tài
Đề tài đƣợc tiến hành nh m đạt mục tiêu sau:
Tuyển chọn và đ nh danh đƣợc một số chủng vi khuẩn từ các cơ sở giết
mổ gia súc, gia cầm của v ng Đ S L có khả năng ph n hủy hiệu quả lông gia
súc, gia cầm
Thiết kế đƣợc quy trình nuôi cấy thích hợp cho một số chủng vi khuẩn
đƣợc tuyển chọn có khả năng ph n giải keratin mạnh
Ứng dụng chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn để xử lý nguồn chất thải lông
gia cầm nh m tạo thành thức ăn bổ sung protein cho ngành chăn nuôi
1.3 Nội dung nghiên cứu
Đề tài bao gồm các nội dung nghiên cứu:
Nội dung 1: Khảo sát tình trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia
súc gia cầm tại thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp
Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí phân
giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc gia cầm
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng nuôi
cấy đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm của một số
chủng vi khuẩn bản đ a đƣợc tuyển chọn
Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng một chủng vi khuẩn bản đ a đƣợc
tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho vật
nuôi.
1 4 Những đóng góp mới của đề tài
Là nghiên cứu đầu tiên ở Đ S L có tính hệ thống về vi khuẩn ph n giải

keratin chất thải lông gia súc gia cầm, bao gồm các kh u ph n lập, tuyển chọn,
đ nh danh, đánh giá khả năng ph n giải keratin, khảo sát điều kiện nuôi cấy tối
ƣu và ứng dụng vào chăn nuôi gà th t thả vƣờn
Quá trình ph n lập dựa vào cơ chế trao đổi chất đặc biệt trong quá trình
tăng trƣởng và phát triển của vi khuẩn ph n giải keratin chất thải lông, cấy
chuyền để sàng lọc và tuyển chọn ban đầu nguồn vi khuẩn mong muốn, là
phƣơng pháp mới để ph n lập vi khuẩn ph n giải keratin Sự kết hợp các
phƣơng pháp xác đ nh hoạt tính keratinase, xác đ nh khả năng ph n giải
keratin là phƣơng pháp tin cậy để tuyển chọn nguồn vi khuẩn bản đ a phân
giải tốt keratin chất thải lông Thông qua phƣơng pháp này kết hợp phƣơng
pháp đ nh danh truyền thống Bergey và phƣơng pháp sinh học ph n tử, đã

huyên ngành Vi sinh vật h

3

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


ph n lập, tuyển chọn và đ nh danh đƣợc 26/429 chủng vi khuẩn bản đ a có khả
năng ph n giải keratin mạnh làm cơ sở cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn
có hiệu suất ph n hủy mạnh chất thải lông gia súc gia cầm để ứng dụng xử lý
chất thải lông từ các cơ sở giết mổ gia súc gia cầm
Góp phần làm phong phú và bổ sung mới bộ sƣu tập vi khuẩn có khả
năng ph n giải keratin mạnh vào bộ giống Vi sinh vật hữu ích của Viện
Nghiên cứu và Phát triển NSH để phục vụ sản xuất
Xác đ nh các môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 bản đ a có khả

năng ph n hủy chất thải lông mạnh ở v ng Đ S L.
ƣớc đầu x y dựng các thông số ph hợp cho quy trình ứng dụng đối với
chủng Bacillus megaterium K79 có khả năng ph n hủy lông gia cầm
mạnh giúp xử lý và tận dụng phế phẩm lông gia cầm thành thức ăn bổ
sung protein cho vật nuôi ở dạng bột lông sinh học an toàn vi sinh với giá tr
dinh dƣ ng và khả năng tiêu hóa cao và đáp ứng đƣợc yêu cầu th n thiện với
môi trƣờng tốt hơn so với bột lông Meko (sản phẩm thƣơng mại).
Ngoài ra, các thông tin về phƣơng pháp ph n lập, kết quả khảo sát và
tiềm năng ứng dụng của tập đoàn vi khuẩn ph n giải keratin mạnh có thể bổ
sung vào các giáo trình và phục vụ giảng dạy cho chuyên ngành vi sinh vật và
công nghệ sinh học

huyên ngành Vi sinh vật h

4

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


CHƢƠNG 2. TỔNG QU N TÀI LI U
2.1 Sơ lƣợc về chất thải lông
Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông vũ đƣợc thải ra từ
ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm, g y ra vấn đề môi trƣờng đồng thời làm
lãng phí nguồn protein (Gousterova et al., 2005). Lông chứa khoảng 90%
protein, trong đó thành phần chính là keratin. Keratin là thành phần cấu tạo
chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da,... (Onifade et al., 1998).
T y thuộc vào giống vật nuôi và độ tuổi mà t lệ lông trên trọng lƣợng cơ thể
có sự khác nhau Đối với gia súc lớn nhƣ heo, lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng

lƣợng cơ thể, đối với gà trƣởng thành t lệ này đạt từ 5 – 7%. Theo kết quả
nghiên cứu của Nguy n Nhựt Xu n ung và ctv. (2015), lông chiếm tỷ lệ từ
4,6 – 5,2% khối lƣợng sống của gà th t công nghiệp ở tại lò mổ Thuận Trƣờng
(Đồng Nai) Onifade et al. (1998) cũng cho biết lông gia cầm chiếm tỷ lệ từ 57% tổng khối lƣợng sống của gà
Với thành phần chủ yếu là keratin (chiếm hơn 92%) khá tinh khiết đồng
thời đƣợc thải ra với một số lƣợng lớn (Manczinger et al., 2003), nên chất thải
lông đƣợc xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn
protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi Để có thể
trở thành thức ăn chăn nuôi, chất thải lông cần trải qua nhiều giai đoạn xử lý
b ng các phƣơng pháp vật lý và hóa học khác nhau Tại các cơ sở chế biến
hiện đại, lông vũ đƣợc nấu dƣới áp suất cao, sử dụng hơi nƣớc trực tiếp thủy
ph n một phần protein, phá hủy các cầu nối bên trong cấu trúc keratin Sau đó,
bột lông vũ đã thủy ph n sẽ đƣợc xử lý b ng men pepsin tạo ra một sản phẩm
có tính ngon miệng cao và d tiêu hóa đối với nhiều loài vật nuôi Đặc biệt đ y
là nguồn dồi dào các acid amin nhƣ leucin, arginine, cystein Tuy nhiên những
quá trình này đòi hỏi rất nhiều năng lƣợng và chi phí đầu tƣ sản xuất cũng rất
lớn ên cạnh đó, quá trình gia nhiệt và xử lý hóa học cũng làm phá hủy một
số acid amin nhạy cảm bởi nhiệt có trong thành phần lông nhƣ methionine,
lysine, tryptophan (Papadoulos and Ketelaars, 1986) và tạo ra một số acid
amin nhƣ lanthionine và lysinoalanine làm giảm đáng kể giá tr dinh dƣ ng
của sản phẩm tạo thành
ông nghệ vi sinh vật phát triển đã mở ra một hƣớng đi mới, ph n hủy
chất thải lông b ng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của vi khuẩn nh m tạo
ra một nguồn protein có t lệ dinh dƣ ng c n b ng hơn, cải thiện giá tr dinh
dƣ ng của sản phẩm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế các nguồn
protein đắt tiền khác, và đồng thời còn giúp hỗ trợ xử lý các nguồn rác thải có
nhiều cơ chất chứa keratin để giải quyết vấn đề ô nhi m môi trƣờng
huyên ngành Vi sinh vật h

5

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


2.2 Sơ lƣợc về keratin

(a) Mặt cạnh, xoay góc 90o

-keratin

(b) Mặt chụp nhìn từ trên

-keratin
Hình 2.1: ấu trúc keratin

(Chemical Education Digital Library, 2010)
Keratin là một dạng protein chủ yếu trong các tế bào biểu mô của động
vật có xƣơng sống và là thành phần chính cấu tạo nên biểu bì, tóc, móng, lông,
sừng… Keratin có cấu trúc dạng sợi, các chuỗi protein đƣợc cuộn chặt, gấp
nếp thành cấu trúc 3 chiều. ấu trúc cơ bản bậc hai của keratin đƣợc ph n
thành hai dạng α-helix (ở tóc) và β-sheets (ở lông vũ) ác sợi keratin ở cả hai
dạng α-helix và β-sheet xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn đ nh
của sợi (Akhtar and Edwards, 1997). α-keratin có trong tóc (kể cả lông cừu),
sừng, móng tay, móng ch n, móng và móng guốc của động vật có vú ấu tạo
là các sợi đơn protein liên kết với nhau b ng liên kết hydro β-keratin có trong
móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ chelonians (ba ba, r a…) và
trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím, đƣợc hình thành chủ yếu trong
các phiến beta Không giống nhƣ các chuỗi xoắn α, các phiến β đƣợc nối với

nhau b ng các cầu nối disulfide và các chuỗi bên trong đƣợc ép khá gần nhau

huyên ngành Vi sinh vật h

6

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


Keratin cũng đƣợc ph n loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm
lƣợng lƣu huỳnh Keratin cứng đƣợc tìm thấy ở các phần phụ nhƣ lông vũ, tóc,
móng guốc,… với hàm lƣợng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài
Trong khi đó, keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lƣợng cầu nối disulfide
thấp và mềm d o hơn (Voet and Voet, 1995) Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ
liên kết hidro, tƣơng tác kỵ nƣớc và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền
vững của keratin và kháng lại sự ph n giải bởi các protease thông thƣờng nhƣ
trypsin, pepsin hay papain Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng
ph n giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade
et al., 1998).
T nh h nh h i thá và sử ụng er tin ở Việt N m
Ở Việt Nam, cũng nhƣ trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chƣa đƣợc
khai thác và sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các
lò giết mổ đều chƣa đƣợc khai thác và xử lý hiệu quả húng thƣờng đƣợc tập
trung lại thành các đống lớn; một số đƣợc chôn lấp, một số b đốt, còn lại chƣa
đƣợc xử lý, g y ô nhi m nghiêm trọng môi trƣờng xung quanh các lò giết mổ
Hiện nay, ở nƣớc ta cũng chƣa có nhiều nghiên cứu nh m sử dụng sản phẩm
phân hủy sinh học lông gia cầm, gia súc làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn
nuôi; vì vậy hầu nhƣ chƣa có ứng dụng nào trong thực ti n nh m xử lý theo

hƣớng này
2.3 Các phƣơng pháp ph n giải keratin
2.3.1 Phƣơng pháp lý hoá
Keratin có thể đƣợc phân giải bởi các phƣơng pháp lý hoá nhƣ thủy phân
trong môi trƣờng acid, môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao Nghiên cứu
của raper (1944) là nghiên cứu đầu tiên về việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá
tr dinh dƣ ng từ thức ăn nhờ ph n hủy lông gia cầm Kể từ đó, nhiều nghiên
cứu đã đƣợc thực hiện để bổ sung thông tin nh m n ng cao giá tr dinh dƣ ng
từ thức ăn do lông vũ thủy phân (Moritz et al., 2001).
Điều kiện chế biến có ảnh hƣởng r rệt đến giá tr dinh dƣ ng của thức
ăn từ lông gia cầm đƣợc thủy ph n Ở áp suất thấp và thời gian thủy phân dài
có thể n ng giá tr dinh dƣ ng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử
dụng thức ăn đó Thông thƣờng, lông đƣợc thủy ph n b ng cách đun trong
một nồi áp lực trong 30 phút đến 60 phút Hiệu quả thủy ph n có thể đạt 80%
đến 85% Tuy nhiên, phƣơng pháp này không những phá hủy một số acid
amin (methionine, lysine, histidine), còn sản sinh một số chất độc, nên khó sử
dụng sản phẩm ph n hủy theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận

huyên ngành Vi sinh vật h

7

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


dụng nguồn protein cho các mục đích khác ên cạnh đó, ph n hủy lông gia
cầm theo phƣơng pháp này còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng Nhiều nơi,
keratin thô đƣợc xử lý b ng cách đốt Phƣơng pháp này tạo ra một số khí g y

ô nhi m môi trƣờng đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin (Nguy n Đình
Quyến và ctv., 2001)
2.3.2 Phƣơng pháp sinh học
Lông gia cầm đƣợc ph n hủy nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinase
là một phƣơng pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục
đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp lý hóa Ngƣời ta đã tiến hành ph n
lập đựợc các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng
có hoạt tính keratinase cao đƣợc sử dụng trong việc ph n hủy lông gia cầm và
sử dụng sản phẩm ph n hủy đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi Các
vi sinh vật đƣợc ph n lập là loài chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn nhƣ:
Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus
spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp ,
Streptomyces
pactum,
S.albs,
S.thermoviolaceus,
S.fradiae,
S.thermonitrificans,
Flavobacterium
pennavorans,
Bacillus
sp.,
Stenotrophomonas sp., Bacillus licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp.
Những vi sinh vật này tiết keratinase ngoại bào khi môi trƣờng có keratin
và ph n giải keratin thành các axit amin hoặc các peptid ngắn, những chất này
đƣợc vi sinh vật sử dụng làm nguồn carbon và nitơ (Nguy n Đình Quyến và
ctv., 2001).
2.4 Keratinase
Tuy keratin là một dạng protein khó b ph n giải, nhƣng thực tế ngoài tự
nhiên các dạng cơ chất chứa keratin nhƣ lông, móng, sừng,… vẫn b ph n hủy,

mặc d trong thời gian rất l u Điều này có đƣợc là do hoạt động của các vi
sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng sinh ra keratinase
Keratinase là loại enzyme ngoại bào. Keratinase có khả năng ph n hủy
cơ chất chứa keratin trong tự nhiên và đƣợc ph n loại là protease với mã số là
EC 3.4.21/24/99.11 (Gupta and Rammani, 2006). Trong nghiên cứu của
Bressollier et al. (1999) và Odetallah et al.(2003), keratinase cũng đƣợc đ nh
nghĩa là serine protease do nó tƣơng đồng trình tự 97% với protease kiềm và
nó cũng b ức chế bởi các chất ức chế tƣơng tự chất ức chế serine protein Hầu
hết các keratinase đƣợc mô tả đến nay đều thuộc loại serine protease và ch có
một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính ph n giải keratin
ác

huyên ngành Vi sinh vật h

8

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


metalloprotease này thƣờng đƣợc tìm thấy ở các vi khuẩn Gram m ( randelli,
2007).
ác keratinase từ vi khuẩn thƣờng đƣợc sản xuất dƣới điều kiện chìm và
lắc, ngoại trừ các chủng vi khuẩn ch u nhiệt (Nam GW. et al., 2002; Rissen
and Antranikian, 2001) thì lên men chìm tĩnh Tuy nhiên, chƣa có bài báo nào
nói về lên men rắn cho việc sản xuất keratinase
Keratinase đƣợc tách chiết và tinh sạch nhờ phối hợp các phƣơng pháp:
siêu lọc, kết tủa b ng amoni sulphat, kết tủa b ng các dung môi lọc gel, sắc ký
tƣơng tác kỵ nƣớc và sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực EAE

(Diethylaminoethyl cellulose). Phƣơng pháp áp dụng ở mức độ công nghiệp
hiện nay là lọc ph n đoạn, sau đó keratinase đƣợc tinh sạch qua các giai đoạn
sắc ký ái lực, sắc ký lọc gel
ng phƣơng pháp này, mức độ tinh sạch
keratinase từ chủng Bacillus subtilis MT
9102 tăng lên 45,9 lần so với ban
đầu, cho hoạt độ riêng đạt 4181 U/mg protein, với hiệu suất thu đƣợc 27,60%
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion thƣờng đƣợc sử dụng để tinh sạch keratinase
Sau quá trình sắc ký trao đổi ion, ngƣời ta có thể áp dụng các kỹ thuật khác
nhƣ lọc gel, sắc ký ái lực heparin để n ng cao độ tinh sạch (Phạm Th Tr n
Châu và ctv., 2009; Đặng Th Thu và ctv., 2004).
Trọng lƣợng ph n tử của keratinase giới hạn từ 18 đến 200 k a tùy theo
nguồn vi sinh vật Với trọng lƣợng ph n tử thấp nhất là 18 k a đối với
keratinase từ S. albidoflavus SK 1–02 (Chitte et al., 1999), và trọng lƣợng
ph n tử cao nhất 200 k a từ keratinase của Kocuria rosea và F. islandicum
(Nam G.W. et al., 2002; Bernal et al., 2006). Tuy nhiên, trọng lƣợng ph n tử
có thể cao đến 440kDa (Kim et al., 2004) nếu kể cả nguồn keratinase từ nấm
g y bệnh
Nhiệt độ tối ƣu của keratinase dao động từ 30oC đến 80°C. Tuy nhiên,
keratinase từ Chrysosporium keratinophilum (Dozie et al. 1994) và
Fervidobacterium islandicum AW -1 ch u nhiệt (Nam G.W. et al., 2002) có
nhiệt độ tối ƣu đặc biệt cao là 90o và 100° , tƣơng ứng với một chu kỳ bán
rã của 30 phút và 90 phút Tổng quan tài liệu về độ pH và nhiệt độ cho thấy
keratinase nói chung hoạt động bền vững với pH từ 5,0 đến 13,0 (Dozie et
al.,1994.; Böckle et al. 1995; Bressollier et al., 1999; Nam G.W et al., 2002;
Farag and Hassan, 2004) Giá tr hoạt độ enzyme thấp nhất ở pH = 4,0 với
keratinase từ S. pactum DSM40530 (Böckle et al., 1995), và giá tr hoạt độ
enzyme cao nhất ở pH = 13,0 đối với keratinase từ Bacillus halodurans AH101 (Takami et al. 1999) Khả năng ch u nhiệt trong 90 phút ở 100o đối với
keratinase từ F. islandicum AW-1 (Nam G.W et al., 2002) và 6 giờ ở 80° đối

huyên ngành Vi sinh vật h

9

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h


với keratinase nguồn gốc từ Thermoanaerobacter keratinophilus (Rissen and
Antranikian 2001).
ác ion kim loại nhƣ Ca2+, Mg2+ và Mn2+ sẽ kích hoạt keratinase
(Mukhopadhyay and Chandra, 1990; Rissen and Antranikian, 2001; Nam G.W
et al., 2002; Riffel et al., 2003). Ngƣợc lại, hoạt động keratinase b ức chế bởi
quá trình chuyển hóa và các ion kim loại nặng u2+ (Nam G.W et al., 2002.;
Riffel et al., 2003; Thys et al., 2004), Hg2+ (Riffel et al., 2003; Thys et al.,
2004) , Ag+ (Nam G.W et al., 2002; Mukhopadhyay and Chandra, 1990), Pb +
(Mukhopadhyay and Chandra, 1990; Farag and Hassan, 2004), Zn2+ (Dozie et
al., 1994; Thys et al., 2004) , Ba2+ và Co+ ( Dozie et al., 1994); trong khi Fe2+
làm tăng thêm khả năng ph n giải keratin của C. keratinophilum (Dozie et al.,
1994). Keratinase có thể b ức chế, kích hoạt hoặc bền vững trong chất tẩy rửa
và dung môi Keratinase thƣờng bền vững trong sự hiện diện của dung môi
hữu cơ (Nam G.W et al., 2002; Riffel et al., 2003; Mitsuiki et al., 2004),
DMSO (Böckle et al., 1995; Mitsuiki et al., 2004) và Triton X-100 (Riffel et
al., 2003; Mitsuiki et al., 2004).

Hình 2.2: ấu trúc keratinase
(Kim et al., 2004)
Keratinase có tiềm năng to lớn trong việc xử lý chất thải trong ngành
công nghiệp chế biến gia cầm, ph n bón và thuộc da Ứng dụng của keratinase

còn có thể đƣợc mở rộng trong các ngành công nghiệp chất tẩy và dệt. Chúng
đƣợc ứng dụng trong việc làm sạch len và sợi Trong ngành công nghiệp dệt,
tiềm năng làm sạch lông của enzyme này dẫn đến sự phát triển của công nghệ
làm sạch lông an toàn, th n thiện môi trƣờng và những sản phẩm chăm sóc vệ
sinh cá nhân (Gupta et al., 2006) Keratinase còn đƣợc sử dụng trong sản xuất

huyên ngành Vi sinh vật h

10

Viện Nghiên ứu và Phát triển

ng nghệ Sinh h