Sàng lọc một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase in silico in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH BẢO YẾN

SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TÁC
DỤNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE
IN SILICO – IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH BẢO YẾN

SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TÁC
DỤNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE
IN SILICO – IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 60720405

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Phạm Thế Hải
TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ “Sàng lọc một số hợp chất có tác
dụng ức chế enzym tyrosinase”, lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc đến thầy TS. Phạm Thế Hải - Giảng viên bộ môn Hóa dược và cô
TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế - Giảng viên bộ môn Dược lý- Trường Đại học Dược
Hà Nội, những người thầy đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt khoảng thời gian thực hiện luận
văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS. Nguyễn Hải Đăng - Phó giám
đốc Trung tâm hóa sinh hữu cơ - Viện hóa sinh biển cùng quý thầy cô trong bộ
môn Hóa dược, bộ môn Dược lý - Trường Đại học Dược Hà Nội, các em sinh
viên đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã
luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, tháng 04 năm 2017
Học viên

Ninh Bảo Yến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này thuộc đề tài nghiên cứu có tên: “Phát triển
sản phẩm thực phẩm chức năng và mỹ phẩm làm sáng da, chống nám từ nguyên
liệu thiên nhiên Việt Nam. Mã số QG.16.86”. Kết quả đề tài này là thành quả
nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài
và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề
tài này vào trong luận văn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác.

Tác giả

NINH BẢO YẾN


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1. Tổng quan về melanin

3

1.1.1. Các bệnh ở da liên quan đến melanin

3

1.1.2. Tổng hợp melanin

6

1.2. Enzym tyrosinase và các chất ức chế

8

1.2.1. Enzym tyrosinase

8

1.2.2. Các chất ức chế tyrosinase

8

1.3. Tổng quan về sàng lọc bằng mô hình in silico

14

1.3.1. Quy tắc giống thuốc (drug-likeness filters/ negative design)

14

1.3.2. Tìm kiếm đồng dạng (similarity searching)

15

1.3.3. Các mô hình QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships)
đánh giá sự tương quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng

16

1.3.4. Kỹ thuật protein docking

19

1.4. Một số nghiên cứu trên thế giới tiến hành sàng lọc hoạt chất có tác
dụng ức chế tyrosinase in silico

20

1.5. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro

22

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ , NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24

2.1. Đối tượng nghiên cứu

24

2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

24

2.2.1. Thuốc và hóa chất

24

2.2.2. Thiết bị và dụng cụ

24

2.3. Phương pháp nghiên cứu

25


2.3.1. Phương pháp sàng lọc các hợp chất ức chế tyrosinase in silico

25

2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của một số hợp chất

28

2.3.3. Xử lý số liệu

35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

36

3.1. Kết quả sàng lọc các hợp chất có tác dụng ức chế tyrosinase bằng mô
hình in silico

36

3.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro của một số hợp chất đã
sàng lọc được bằng mô hình in silico

39

3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của một số hợp
chất đã lựa chọn

39

3.2.2. Xác định sơ bộ cơ chế ức chế tyrosinase của hợp chất có tiềm năng
nhất

46

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

49

4.1. Về kết quả sàng lọc các hợp chất có tác dụng ức chế tyrosinase bằng mô
hình in silico

49

4.1.1. Về quy trình sàng lọc in silico

49

4.1.2. Về các hợp chất đã được lựa chọn để tiến hành thử in vitro

51

4.2. Về kết quả tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của một số hợp chất đã
sàng lọc được bằng mô hình in silico

58

4.2.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của một số hợp
chất đã lựa chọn

58

4.2.2. Về kết quả xác định sơ bộ cơ chế ức chế tyrosinase của hợp chất có tiềm
năng nhất

61

KẾT LUẬN

63

KIẾN NGHỊ

64

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

L-DOPA

L-3,4-dihydroxyphenylalanin

DHI

5,6-dihydroxyindol

D-DOPA

D-3,4-dihydroxyphenylalanin

DHICA

Acid 5,6-dihydroxyindol-2-carboxylic

QSAR

Quantitative Structure-Activity Relationship

FDA

Cục quản lý Dược phẩm Hoa kỳ

AFB1

Aflatoxin B1

BACE1

β- secretases

Aβ

peptid amyloid-β

AR

Thụ thể androgen


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tác dụng ức chế tyrosinase của các hợp chất tự nhiên .......................... 9
Bảng 2.1. Danh sách các hợp chất có hoạt tính mạnh sử dụng trong tìm kiếm cấu
trúc tương đồng ....................................................................................................... 26
Bảng 2.2. Thành phần các chất trong từng giếng ................................................... 30
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc in silico trên cơ sở dữ liệu Spectrum collection ......... 36
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của hydroquinon ............. 39
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của 4 hợp chất đã lựa
chọn ở nồng độ 500μM ........................................................................................... 41

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của 4 hợp chất đã lựa
chọn ở nồng độ 100μM ........................................................................................... 42
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của 4 hợp chất đã lựa
chọn ở nồng độ 50μM ............................................................................................. 43
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của acetosyringon ........... 44
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của acid 3,4-dimethoxycinnamic ................................................................................................................. 45
Bảng 3.8. Kết quả đo mật độ quang ở các nồng độ cơ chất khác nhau .................. 47
Bảng 3.9. Các thông số của phương trình Lineweaver – Burk .............................. 48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của 2 loại melanin ...................................................... 6
Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin ................................ 7
Hình 1.3. Sơ đồ hai bước đầu quá trình tổng hợp melanin xúc tác bởi enzym
tyrosinase ................................................................................................................. 8
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của 7 hợp chất BP1, BP2, BP3, BP4, BP5, BP6,
BP7 .......................................................................................................................... 21
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của 4 hợp chất TK10, TK11, TK21, TK23 .............. 22
Hình 2.1. Mô phỏng hệ thống sàng lọc ảo lựa chọn hợp chất ức chế enzym
tyrosinase ................................................................................................................. 25
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm để đánh giá hoạt tính ức chế enzym
tyrosinase ................................................................................................................. 31
Hình 2.3. Đồ thị trong trường hợp ức chế cạnh tranh. ........................................... 33
Hình 2.4. Đồ thị trong trường hợp ức chế không cạnh tranh ................................. 34
Hình 2.5. Đồ thị trong trường hợp ức chế hỗn hợp ................................................ 34
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế tyrosinase của hydroquinon .............. 40
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế tyrosinase của acetosyringon ........... 45
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế tyrosinase của acid 3,4dimethoxycinnamic .............................................................................................. 46
Hình 3.4. Đồ thị Lineweaver – Burk của tyrosinase khi có mặt và không có mặt
acid 3,4-dimethoxycinnamic .................................................................................. 47

Hình 4.1. A) Cấu dạng của acid 3,4-dimethoxycinnamic trong trung tâm hoạt
động của tyrosinase. (B) Biểu diễn hai chiều tương tác giữa hợp chất này với các
acid amin trong trung tâm hoạt động ..................................................................... 53
Hình 4.2. (A) Cấu dạng của 2,2',4'-trihydroxychalcon trong trung tâm hoạt
động của tyrosinase. (B) Biểu diễn hai chiều tương tác giữa hợp chất này với các
acid amin trong trung tâm hoạt động ..................................................................... 54


Hình 4.3. (A) Cấu dạng của acetosyringon trong trung tâm hoạt động của
tyrosinase. (B) Biểu diễn hai chiều tương tác giữa hợp chất này với các acid
amin trong trung tâm hoạt động. ............................................................................. 56
Hình 4.4. (A) Cấu dạng của dibenzoylmethan trong trung tâm hoạt động của
tyrosinase. (B) Biểu diễn hai chiều tương tác giữa hợp chất này với các acid
amin trong trung tâm hoạt động. ............................................................................. 57


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sắc tố là một trong những đặc điểm kiểu hình rõ ràng nhất trong thế giới tự
nhiên. Trong các tế bào động vật hoặc thực vật, một sắc tố được định nghĩa là
bất kỳ chất tạo màu do chúng phản xạ và hấp thụ một số sóng ánh sáng đặc hiệu.
Trong các sắc tố sinh học đó, melanin (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là đen) được
phân bố rộng rãi nhất và được tìm thấy trong suốt quá trình phát sinh loài, từ các
vi sinh vật cho đến động vật, bao gồm cả con người [65]. Ở người, melanin
được tìm thấy chủ yếu trong da, tóc, võng mạc, trong tuyến thượng thận, tai
trong, trong substantia nigra (vùng chất đen) [30].
Màu da của con người được xác định bởi nhiều yếu tố, trong đó quan
trọng nhất là số lượng và mức độ phân bố melanin [70]. Ngoài ra, hợp chất này
còn có rất nhiều chức năng, trong đó sự hấp thụ và tán xạ ánh sáng mặt trời giữ
vai trò quan trọng trong việc bảo vệ làn da khỏi các tác động có hại của tia tử
ngoại (UV), đặc biệt là tia cực tím B (UVB), và loại bỏ các loại thuốc và hóa

chất độc hại [57]. Tuy nhiên, việc sản sinh quá mức và tích tụ melanin cũng gây
nên nhiều bệnh về da như nám da (melasma), sạm da, tàn nhang, nốt ruồi…và
ung thư da (melanoma). Melanin được hình thành trong hạt sắc tố melanosome
bởi hoạt động của enzym tyrosinase [60]. Tyrosinase là enzym có mặt ở cả tế
bào động vật và thực vật đặc biệt là từ nấm, chúng xúc tác cho quá trình tạo ra
melanin từ các chất nền trong tế bào melanocyte [25]. Khi melanocyte hoặc các
enzym tyrosinase hoạt động mạnh sẽ sản sinh ra nhiều melanin và gây ra hiện
tượng nám.
Các vấn đề về sắc tố da thường gây nhiều áp lực về mặt thẩm mỹ, đặc biệt
là đối với phụ nữ. Ở châu Á, hàng năm tiêu tốn khoảng hàng tỷ USD cho các sản
phẩm làm sáng da (làm giảm các đốm nắng, tàn nhang hay làm mờ các vết
nám). Hiện nay nhiều sản phẩm làm sáng da, chống nám sử dụng hoạt chất là
các chất ức chế enzym tyrosinase. Tuy nhiên những hoạt chất ức chế enzym
tyrosinase hiện nay như hydroquinon và arbutin lại có vấn đề về sự an toàn và
1


tính hiệu quả [86], [18]. Việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới ức chế
tyrosinase là một quy trình rất tốn kém cả về thời gian và tiền bạc. Trong những
năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới cũng như trong nước đã dần ứng
dụng các phương pháp mới giúp giảm thiểu chi phí và thời gian tìm kiếm hợp
chất tiềm năng ức chế tyrosinase có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp hoá dược.
Đặc biệt các nghiên cứu ứng dụng phương pháp tính toán và mô phỏng phân tử
(gọi tắt là phương pháp in silico) đã và đang được ứng dụng rộng rãi.
Trên cơ sở đó, nhằm tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase mới có hoạt tính
tốt và có tiềm năng phát triển thành thuốc chống nám da, chúng tôi tiến hành đề
tài “Sàng lọc một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase in silico –
in vitro” với hai mục tiêu sau:
1. Sàng lọc được một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase bằng
mô hình in silico.

2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của một số hợp chất đã
sàng lọc được bằng mô hình in silico.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về melanin
Melanin là một trong những chất màu phân bố rộng nhất và được tìm thấy

trong vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Màu sắc của da và tóc động vật có vú
được quyết định bởi một số yếu tố, trong đó quan trọng nhất là mật độ và sự
phân bố của sắc tố melanin. Melanin được tiết ra bởi tế bào sắc tố melanin phân
bố ở lớp đáy của biểu bì [62]. Vai trò của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của
tia cực tím (UV) bằng cách hấp thụ UV của ánh sáng mặt trời và loại bỏ các gốc
oxy hóa tự do. Các rối loạn bất thường ở da là kết quả của sự tích tụ quá mức
sắc tố ở biểu bì như nám lentigo gồm nám da, đồi mồi và điểm tổn thương do
ánh nắng. Đáng chú ý là sự có mặt của melanin trong khối u ác tính nhất là các
khối u ở da [25].
1.1.1. Các bệnh ở da liên quan đến melanin
Sự gia tăng sản xuất và tích tụ các melanin đặc trưng cho các bệnh tăng
sắc tố như sạm da, rám má, đồi mồi, tàn nhang…và nghiêm trọng hơn là bệnh u
hắc tố ác tính ở da. Tăng sắc tố có thể do tăng tế bào tạo sắc tố hoặc do tăng hoạt
động của các enzym hình thành sắc tố [60].
1.1.1.1. Bệnh sạm da
Sạm da là tình trạng tăng sắc tố trên da làm cho da vùng tổn thương có
màu nâu, nâu đen, vàng nâu, xanh, xanh đen, có thể gặp ở bất kỳ vùng da nào
của cơ thể, tuy nhiên vị trí hay gặp là vùng da hở, đặc biệt là mặt, cổ. Bệnh ảnh

hưởng nhiều đến tâm lý và thẩm mỹ của người bệnh. Sạm da là kết quả của
nhiều nguyên nhân gây nên như di truyền, rối loạn nội tiết, rối loạn chuyển hoá,
yếu tố vật lý, tăng sắc tố sau viêm, bệnh tự miễn, dị ứng thuốc…kết quả cuối
cùng làm rối loạn quá trình sản sinh sắc tố melanin và sự phân bố của sắc tố
melanin ở các lớp tế bào thượng bì, đôi khi cả trung bì, hoặc ảnh hưởng tới số
lượng tế bào sắc tố [1].

3


- Sạm da do di truyền như là hội chứng Leopard, hội chứng Peutz-jeghers, hội
chứng Clam, bệnh Becker, bệnh tàn nhang.
- Sạm da do rối loạn nội tiết như bệnh Addison, dát sắc tố trong thời kì mang
thai.
- Sạm da do hoá chất, do dị ứng thuốc trong bệnh hồng ban (những hoá chất hay
thuốc gây tăng sắc tố da thường là các hoá chất có nguồn gốc dầu mỏ, mỹ phẩm,
nước hoa. Những hoá chất này đóng vai trò là chất cảm quang gây nhiễm sắc tố
da ở vùng tiếp xúc với ánh sáng).
- Ngoài ra sạm da còn có thể do một số nguyên nhân khác:
+ Nguyên nhân dinh dưỡng mà hàng đầu phải kể đến là thiếu vitamin A, B12,
vitamin PP: sạm da gặp chủ yếu ở vùng da hở.
+ Yếu tố vật lý: như cháy nắng, rám nắng ở vùng có tiếp xúc với ánh sáng mặt
trời mà không được bảo vệ.
+ Tăng sắc tố sau viêm: có thể khu trú ở thượng bì, cũng có khi ở cả trung bì do
đại thực bào ăn sắc tố sau đó khu trú ở trung bì, vùng tăng sắc tố này có thể xảy
ra sau một đợt viêm cấp hay mạn, hay sau một đợt nhiễm nấm hay nhiễm khuẩn.
+ Tăng sắc tố trong các khối u lành tính và ác tính.
+ Tăng sắc tố trong bệnh hệ thống, bệnh lao, sốt rét, xơ cứng bì…
1.1.1.2. Bệnh rám má
Rám má là một hiện tượng tăng sắc tố, thường xuất hiện ở mặt nhất là hai

bên gò má. Bệnh có ở cả hai giới, nhưng phụ nữ gặp nhiều hơn. Bệnh tuy lành
tính, không gây tử vong nhưng lại ảnh hưởng nhiều đến tâm sinh lý và thẩm mỹ
của người bệnh đặc biệt là phụ nữ. Tổn thương thường là các dát tăng sắc tố
màu nâu, nâu đen, xanh đen màu sắc có thể đồng đều, có thể không, ranh giới
tổn thương thường không đều và thường có tính chất đối xứng, tổn thương nhẵn,
không có vảy, không ngứa, không đau. Tổn thương thường khu trú ở hai bên gò
má, thái dương, trán, mũi, quanh miệng. Đôi khi tổn thương còn xuất hiện ở

4


cánh tay trên. Các dát sắc tố này tăng đậm lên về mùa xuân và mùa hè, có giảm
về mùa thu và mùa đông [1].
Rám má là bệnh do rối loạn chuyển hóa sắc tố ở da. Số lượng tế bào sắc
tố hoàn toàn bình thường, nhưng do rối loạn nội tiết đặc biệt là estrogen làm cho
tế bào sắc tố tăng cường sản xuất ra sắc tố và được vận chuyển sang các tế bào
thượng bì, vì vậy làm tăng sắc tố của da. Chính vì lẽ đó người ta cho rằng rám
má là bệnh tăng sắc tố nguyên nhân do nội tiết. Vì vậy, bất kể nguyên nhân nào
ảnh hưởng tới nội tiết của cơ thể đều có thể làm phát sinh rám má, đặc biệt các
nội tiết tố sinh dục như estrogen, progesteron. Ngoài ra, một số loại hormon
khác cũng có thể làm phát sinh bệnh như hormon tuyến giáp, tuyến thượng thận,
tuyến yên [1].
Một số yếu tố thuận lợi làm phát sinh bệnh như uống thuốc tránh thai,
viêm nhiễm cấp hay mạn tính, hay gặp trong viêm xoang, viêm phần phụ, chửa
đẻ, và một số nghề nghiệp, nhất là những người làm nghề có liên quan đến dầu
mỏ và các sản phẩm hóa dầu, những người sản xuất và sử dụng nhiều nước hoa.
1.1.1.3. Bệnh ung thư tế bào hắc tố
Bệnh ung thư tế bào hắc tố (malignant melanoma) chiếm khoảng 5% các
bệnh ung thư da và khoảng 1% các loại ung thư. Bệnh gặp ở mọi chủng tộc, tỷ lệ
người da trắng mắc bệnh nhiều hơn các loại da màu khác. Tại một số vùng ở Úc

có khoảng 40 ca mắc trên 100.000 dân mỗi năm. Ung thư tế bào hắc tố thường
gặp ở người lớn tuổi và hiếm gặp ở trẻ em. Tỉ lệ mắc bệnh ở cả hai giới là tương
đương nhau và ngày càng gia tăng ở cả nam và nữ. Tuy nhiên thì mức độ gia
tăng cao hơn ở những người tiếp xúc quá nhiều với bức xạ tia cực tím [1].
Những người sống ở khu vực có ánh nắng mặt trời chiếu sáng quanh năm hoặc
với cường độ sáng mạnh và gay gắt sẽ có nguy cơ cao mắc các bệnh ung thư da.
Ngoài ra thì những người phải làm việc ngoài trời dưới ánh nắng mặt trời vào
buổi trưa lúc cường độ ánh sáng là mạnh nhất cũng có nguy cơ mắc các bệnh
ung thư da cao hơn. Tiếp xúc với bức xạ tia cực tím B (UVB) từ mặt trời làm
5


tăng sự phát triển của khối u ác tính cũng như sự phát triển của tế bào ung thư
da. Ngoài ra theo những thông tin gần đây thì tia cực tím A (UVA) cũng có thể
đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các bệnh ung thư da. Trong
các thử nghiệm lâm sàng phát hiện tyrosinase trong máu và nước tiểu là một dấu
hiệu chẩn đoán khối u ác tính. Thực tế hầu hết các khối u ác tính xuất hiện khi
mật độ sắc tố cao do đó can thiệp vào quá trình sản xuất melanin là một mục tiêu
trong chẩn đoán và điều trị chống lại khối u hắc tố ác tính [68].
1.1.2. Tổng hợp melanin
Các tế bào melanocyte của động vật có vú có thể sản xuất hai loại melanin:
- Eumelanin có màu từ nâu đến đen không tan trong hầu hết các dung môi,
liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị.
- Pheomelanin có bộ khung được tạo bởi các tiểu đơn vị là các benzothiazin
có màu từ vàng đến đỏ nâu và cũng liên kết chặt chẽ với protein thông qua
các liên kết đồng hóa trị.
Kết hợp khác nhau giữa số lượng và mật độ của hai melanin này sẽ quyết
định màu sắc của da, mắt và tóc [82].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của 2 loại melanin.

Trong nang tế bào sắc tố có xảy ra sự chuyển đổi giữa hai loại melanin từ
hình thành eumelanin thành hình thành pheomelanin. Con đường hình thành sắc
tố eumelanin có thể chia thành hai giai đoạn (Hình 1.2) [42], [63].

6


Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin.
-

Giai

đoạn

đầu

được

L-tyrosin

hydroxyl

hóa

thành

3,4-

dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) bởi enzym tyrosinase và được gọi là quá
trình monophenolase (đây là bước bắt buộc của quá trình sinh tổng hợp

melanin). Tiếp theo L-DOPA được oxy hóa thành dopaquinon cũng bởi enzym
tyrosinase và được gọi là quá trình diphenolase. Dopaquinon là một hợp chất
được sử dụng trong cả 2 con đường sinh tổng hợp eumelanin và pheomelanin.
Dopaquinon tiếp tục phản ứng nội phân tử tạo leukodopachrom, trung gian này
nhanh chóng bị oxy hóa tạo dopachrom hoặc khử trở lại thành L-DOPA.
-

Giai đoạn sau: gồm một loạt các phản ứng hóa học tổng hợp eumelanin từ

dopachrom. Giai đoạn này bắt đầu với phản ứng khử carboxyl hóa chậm của
dopachrom tạo 5,6-dihydroxyindol (DHI) và oxy hóa tiếp để tạo indol-5,6quinon. Dopachrom có thể bị chuyển hóa bởi enzym tautomerase thành acid 5,6dihydroxyindol-2-carboxylic (DHICA) [6]. DHICA tiếp tục bị oxy hóa bởi một
phản ứng oxi hóa khử với dopaquinon để tạo thành acid indol-5,6-quinon
cacboxylic hoặc tạo eumelanin.

7


Trong quá trình hình thành sắc tố pheomelanin nhóm thiol của các hợp
chất sulfhydryl như glutathion và cystein nucleophilically tấn công dopaquinon
để sản xuất cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa [42]. Cysteinyldopa hoặc
glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành
pheomelanin. Melanin là một hợp chất phức tạp chứa cả eumelanin và
pheomelanin.
1.2. Enzym tyrosinase và các chất ức chế
1.2.1. Enzym tyrosinase
Tyrosinase tồn tại trong thực vật và động vật tham gia vào sự hình thành
sắc tố melanin. Tyrosinase là một enzym có chứa đồng, nó xúc tác cho hai phản
ứng riêng biệt của quá trình tổng hợp melanin: hydroxyl hóa tyrosin (quá trình
monophenolase) và quá trình oxy hóa của L-DOPA thành dopaquinon (quá trình
diphenolase) [12].

Hình 1.3. Sơ đồ hai bước đầu quá trình tổng hợp melanin xúc tác bởi enzym
tyrosinase [14].
Các chất ức chế tyrosinase ngày càng quan trọng trong các sản phẩm thuốc
và mỹ phẩm sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị các bệnh rối loạn sắc tố [14].
1.2.2. Các chất ức chế tyrosinase
Tyrosinase đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin,
do đó việc ức chế nó góp phần làm giảm gia tăng sắc tố da [53].
1.2.2.1. Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc thiên nhiên
8


* Polyphenol thực vật
Polyphenol thực vật là nhóm các hợp chất có nhiều nhóm chức phenol
(các hợp chất này được tiến hành nghiên cứu nhiều nhất). Hơn 4000 flavonoid
phân bố rộng trong lá, hạt, vỏ cây và hoa đã được xác định. Ở thực vật các hợp
chất này bảo vệ thực vật chống lại tia cực tím và tác nhân gây bệnh. Chúng cũng
quy định cho màu đỏ và màu xanh đặc trưng của quả cà phê, rượu vang và một
số loại rau [31].
Flavonoid có thể được chia thành sáu nhóm chính (flavanol, flavon,
flavonol, flavanon, isoflavon và anthocyanidin), giữa các nhóm có sự khác biệt
trong sắp xếp các nhóm hydroxyl, methoxy, glycosidic, và liên kết giữa vòng A
và vòng B. Một số flavonoid như kaempferol, quercetin và morin thể hiện tác
dụng ức chế tyrosinase, trong khi những chất khác, ví dụ catechin và rhamnetin,
đóng vai trò là các chất nền của tyrosinase. Một số nghiên cứu đã tiến hành và
xác định được các chất ức chế tyrosinase tự nhiên và thiết lập mối liên quan giữa
cấu trúc và tác dụng ức chế của các chất đó. Nghiên cứu thấy rằng flavonoid có
chứa nhóm α-keto có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh [7].
Bảng 1.1. Tác dụng ức chế tyrosinase của một số hợp chất tự nhiên [42].
Kiểu ức chế

IC50 (mM)

Epigallocatechin

Cạnh tranh

0,035

Epicatechin gallat

Cạnh tranh

0,017

Epigallocatechin gallat

Cạnh tranh

0,034

Quercetin

Cạnh tranh

0,070

Kaempferol

Cạnh tranh

0,230

Morin

Cạnh tranh

2,320

Luteolin

Không cạnh tranh

0,190

Luteolin 7-O- glucosid

Không cạnh tranh

0,500

Glabridin

Không cạnh tranh

0,004

Hợp chất
Flavanol

Flavonol

Flavon

Isoflavan

9


Glabren

Hổn hợp

7,600

Isoliquiritigenin

Hỗn hợp

0,047

Hỗn hợp

0,014

Anisaldehyd

Không cạnh tranh

0,320

Cuminaldehyd

Không cạnh tranh

0,050

Cinnamaldehyd

Không cạnh tranh

0,980

Acid kojic

IC50: Nồng độ ức chế 50% hoạt độ của enzym tyrosinase.
* Dẫn xuất của aldehyd và các hợp chất khác
Nhiều aldehyd và các hợp chất khác cũng được phân lập và xác định là có
tác dụng ức chế enzym tyrosinase như cinnaldehyd; (2E)-alkenal; 2-hydroxy-4methoxybenzaldehyd; anisaldehyd; cuminaldehyd và acid cumic [44]. Hoạt
động ức chế tyrosinase của anisaldehyd và cuminaldehyd mạnh hơn khoảng 2,5
và 16 lần benzaldehyd. Một số alkanal có tác dụng ức chế tyrosinase có thể là do
sự tương tác kỵ nước của chúng với các enzym, làm ảnh hưởng đến cấu trúc bậc
3 của enzym [16].
(2E)–alkenal ức chế quá trình oxy hóa L-DOPA của tyrosinase là chất ức
chế không cạnh tranh, và phần alkyl kỵ nước có liên quan đến hoạt động ức chế
của chúng [16].
* Các chất phân lập từ nấm
Bên cạnh những thực vật bậc cao thì trong nấm cũng có một số hợp chất
có tác dụng ức chế enzym tyrosinase.
- Acid azelaic (acid 1,7-heptanedicarboxylic) hiện nay đang được sử dụng

để điều trị mụn trứng cá từ nhẹ đến trung bình, điều trị bệnh tăng sắc tố da đặc
biệt ở những người sạm da. Tuy nhiên thì acid azelaic lại ức chế tyrosinase yếu
và ức chế theo cơ chế cạnh tranh [71].
- Acid dicarboxylic bão hòa được tạo thành bởi lipoperoxidation và este
hóa acid béo bằng nấm men, vi nấm Pityrosporum ovale. Acid dicarboxylic có

10


tác dụng gây độc nhất định trên các tế bào biểu bì tạo sắc tố ác tính của khối u ác
tính ở da, mặc dù bình thường tế bào biểu bì tạo sắc tố không bị ảnh hưởng [71].
- Acid kojic (5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-g-pyron), một chất chuyển hóa
của nấm được sản xuất bởi nhiều loài Aspergillus và Penicillium [79]. Acid
kojic ức chế sự hình thành sắc tố từ phản ứng oxy hóa D-DOPA, norepinephrin
và dopamin dưới sự xúc tác của tyrosinase. Điều này có nghĩa rằng acid kojic có
thể giảm chuyển hóa dopaquinon thành O-diphenol ngăn cản tạo thành các sắc
tố và được oxy hóa thành một sản phẩm màu vàng bằng cách tương tác hóa học
với dopaquinon.
- Metallothionein từ Aspergillus niger là một chất ức chế tyrosinase và có
tác dụng ức chế quá trình oxy hóa mạnh hơn trên các catechin so với acid
chlorogenic [29].
1.2.2.2. Các chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp
Một lượng đáng kể các hợp chất có nguồn gốc tổng hợp như
hydroxylamin, các hợp chất chứa thiol, acid carboxylic thơm, dẫn xuất của acid
cinnamic, trihidroxichalconas, peptid, acid alkylbenzoic [36], N-hydroxy-N’phenylurea và N-hydroxy-N’-feniltiourea [17] có tác dụng ức chế enzym
tyrosinase.
Tropolon (2-hydroxy-2,4,6-cycloheptatrien) là một trong những chất ức
chế tyrosinase mạnh. Nó có cấu trúc tương tự như các chất nền O-diphenolic của
tyrosinase [39].
4-substituted resorcinol là các chất ức chế tyrosinase yếu. Một số hợp chất

4-substituted resorcinol khi thay thế nhóm kỵ nước vào vị trí thứ 4, chẳng hạn
như 4-hexylresorcinol và 4-dodecylresorcinol thì lại thể hiện tác dụng ức chế
mạnh. 4-hexylresorcinol là các chất ức chế tyrosinase hiệu quả nhất được sử
dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm vì nó hòa tan trong nước, ổn định,
không độc hại, không gây đột biến và không gây ung thư. 4-hexylresorcinol đã

11


được công nhận là an toàn để giảm sự tạo thành màu nâu của lát táo cũng như
khoai tây và bơ khi để lâu ngoài không khí [24].
Một loạt các N-substituted N-nitrosohydroxylamin đã được tổng hợp và
xác định hoạt tính ức chế tyrosinase [74]. Điều thú vị là, hoạt tính của các dẫn
xuất N-n-alkyl không bị ảnh hưởng bởi chiều dài của chuỗi alkyl, trong khi hoạt
động ức chế giảm đáng kể so với sự gia tăng chiều dài của chuỗi alkyl trong các
hợp chất có nhóm thế phenyl tại một carbon của nhóm N-nitroso-Nhydroxylamino. Điều này có nghĩa là nhóm thế phenyl hoặc alkyl ở một carbon
của nhóm N-nitroso-N-hydroxylamino có thể gây cản trở không gian làm các
chất ức chế khó tiếp cận vào vị trí hoạt động của enzym. Trong số các amin, Ncyclopentyl-N-nitrosohydroxylamin thể hiện hoạt tính mạnh nhất, mạnh như
tropolon [42].
1.2.2.3. Các thuốc được phát hiện có tác dụng ức chế tyrosinase
Captopril ((2S)-N-(3-mercapto-2-methyl-propionyl)-L-prolin) là một
thuốc được sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng huyết áp và suy tim thông qua
tác dụng ức chế men chuyển angiotensin [27]. Thuốc này thể hiện tác dụng ức
chế không cạnh tranh không thuận nghịch trên các hoạt động monophenolase
của tyrosinase nấm, và có tác dụng ức chế cạnh tranh không thuận nghịch trên
hoạt động diphenolase của tyrosinase [23]. Captopril tạo chelat với đồng [37] do
đó, tác dụng ức chế tyrosinase của captopril chủ yếu là do tạo chelat với ion
đồng ở vị trí hoạt động của enzym tyrosinase. Ngoài ra, tác dụng ức chế có thể
còn liên quan đến phản ứng trao đổi disulfid giữa captopril và cystein tại vị trí
hoạt động của enzym.

Một số loại thuốc khác cũng có tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase
như penicillamin, được sử dụng trong điều trị bệnh Wilson [52], và methimazol
thuốc kháng tuyến giáp. Methimazol (1-methyl-2-mercaptoimidazol) ức chế cả
hoạt động monophenolase và diphenolase của tyrosinase nấm. Methimazol ức
chế hoạt động tyrosinase của nấm bằng hai cách: liên hợp với dopaquinon, do đó
12


ức chế rõ sự hình thành sắc tố, và tạo chelat với đồng tại vị trí hoạt động của
tyrosinase [5].
1.2.2.3. Một số chất ức chế đã được sử dụng
Hydroquinon làm giảm 90% hoạt tính của tyrosinase [81], là một hóa chất
phổ biến có trong mỹ phẩm và sản phẩm làm sáng da. Nó được coi là một trong
các chất ức chế hiệu quả nhất quá trình sản xuất melanin ở cả in vitro và in vivo.
Hydroquinon đã từng được sử dụng rộng rãi để điều trị các rối loạn sắc tố như
làm trắng da để điều trị nám, điều trị tăng sắc tố sau viêm và các rối loạn tăng
sắc tố khác. Do các tác dụng phụ liên quan tới việc sử dụng các sản phẩm không
cần đơn của hydroquinon nên hydroquinon đã bị FDA (Cục quản lý Dược phẩm
Hoa kỳ) quy định hạn chế sử dụng các sản phẩm OTC (không kê đơn) có chứa
nồng độ hydroquinon cao. Ảnh hưởng sức khỏe nghiêm trọng nhất có liên quan
đến hydroquinon là ảnh hưởng đến sắc tố của mắt, và trong một số ít trường hợp
hydroquinon gây tổn thương giác mạc vĩnh viễn. Hiện tượng này đã được quan
sát thấy ở các công nhân sản xuất hydroquinon. Hydroquinon đã bị cấm sử dụng
trong các chế phẩm mỹ phẩm ở Châu Âu vì không an toàn khi sử dụng trong
thời gian dài [18].
Arbutin, một hợp chất chuyển hóa thứ cấp của cây Bearberry (tên khoa
học là Arctostaphylos uva-ursi), được sử dụng rộng rãi với hiệu quả làm sáng
da. Arbutin tự nhiên tương đối an toàn tuy nhiên lại có độ ổn định thấp và dễ
dàng chuyển hóa thành hydroquinon. Vì thế vào năm 2008, Hiệp hội Mỹ phẩm
Châu Âu đã cấm sử dụng các đồng dạng của β-arbutin [86].

Trên đây là ví dụ của 2 hoạt chất đã được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp mỹ phẩm sáng da, chống nám. Như vậy, mặc dù đã có một số chất ức
chế enzym tyrosinase được sử dụng khá rộng rãi trong các sản phẩm làm sáng
da liên quan đến sắc tố nhưng các hợp chất này lại gây ra những tác dụng không
mong muốn khiến việc sử dụng bị hạn chế hoặc không được phép lưu hành. Do
đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới ức chế enzym tyrosinase vẫn thu hút mối
13


quan tâm của các ngành công nghiệp dược và mỹ phẩm toàn cầu nhằm phát hiện
các hợp chất mới có hoạt tính cao và an toàn hơn.
1.3. Tổng quan về sàng lọc bằng mô hình in silico
Các khái niệm về sàng lọc in silico (sàng lọc ảo) xuất hiện vào những năm
60 của thế kỷ XX với các mô hình của Hansch [32]. Thế nhưng, chỉ từ năm
1990 thì lĩnh vực này mới có nhiều bước tiến và từ đó đến nay, ngày càng phát
triển mạnh mẽ [38]. Mô hình in silico không những bổ sung cho các mô hình
thực nghiệm mà còn giúp định hướng quá trình tổng hợp và phân lập các chất.
Ngoài ra sau khi được xây dựng, việc sử dụng các mô hình này tương đối rẻ (tiết
kiệm nguyên liệu thử), nhanh và cho phép làm việc với số lượng lớn lên tới hàng
triệu hợp chất, một điều không thể làm được trong các mô hình thực nghiệm.
Hệ thống sàng lọc in silico được trợ giúp bởi máy tính gồm nhiều phễu
lọc khác nhau, mỗi phễu lọc sử dụng một kỹ thuật sàng lọc ảo khác nhau, được
sắp xếp tuần tự hợp lý dựa vào thời gian mà máy tính cần cho mỗi thuật toán và
sự phức tạp của thông tin đầu vào.
1.3.1. Quy tắc giống thuốc (drug-likeness filters/ negative design)
Quy tắc đầu tiên của quá trình nghiên cứu và sàng lọc bằng mô hình in
silico dựa trên đặc tính lý hóa của phân tử hóa học mà không cần thông tin của
đích tác dụng. Quy tắc này sẽ tiến hành loại bỏ những hợp chất không có tính
chất giống thuốc (non-druglikeness) hoặc những hợp chất có thể gắn vào các
đích khác (anti-targets) gây nên những tác dụng không mong muốn [40].

Trong các “quy tắc giống thuốc” đã được công bố quy tắc 5 của Lipinski
(Ro5) được sử dụng rất rộng rãi. Quy tắc này lựa chọn các hợp chất dựa trên
khối lượng phân tử (MW≤ 500 g/mol), độ thân dầu (LogP≤ 5), số các nguyên tử
cho các liên kết hydro (nHBDon≤ 5) và nhận các liên kết hydro (nHBAc≤ 10).
Theo quy tắc này, một hợp chất không thỏa mãn ít nhất hai tính chất trên, có rất
ít khả năng hấp thu và theo đó rất ít khả năng phát triển thành thuốc. Thông
thường quy tắc này được mở rộng điều kiện là số liên kết có thể quay được
14


(nRotB) thấp hơn 10. Có nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, quy tắc này rất chặt
chẽ và có nhiều giới hạn cao hơn thường được sử dụng, nhất là đối với các thông
số khối lượng phân tử và độ thân dầu [51].
1.3.2. Tìm kiếm đồng dạng (similarity searching)
Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu
trúc tương tự với hợp chất mẫu trên cơ sở dữ liệu về cấu trúc của các hợp chất.
Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng được đưa vào sử dụng rộng rãi kể từ thập niên tám
mươi, và được chứng minh là rất hữu ích trong lĩnh vực dược phẩm. Hiện nay,
phương pháp tìm kiếm đồng dạng đã được xây dựng bởi nhiều nhóm nghiên cứu
trên thế giới. Sàng lọc ảo sử dụng kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng có thể tiến hành
một cách nhanh chóng, do đó, kỹ thuật này được sử dụng nhiều để sàng lọc các
cơ sở dữ liệu lớn [72].
Hai yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình tìm kiếm đồng dạng là các
tham số phân tử đặc trưng cho các chất (có rất nhiều các tham số phân tử đặc
trưng cho các chất như khối lượng phân tử, số lượng cacbon, số lượng điện
tử…) và thông số sử dụng để thiết lập mối liên hệ so sánh giữa các cặp phân tử
(hệ số tương đồng). Sau khi so sánh có thể sắp xếp các hợp chất trong cơ sở dữ
liệu theo thứ tự giảm dần về sự tương tự so với các hợp chất mẫu. Khi có được
danh sách sắp xếp này người nghiên cứu sử dụng một ngưỡng (cut-off) để lựa
chọn một tập hợp các hợp chất nằm trên cùng danh sách [33].

Có nhiều hệ số được xây dựng để biểu diễn sự giống nhau giữa một cặp
cấu trúc, chẳng hạn như hệ số Tanimoto/Jaccard, hệ số Cosine/ Ochiai, hệ số
Dice, hệ số Fossum, hệ số Simpson, hệ số Pearson/Stile; khoảng cách Euclide,
khoảng cách Hamming, khoảng cách Soergel, khoảng cách Manhattan. Hệ số
Tanimoto được sử dụng rộng rãi nhất cho các dữ liệu nhị phân. Nhiều nghiên
cứu đã chỉ ra rằng, hệ số này cho kết quả tốt hơn so với nhiều hệ số khác [61].

15