Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiệp xử lý vải bông

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE
TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG
NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG

Hà Nội - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả
cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận

văn là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2015

Tác giả

Lê Trọng Tài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Trường, là người thầy
đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến
thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn
này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là
Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành khóa học và bản luận văn.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp
tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người
luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu.
Tác giả

Lê Trọng Tài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................................iii
DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT ...................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................ 3
1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis ................................................................................................. 3
1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis .............................................................................................. 4
1.3. Pectin ................................................................................................................................... 5
1.4. Pectinase .............................................................................................................................. 6
1.4.1. Khái niệm pectinase.......................................................................................................... 6
1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase .................................................................... 6
1.5. Pectinase của Bacillus subtilis ........................................................................................... 10
1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm ............................................................................................ 11
1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên .............................................................................................. 11
1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông ......................................... 12
1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy ............................................................. 13
1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà . 13
1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam .............................. 13

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................. 14
2.1. Vật liệu ............................................................................................................................. 14
2.1.1. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................................ 14
2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................................... 15
2.1.3. Các vector sử dụng ......................................................................................................... 15
2.1.4. Trình tự mồi .................................................................................................................... 15
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy .......................................................................................................... 16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................... 17
2.3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa ......... 17
2.3.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên ................................... 17
2.3.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp.................................................. 17
2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].................................................... 17
2.3.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] ........ 19
2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iii


2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 22
2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli ................................................................................. 23
2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis ........................................................................... 23
2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử ...................................................... 23
2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện ........................................ 26
2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtilis 168 .............................................................. 26
2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) ........................................ 27
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................... 28
3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao ........... 28
3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch ................................... 28
3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các

chủng nghiên cứu...................................................................................................................... 29
3.1.3. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 31
3.2. Tách dòng gen pectinase trong E. coli .............................................................................. 32
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B. subtilis......................................................... 32
3.2.2. Nhân gen pectinase bằng PCR ....................................................................................... 33
3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E. coli .................................................................................. 34
3.2.4. Giải trình tự các gen pectinase....................................................................................... 36
3.3. Tạo chủng B. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase .......................................................... 38
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. subtilis ............................................... 38
3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis ........................................................... 43
3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng .................... 44
3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng
tự nhiên ..................................................................................................................................... 47
3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng
tự nhiên ..................................................................................................................................... 47
3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự
nhiên ......................................................................................................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ...................................................................................................
49
̣
4.1. Kết luận .............................................................................................................................. 49
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 50
Tài liệu tiếng Việt ...................................................................................................................... 50
Tài liệu tiếng Anh ...................................................................................................................... 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iv

DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT
a.a

: Amino acid

APS

: Ammonium persulfate

B. subtilis

: Bacillus subtilis

BMM

: Môi trƣờng khoáng chất Belisky

BSA

: Bovine serum albumin

DEAE

: Diethylethanolamine

DNA

: Deoxyribonucleic axit

DNSA

: 3,5-Dinitrosalicylic axit

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic axit

HTAB

: Hecxadecyl trimethyl

trimethyl

trimethyl

trimethyl

ammonium bromide
ISO

: International standards organization

kDa

: Kilo Dalton

LB

: Luria bertani

M

: Mole

OD

: Optical density

PCR

: Polymerase chain reaction

pel

: Gen pectinase

Pel

: Enzyme pectinase

RR

: Rhuthenium red

rPel

: Pectinase tái tổ hợp

SDS

: Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

: Tetramethylethylenediamine

U

: Unit

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme ............................................................................. 7
Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông ............................................................................. 11
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen ............................................................................... 23
Bảng 2.2. Chƣơng trình nhân gen bằng PCR ........................................................................... 23
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII ............................................... 24

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII .................................................... 24
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter ..................................................... 24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel ................................................. 24
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch.
.................................................................................................................................................. 28
Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu ..... 30
Bảng 3.3. Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc ......................................................... 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin ........................................................................ 6
Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases ............................................................. 8
Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase ........................ 8
Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase.............................................................. 9
Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi
bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin. ....................................... 11
Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein ....................................................................................... 18
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit.. 19
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn glucose ............................................................................................... 20
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase ........................................................... 21
Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2%
pectin. ....................................................................................................................................... 29
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng
nghiên cứu ................................................................................................................................ 31
Hình 3.3. Điện di DNA tổng số của các chủng B. subtilis. ...................................................... 33
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase ................................................. 34

Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc
LB, 100 µg/ml ampicillin ......................................................................................................... 34
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII .......................................................... 35
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII ......................................................... 35
Hình 3.8. So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt
Nam với Pel từ B. subtilis 168. ................................................................................................. 37
Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. subtilis. ................................................ 39
Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII. ................................................... 40
Hình 3.11. Thu nhận pel từ pJET/pel.. ..................................................................................... 40
Hình 3.12. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ...................................................... 41
Hình 3.13. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ................................................................ 42
Hình 3.14. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel. .......................................... 42
Hình 3.15. Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. ........................... 44
Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa
copy trên môi trƣờng LB+Kan.. ............................................................................................... 45
Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B.
subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy.. ............................................................................................. 45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vii


Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B. subtilis
168 trên cơ chất pectin axit....................................................................................................... 46
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme........................................................ 47
Hình 3.20. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme ................................................................ 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

viii

MỞ ĐẦU
Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí
quan trọng trong nền kinh tế quốc. Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ
theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm
2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và
đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong
nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm
2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng
xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng
công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải
bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc
tế.
Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không
phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải
cellulose. Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải
cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến
giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc
phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công
nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do
tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng
và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây
các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme
pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm
độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nƣớc của vải
bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá trń h t ẩy
trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt hơn.
Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông
mới phát triển khoảng 10 năm gần đây. Nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan

tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1


thời gian xử lý, tiết kiệm năng lƣợng và giảm thiểu tác hại môi trƣờng. Hiện nay
một số pectinase thƣơng mại đã đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để sử dụng
trong công nghiệp dệt nhƣ Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng
Novozyme), alkaline pectinase (Trung Quốc), Cottonase (Mỹ).
Ở nƣớc ta, công nghệ xử lý sợi bông hiện nay vẫn sử dụng chất kiềm, đây
là lý do tại sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lƣợng cao và ảnh
hƣởng lớn đến môi trƣờng. Chính vì vậy việc sử dụng enzyme pectinase trong
xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm sẽ giúp cho bảo vệ môi trƣờng, làm cho
vải bông có chất lƣợng cao và giúp cho giá thành sản xuất giảm. Từ đó nâng cao
sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trƣờng.
Hiện nay ở nƣớc ta chƣa có cơ sở nào sản xuất đƣợc pectinase ƣa kiềm
ứng dụng trong công nghiệp. Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản
xuất enzyme pectinase ƣa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành sản xuất vải
bông là điều cần thiết, giúp cho ngành công nghiệp dệt nƣớc ta chủ động đƣợc
nguồn enzyme phục vụ cho việc xử lý vải bông, nâng cao chất lƣợng vải bông
để cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng Quốc tế. Đề tài “Nghiên cứu biểu hiện cao
gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiê ̣p xử lý
vải bông” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase sản
lƣợng cao để ứng dụng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

TỔNG QUAN TÀ I LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis (B. subtilis) là vi khuẩn gram dƣơng, thuộc họ Bacillaceae,
chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhƣng phổ biến nhất là trong đất.
Tế bào B. subtilis có Hình que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong
khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép sinh vật chịu đƣợc những điều kiện khắc nghiệt
[35], [43] . Tế bào vi khuẩn B. subtilis đƣợc bao bọc bởi thành vững chắc. Nó bao
gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của các loại đƣờng và amino
acid. Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trƣờng và tế bào vi khuẩn. Nó
còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu đƣợc áp lực cao của môi
trƣờng nội bào [36].
B. subtilis đƣợc tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có
ít hơn trong nƣớc hay không khí. B. subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ
trung bình. Nhiệt độ tối ƣu là 25-35oC. B. subtilis là sinh vật hiếu khí sống ký
sinh có bào tử có thể sống sót ở điều kiện nhiệt độ cao, thƣờng thấy khi nấu ăn.
Hệ gen B. subtilis 168 đã đƣợc giải mã thành công và công bố vào năm
1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng. Tổng kích thƣớc hệ
gen là 4,2 Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein. Sự giải mã
thành công hệ gen B. subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên
cứu về proteome và metabolome của vi khuẩn này.
B. subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi
sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao
trùm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công
nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y dƣợc học, trong các ngành công
nghiệp và trong xử lí môi trƣờng. Chính vì lẽ đó nên ngày càng nhiều các nghiên
cứu ứng dụng của chúng đối với đời sống con ngƣời. B. subtilis là vi khuẩn có
khả năng tiết một số enzyme quan trọng nhƣ protease, lipase, xylanase,
pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3


có nhiều ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nƣớc ép trái cây, công nghiệp xử
lý giấy và đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô.
1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
B. subtilis là vi khuẩn đã đƣợc nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử
(chỉ sau E. coli). Chúng có nhiều đặc điểm quí nhƣ: là vi khuẩn không gây bệnh,
khả năng sinh trƣởng rất mạnh, môi trƣờng lên men đơn giản, rẻ và dễ ứng dụng
trong công nghiệp. Hệ tiết của B. subtilis đƣợc biết là một trong những hệ tiết tốt
nhất để ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp. Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ
biểu hiện B. subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp.
Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B.
subtilis. Việc sử dụng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B.
subilis thông thƣờng không hiệu quả bằng sử dụng promoter của B. subtilis do
RNA-polymerase holoenzyme của chúng không bám hiệu quả vào promoter
ngoại lai, ngoại trừ một vài trƣờng hợp. Tín hiệu tiết (signal peptide) cũng là yếu
tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai. Wang và Doi (1989)
đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của gen ngoại
lai trong B. subtilis và những yếu tố cần thiết để vƣợt qua rào cản của sự biểu
hiện gen [49]. Việc sử dụng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện
gen ngoại lai cũng cần đƣợc cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ƣu
điểm và nhƣợc điểm. Vector đa copy thông thƣờng có khả năng biểu hiện mạnh
hơn vector tích hợp do có lƣợng bản sao nhiều hơn trong một tế bào chủ nhƣng
lại có tính bền kém hơn. Hệ biểu hiện đa copy luôn luôn cần duy trì áp lực chọn
lọc (nhƣ bổ sung kháng sinh vào môi trƣờng nuôi cấy). Ngƣợc lại vector tích
hợp do đƣợc tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên có
tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen.
Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần

lớn là vi khuẩn thuộc họ Bacillus. Lƣợng enzyme tái tổ hợp trong thƣơng mại
hiện nay đƣợc sản xuất từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37]. Tuy nhiên, hệ
biểu hiện B. subtilis cũng có những nhƣợc điểm nhƣ khi biểu hiện gen ngoại lai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

4


trong chúng thì một hiện tƣợng hay gặp là sự tƣơng tác bất lợi của sản phẩm
biểu hiện với chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm
chí nhiều trƣờng hợp còn không thể biểu hiện đƣợc. Tuy nhiên, nếu sử dụng gen
biểu hiện là gen có nguồn gốc từ chúng thì khả năng ảnh hƣởng bất lợi trong khi
biểu hiện là hoàn toàn đƣợc loại bỏ. Hƣớng sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách
này là một trong những hƣớng sản xuất mang lại hiệu quả biểu hiện cao. Hƣớng
biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ hợp trong B.
subtilis ở một số nghiên cứu trong nƣớc. [4], [5].
1.3. Pectin
Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào
thực

vật

bao

gồm:

pectin

(polymethylgalacturonate),

pectin

axit

(polygalacturonate) và các oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong
nƣớc và có ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị ester hóa với
methanol. Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài
đơn phân galacturonate. Oligo methylgalacturonate cũng là chất đa phân tử gồm
hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa ở vị trí
C-6 [50].
Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi
với nhau. Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và
rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo
nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan.
Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin. Chuỗi sơ cấp
gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết
β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có
thành phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thƣờng là các polymer đồng
nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [50].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

5


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin
Cấu trúc hóa học đặc trƣng của pectin đƣợc thể hiện ở Hình 1.1. Các đơn
vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside. Một số
D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyleste hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl, một số khác bị biến đổi thành
dạng COO- hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH. Mức độ methyl hóa và acetyl

hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38].
1.4. Pectinase
1.4.1. Khái niệm pectinase
Các enzyme xúc tác phân cắt pectin đƣợc gọi chung là pectinase. Enzyme
pectinase đƣợc tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn, nấm, nấm
men, côn trùng, giun tròn, nguyên sinh động vật và thực vật. Trong đó vi khuẩn
B. subtilis là một trong nhóm vi khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase.
Pectinase đƣợc sử dụng nhiều trong một số ngành sản xuất nhƣ: sản xuất
rƣợu vang, nƣớc ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải. Việc ứng dụng
pectinase kiềm trong công nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm
gần đây nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng
trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn thời gian xử lí, tiết kiệm năng
lƣợng và giảm thải tác hại môi trƣờng. Hiện nay một số pectinase thƣơng mại đã
đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để ứng dụng trong công nghiệp dệt.
1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà
pectinase đƣợc phân chia thành các enzyme khác nhau. Pectinase đƣợc phân loại
thành 3 nhóm chính, đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

6


Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme [50]
Tên enzyme
Esterase
- Pectin methylesterase
( pectin esterase)
- Pectin acetylesterase
Polygalacturonase

- Protopectinase
- Endopolygalacturonases
- Exopolygalacturonases
- Oligogalacturonate
hydrolases
- 4:5 unsaturated oligogalacturonate hydrolase

EC No.

Cơ chất

Sản phẩm

Cơ
chế
xúc tác

3.1.1.11

Pectin

Pectin axit +
Methanol

Thuỷ phân

3.1.1.-

Pectin

3.2.1.15
3.2.1.82

- Endopolymethylgalacturonase
Lyase
- Endopolygalacturonate
lyases (endopectinase)
- Exopolygalacturonate
lyase (exopectinase)

Protopectin
Pectin axit
Pectin axit
Trigalactoronate
4:5
(galacturonate)n

Pectin
Oligogalacturonates Thuỷ phân
Monogalacturonate Thuỷ phân
Monogalacturonate Thuỷ phân
Thuỷ phân
Unsaturated
monogalaturonate
Thuỷ phân
và saturate (n-1)

Pectin

Methyloligogalacturonates

4.2.2.2

Pectin axit

4.2.2.9

Pectin axit

- Oligogalacturonate lyase

4.2.2.6

- Endopolymethylgalactu
ronate lyase (endopetin
lyases)

4.2.2.10

Chƣa xác
định

Unsaturate
d
digalacturonate
Pectin

Unsaturated
oligogalacturonates
Unsaturated

digalacturonates

Thuỷ phân

Chuyển
liên kết
Chuyển
liên kết

Unsaturated
monogalacturonates Chuyển
liên kết
Unsaturated
methyloligogalacturonates

Chuyển
liên kết

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân
cắt chuyển liên kết (trans –element). Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của
nƣớc, ngƣợc lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nƣớc
và tạo ra sản phẩm có một liên kết đôi (Hình 1.4).
Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm
methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đƣờng thủy phân
(Hình 1.2). Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là pectin axit, methanol và H+ từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

7

sự ion hóa các nhóm carboxyl. H+ giải phóng ra từ nhóm carboxyl mới Hình
thành sẽ làm giảm độ pH của môi trƣờng phản ứng. Do vậy, có thể tiến hành đo
pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase.

methylesterases
Polymethylgalacturonates +nH2O 
 oligogalacturonates galacturonate

Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases
Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl
khỏi nhóm hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate. Searle-van Leeuwen,
Vincken và cộng sự (1996) lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus
niger [40]. Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin
acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [41]. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế.

endopolygalacturonase
Polygalacturonates+ nH 2O 
oligogalacturonates galacturonate

exopolygalacturonase
  polygalactoronaten1  galacturonate
 Polygalacturonaten + nH2O 

Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase

Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC
3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3).
Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8


endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt
tính của hai enzyme này có thể đƣợc đo bằng cách xác định mức độ Hình thành
nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate.
Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate
ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [6], [16]. Phản ứng đƣợc xúc tác bởi
sơ đồ sau:
Endopolymethylgalacturonase
 Oligomethylgalacturonates
 Polymethylgalacturonaten +nH2O 

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể đƣợc đo bằng
cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid.
Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là
pectinase. Enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy ở vi sinh vật, pH tối ƣu trong khoảng
8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác. Để hoạt động
chúng cần sự có mặt của Ca2+ và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế
trans tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4).
Phƣơng pháp tốt nhất để xác định hoạt tính enzyme này là phát hiện liên kết đôi
trên máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm [28]. Ngoài ra cũng có thể xác định
hoạt tính bằng phƣơng pháp đƣờng khử với 3,5-dinitrosalicylate [10]. Phản ứng
xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase nhƣ sau:
Endopolygalacturonate lyase
Polygalacturonate 
 4: 5 unsaturated oligogalacturonates

Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase

Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) đƣợc phát hiện chỉ ở một số
loài vi khuẩn nhƣ Clostridium multifermentan; Erwinia aroideae; Erwinia
disolvens. Cơ chất thích hợp không phải polymethylgalacturonate mà là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9


polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no. Độ pH
tối ƣu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính của
exopolygalacturonate lyase có thể đƣợc xác định giống với cách tiến hành đối
với

endopolygalacturonate

lyase.

Phản

ứng

xúc

tác

bởi

enzyme

exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau:

Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong
phân tử pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates
[6], [16]. Phản ứng xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase nhƣ sau:

Hoạt tính của enzyme này có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đƣờng
khử [10], [42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bƣớc
sóng 232 nm [28].
1.5. Pectinase của Bacillus subtilis
Pectinase từ B. subtilis đã đƣợc Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất
và biểu hiện trong E. coli từ những năm 90 của thế kỷ trƣớc [31], [30]. Enzyme
này xúc tác phản ứng phân hủy pectin axit ở pH và nhiệt độ tối ƣu là 8,4 và 42
o

C. Trọng lƣợng phân tử protein khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid,

trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu tiết. Cũng nhƣ các pectinase từ vi
sinh vật khác, pectinase của B. subtilis cần bổ sung Ca2+ vào phản ứng xúc tác.
Pectinase của B. subtilis có 3 vị trí bám của Ca2+ là Asp-184, Asp-223 và Asp227 do đó phản ứng xúc tác của chúng không thể thiếu Ca2+ [32].
Các chủng B. subtilis hiện có ở Việt Nam thông thƣờng sẽ có gen pel này,
các biến chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình
tự nucleotide đã biết của chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng
PCR một cách dễ dàng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

10


1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm
1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên

Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong
lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.
Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và
lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp. Hàm lƣợng cellulose trong sợi bông chiếm tới
95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose). Các chất
không phải cellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose
(hemicellulose), protein và chất sáp dính (waxe) [9], [39].
Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]
Thành phần sợi bông
- Cellulose
- Protein
- Pectin
- Sáp
- Tro
- Hemicellulose (xylan...)
- Các chất khác (khoáng...)

Trọng lƣợng khô (%)
88-96
1,1 – 1,9
0,7-1,2
0,4 – 1.0
0,7-1,6
0,5 – 1.0

Chất không phải cellulose chiếm phần lớn trong lớp thứ cấp vì vậy quá
trình xử lý sợi bông chủ yếu là loại bỏ lớp thứ cấp. Pectin trong sợi bông chiếm
khoảng 0,4-1,2%, chúng có vai trò nhƣ chất kết dính liên kết cellulose và chất
không phải cellulose (Hình 1.5). Vì vậy việc loại bỏ pectin sẽ làm cho việc loại

bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông dễ dàng hơn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

11


1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme đƣợc gọi là “BioScouring” là
công nghệ sử dụng enzyme pectinase kiềm thay thế xút trong khâu nấu kiềm đã
đƣợc nghiên cứu và triển khai trong sản xuất và đã thu đƣợc kết quả tốt ở nhiều
nơi. Tháng tƣ năm 1999, hãng Novozymes (Đan Mạch) đã đƣa chế phẩm
pectinase kiềm ra thị trƣờng có tên thƣơng mại BioPrep 3000L. Sau đó ít lâu,
hãng Bayer (Đức) có sản phẩm enzyme pectinase kiềm là Baylase EVO. Từ dó
công nghệ “BioScouring” sử dụng enzyme pectinase kiềm xử lý vải bông ra đời.
Công nghệ “BioScouring” với các sản phẩm chứa pectinase kiềm đã đƣợc nhiều
nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu cho thấy có hiệu quả tốt, có thể thay thế
xút để loại pectin trong quá trình nấu tẩy [8], [12], [15], [19], [26]. Pectin trong
sợi bông có vai trò nhƣ chất kết dính liên kết cellulose và chất không phải
cellulose. Sử dụng enzyme pectinase kiềm không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc
cellulose của sợi vải, do đó tránh tổn hại sợi [22], [29], [48]. Klug-Santner và
cộng sự đã chỉ ra pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã loại 80% pectin của sợi
bông [22]. Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc kết hợp
pectinase kiềm với một số enzyme khác nhƣ: lipase, protease, xylanase sẽ giúp
hỗ trợ loại bỏ các chất không phải cellulose (lignin, sáp, protein,
hemicellulose…) hiệu quả hơn khi chỉ sử dụng một loại enzyme pectinase trong
công đoạn nấu kiềm [45], [47].
Các chế phẩm pectinase kiềm hiện nay có trên thị trƣờng: Bioprep 3000L,
Pulpzyme HC, Scourzyme L –Novozymes, Baylase EVO – Bayer, Unizim PEC
– Color-Center SA, Baylase EVO, Sera Zyme C – PE của Singapore, Prima
Green Ecoscour của Genencor. Các chế phẩm pectinase kiềm thay thế xút đã

giảm rõ rệt giá thành sản xuất nhờ tiết kiệm nƣớc, năng lƣợng và thời gian xử lý
so với quá trình nấu truyền thống sử dụng xút. Hơn nữa, do các điều kiện xử lý
“ôn hòa” của enzyme pectinase dẫn đến tăng chất lƣợng vải, tăng mức độ thấm,
hút nƣớc và cũng làm tăng độ tƣơi sáng màu sau nhuộm theo Cavaco-Paulo &
Gübitz (2003) [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

12


1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
Trong công nghệ sản xuất bột giấy hiện nay, bƣớc tẩy trắng bằng alkaline
peroxide là bƣớc bắt buộc để tạo sản phẩm giấy trắng tinh khiết. Nếu bột giấy
không đƣợc loại bỏ pectin axit trong bột giấy thì trong quá tình tẩy trắng các
pectina axit này sẽ kết hợp với peroxide tạo ra phức hợp cationic polymer làm
ảnh hƣởng đến độ trắng của giấy. Sử dụng pectinase kiềm để loại pectin axit
trong bột giấy giúp cho quá trình tẩy trắng hiệu quả mà không ảnh hƣởng đến ô
nhiễm môi trƣờng [33], [34].
1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến
cà phê và trà
Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật do đó có khả
năng ứng dụng trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các hạt nhƣ hạt cải,
dầu dừa, hạt hƣớng dƣơng, hạt nho v.v.. Việc xử lý các hạt với pectinase kiềm
giúp cho việc chiết rút dầu thực vật hiệu quả hơn so với dùng dung môi hexane
dễ gây ung thƣ [20].

Bổ sung pectinase kiềm cùng với hemicellulase và

protease trong quá trình chế biến cà phê và trà lên men làm tăng năng suất và
chất lƣợng sản phẩm [7].

1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
Pectinase là enzyme quan trọng trong công nghiệp do đó đƣợc đã đƣợc
nhiều nhà khoa học quan tâm. Nhiều tác giả đã biểu hiện thành công pectinase
dạng tái tổ hợp trong tế bào E. coli [30], [21], [24], [46], trên tế bào Bacillus
[27] hay tế bào nấm men Pichia pastoris [18], [52]. Tuy nhiên phần lớn các công
bố trên đều biểu hiện enzyme pectinase tái tổ hợp cho mục đích nghiên cứu tính
chất của enzyme, các công bố về tình Hình sản xuất enzyme trong công nghiệp
cũng nhƣ năng suất sản sinh pectinase tái tổ hợp của các chủng tái tổ hợp đều rất
ít thông tin. Trên thực tế có nhiều chế phẩm enzyme pectinase thƣơng mại là
enzyme tái tổ hợp nhƣng có rất ít thông tin về sản xuất pectinase tái tổ hợp trong
công nghiệp đƣợc công bố. Lý giải cho việc không công bố này là do các công
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13


ty đều muốn giữ bí mật công nghệ cho nên không muốn công bố kết quả nghiên
cứu của mình, đây là việc làm bình thƣờng trong kinh doanh. Gần đây Liu và
cộng sự công bố kết quả biểu hiện gen pectinase từ B. subtilis trong B. subtilis
WB600 hiệu suất cao mục đích ứng dụng cho sản xuất công nghiệp. Các tác giả
đã biểu hiện thành công và enzyme tái tổ hợp cho hoạt tính riêng là 445 U/mg
[27]. Không có công bố hoạt tính pectinase cụ thể là bao nhiêu unit/ml dịch
enzyme ngoại bào sau lên men. Công bố mới đây của Zhang và cộng sự đã biểu
hiện cao pectae lyase từ B. subtilis 168 trong tế bào P. pastoris GS115 cho mục
đích loại pectin trong công nghiệp xử lý sợi gai. Các tác giả đã tạo đƣợc chủng P.
pastoris tái tổ hợp có khả năng sản xuất pectinase trên môi trƣờng lên men đạt
102,36 U/ml dịch lên men [52].
Ở Việt Nam hiện nay có nhiều đề tài về enzyme pectinase. Các hƣớng
nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố
định và ứng dụng của enzyme pectinase trên đối tƣợng chủ yếu là vi nấm, đặc

biệt từ Aspergillus [1], [2], [3].
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Các chủng vi khuẩn
Chủng B. subtilis sử dụng thí nghiệm sàng lọc enzyme pectinase: 20
chủng B. subtilis nguồn gốc Việt Nam từ bộ sƣu tập chủng giống của ngân hàng
chủng giống VTCC- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia
Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab)
đƣợc sử dụng để sàng lọc enzyme pectinase.
Chủng vi khuẩn E. coli chủng DH5α, DH10b (Invitrogen) đƣợc sử dụng
cho mục đích tách dòng gen.
Chủng B. subtilis 168 M đƣợc sử dụng cho mục đích biểu hiện gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14


2.1.2. Hóa chất thí nghiệm
Các hóa chất trong sinh học phân tử:
Enzyme cắt giới hạn EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, ScaI, Dream Taq DNA
polymerase, T4 ligase, DNA marker, protein marker đƣợc mua từ hãng
Fermentas.
Kit tách DNA plasmid, kit tinh sạch DNA genome từ agarose, dung dịch
Bradford đƣợc mua từ hãng Qiagen (CHLB Đức).
Các hóa chất thông dụng: Pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose,
trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2 đƣợc
mua từ các hãng Merck (CHLB Đức), Tris-HCl, hecxadecyl trimethyl trimethyl
trimethyl ammonium bromide (HTAB), pectin citrus, pectin axit đƣợc mua của
hãng Sigma.

2.1.3. Các vector sử dụng
Vector cloning: pJET1.2 đƣợc mua từ hãng Fermentas.
Vector biểu hiện trong B. subtilis dạng đa copy pMSE3 đƣợc nhận từ viện
Công nghệ sinh vật Biển Greifswald.
2.1.4. Trình tự mồi
Gen đƣợc Enzyme
Mục đích
nhân lên treo
BSpelF: atcg aag ctt atg aaa aaa gtg pel
HindIII Nhân gen pel
atg tta gc
từ chủng tự
BSpelR: atcg aag ctt tac tgc tga ctg
HindIII nhiên
tt
pel-BaP-pMSE-XhoIf
BaP-pel
XhoI
Gắn
vào
acttctcgagtcttgtaaatgagttgctag
pMSE3
Pel-pMSE- XbaIr
XbaI
Atcgtctagaagctttactgctgactgtt
Tên và trình tự mồi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15

2.2. Môi trƣờng nuôi cấy
- Môi trường LB (g/l): Pepton 10, cao nấ m men 5, NaCl 5
- Môi trường khoáng chất Belitsky (BMM):
Dung dịch

Nồng độ (M) Lƣợng dịch cần (ml)

Thành phần chính

PP khử trùng

37,5

KH2PO4

0,2

0,2

khử trùng ƣớt

CaCl2

1

0,2

khử trùng ƣớt

MnSO4.4H2O

0,025

0,2

khử trùng ƣớt

Glutamic axit

0,5

0,9

khử trùng ƣớt

FeSO4.7H2O

0,0005

0,2

Lọc khuẩn

L- Tryptophan

0,039

0,16

Lọc khuẩn

L- Lysin-HCl

0,043

0,16

Lọc khuẩn

Glucose 20%

20%

1,0

khử trùng ƣớt

Đến 100

khử trùng ƣớt

Nƣớc cất vô trùng

+ Thành phần chính (g/l): (NH4)2SO4 4; MgSO4.7H2O 4; KCl 4; Na3citrat. 2H2O 4; Tris-HCl 6,06; pH 7,5.
- Môi trường lên men FM (g/l): Tinh bô ̣t ga ̣o 3; pepton đâ ̣u tƣơng 3,5;
K2HPO4 0,7; KH2PO4 0,3; NaCl 0,5; pH 7,4.
- Môi trường SPII:
Dung dịch

T - base
Glucose
Casamino acid
Yeast extract
MgSO4
CaCl2

Nồng độ
25%
1%
10%
1M
0,1M

Lƣợng dịch cần
10 ml
200 µl
100 µl
100 µl
35 µl
50 µl

+ T-base (g/l): (NH4)2SO4 2; K2HPO4.3H2O 18,3; KH2PO4 6; Na3-citrate 1
Tất cả thành phần môi trƣờng đều đƣợc khử trùng ƣớt trƣớc khi sử dụng.
- Môi trường SOC (g/l): Tryptone 20; yeast extract 5; NaCl 0,58; KCl
0,186; MgCl2 0,95; MgSO4 2,4; glucose 3,6; pH = 7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

16