ẢNH HƯỞNG ĐỐI KHÁNG VÀ ỨC CHẾ CỦA B.SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH TRÊN THỰC VẬT

Bài thuyết trình
Môn: Kỹ thuật gen
Khoa Công nghệ Sinh học
Viện Đại học Mở Hà Nội
GVHD: TS.Nguyễn Huy Hoàng


Nhóm 9

Lớp 10.01
Nguyễn Thị Lương
Trần Thị Hạnh
Trần Thủy Tiên
Trịnh Công Sơn

Nguyễn Anh Tiến
Nguyễn Hà Nhung
Trần Thị Hằng



Mục lục

A. Khái quát vi khuẩn B.subtilis
B. CẤU TẠO VI KHUẨN
C. TÍNH ĐỐIKHÁNG CỦA CHÚNG
D. NGUYÊN LiỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

E. KẾT QuẢ
F. THẢO LUẬN

•
•

•

:
1872 Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch
mô tả và đặt tên
1949 – 1957: Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis.
1959 : Công nh nghiên
u a Work cho thấy B. subtilis
hê
ng men
tương i
n
nh có khả năng
y phân glucid, lipid, protid..
:
+ Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thảm mùn thực vật. Thông
thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g.
+ Tồn tại trong dạ dày, ruột, do chúng chịu được pH thấp.
B. subtilis thuộc :
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (order) Eubacteriales
Họ family) Bacillaceae
Giống (genus): Bacillus
Loài Bacillus subtilis

H. Vk bắt màu Gram+
(tím)

1.Vi khuẩn gram (+), không sinh bệnh
2. Hình que và là vi khuẩn sinh nội bào
tử hiếu khí. VK có khả năng di động
3. Kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm
4. pH = 7,0 - 7,4. Nhiệt độ tối ưu 37 o C

H. VK B.subtilis và bào tử


Là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất về hình thái khuẩn lạc của VK Gram (+)
Trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc phát triển theo dạng tròn, hoặc vết nhăn màu
nâu rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm
Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

Khuẩn lạc B.subtilis
trên điã thạch

Kl sau 48h

Kl sau 96h



•
•

•
•



Loại vi khuẩn này kháng lại các nấm sinh
bệnh bằng cách
nh tranh
Thay i
ch ch
Trung a

m gây nh (nơi ở, dinh dưỡng)
n a, tiết ra enzyme thủy phân ngoại bào
n ch a cơ thê t chu.
c tô nấm.
i

Đặc điểm kháng sinh :
– B.subtilis sản sinh kháng sinh có bản chất lipopeptide.
– Khối lượng phân tử nhỏ hơn 2000 Dalton.
– Tổng hợp không ribosome.( non-ribosome)


Kháng sinh

Tính chất

Tác động

nhóm chất có hoạt
tính sinh học, bản
chất là lipopeptid

-Kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm.
- Làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây
bệnh và bào tử của chúng.

- Bản chất là
lipopeptit dk chiết từ
môi trường nuôi cấy
B.subtillis

- Tác động lên màng tb chất, làm tan màng và tạo
những lỗ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu
chọn lọc của màng.

Bản chất lipopeptide

- Có khả năng diệt nấm như surfactin và iturin

- Chịu nhiệt rất cao,
không mất hoạt tính
khi hấp autoclave ở
pH 2

-cách gắn với màng nguyên sinh chất làm ảnh
hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng
lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton.

- bacteriocin rất bền,

- Đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể cả
tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử


•

•
•

•

•

•

B.subtilis RB14 kháng nấm Rihzotomia, là tác nhân gây úng thối trên cây cà
chua con. Phần trăm cây bị bệnh khi thiếu B.subtilis RB14 là 85.2%. Khi có
RB14 tỉ lệ cây bệnh giảm lần lượt 16.7%, 27.8%, 11.1%.
Trên canh trường NB và TSB, B.subtilis cho thấy ảnh hưởng kháng lại nhất
với Peronophythora litchi.
B.subtilis YM 10-20 ngăn ngừa sự nảy mầm của bào tử Penicillin roqueforti.
Hiệu suất nảy mầm của Penicillin roqueforti sau 8h ủ không có mặt
B.subtilis YM10-20 là 84%. Ở các tỷ lệ dịch 10, 25, 50% YM10-20, làm giảm
tỷ lệ lần lượt từ 7%, 1% và 0%.
B.subtilis 6051 bảo vệ rễ cây Arabidopsis khỏi sự nhiễm vi khuẩn
Pseudomonas syringae tomato DC 3000 trong điều kiện ống nghiệm và
trong đất màu.
Đáng chú ý hơn cả là Bacillus spp.3 và B.subtilis CEI sản sinh ra dịch ngoại

bào có hoạt tính kháng nấm cao nhất, lần lượt là 78 và 60%. B.subtilis CEI
cho thấy khả năng ngăn cản sự phát trển của F.verticillioides và sản phẩm
fumonisin trong điều kiện in vitro.
Bacillus dòng PY-1 đc phát hiện tính chất hóa sinh, t/c vật lý nhờ phân tích
trình tự 16S rDNA biểu hiện khả năng kháng nhiều loại nấm bệnh thông
thường trong đk invitro.


In total 14 isolates were identified :
7 B.subtilis (B3, B4, B5, B9, B11, B12):3 different subspecies
2 B.pumilus(B6, B10): 2 different different subspecies
1 Brevibacillus Bortelensis (B14)
4 B. cereus (B1, B2, B8, B13,)

R.Sonali from Cotton,
strawberry, potato

Alternaria from potato

Vi khuẩn
B.subtilis

Helmithosporum from
tomato

F.oxysporum from tomamto


1/ Antagonistic effect of B.subtilis isolates (invitro)
(Phương pháp)

 Cấy trong bình rung:
- Môi trường nước thịt : ( peptone 5g/L, nước chiết thịt bò,3gL-1)
- Bình Erlenmeyer 500ml, chứa 10g peptone; 10g glucose; 1g KH2PO4,, 0,5g
MgSO4.7H2O trong nước cất.
- pH : 6.8
- Thời gian (16h)
- Nhiệt độ : 30 C
- Lắc: 200 vòng/phút.
- Thu sinh khối sau 24h, ly tâm ở 5590xg trong 30’.
- Lọc các TB tự do (đường kính lỗ 0,22 m)
- Hai giếng (đường kính 5mm) được tạo ra ở mỗi đĩa (PDA).
- Các giếng này được đổ 200 l dịch ngoại bào. Các nấm được thí nghiệm
đều được đặt tại vị trí trung tâm ở mỗi đĩa. Các đĩa được nuôi trong vòng
3-7 ngày ở 30 C. Đo vùng ức chế.
- Lấy kết quả : đo mật độ quang học ở 550nm, thu số lượng, khối lượng các
chất kháng nấm. Phân tích số liệu dựa hệ thống SAS


2/ Antagonistic effect of B.subtilis isolate B7
(in vivo)
Nấm chuẩn bị là F.oxysporum và R.solani. Bình nuôi để không rung trong
Bóng tối ở 30 C trong 1 tuần.Thể sợi nấm trên bề mặt được tách ra khoảng
894g trong vòng 2’ .

Cấy nấm vào đất theo tỉ lệ 1 lọ nấm tinh sạch ~20ml, 5 ngày trướckhi trồng cà chua.
B.subtilis B7 được nuôi trong môi trường nước thịt và nuôi quađêm ở 30 C, lắc liên
tục ở 200rpm.

1ml môi trường này sẽ được chuyển sang 500 ml bình Erlenmeyer, để qua đêm

ở 30 C và lắc liên tục ở 200rpm. Dịch lỏng được đem ly tâm ở 894g trong 10’ ở 4 C
, các viên tế bào được rửa sạch trong dung dịch muối (0,85%NaCl, pH 7),
sau đó được đem ly tâm lần nữa ở cùng điều kiện.

Thực hiện đo khối lượng tươi và khối lượng khô của các mầm và rễ cây
ở cùng thời gian. Dữ liệu thu được đem phân tích theo hệ thống SAS


3/ Phương pháp phân tích HPLC
(Phân tách các hợp chất kháng nấm từ B.subtilis)
• Khuẩn lạc của B.subtilis được nuôi ở mỗi môi
trường dinh dưỡng, để qua đêm.
• Nhiệt độ 30oC. Lắc 200rpm.
• Sau 24h sinh khối được đem ly tâm 894g/15min ở
20oC.
• Dịch ngoại bào được lọc vô trùng (0.22μm)
• Điều chỉnh pH=HCl. Phần kết tủa được thu lại,
đem hòa tan trong hỗn hợp methanol:
nước(50:50v/v) pH 8, lọc qua màng (0.22μm). Giữ
ở -20oC đến khi phân tích xong


Phương pháp phân tích HPLC
• Tiêm 50μl dịch ngoại bào
của B.subtilis vào zorbax
eclipse cột XDB- C18,
4,6x150mm,5μm( Agilent
technologies,USA) và đo ở
214nm.
• Tốc độ rửa trôi 0,9cm³/min

• Hỗn hợp methanol:
nước(50:50 v/v) trong thời
gian từ 0-20 phút, (80:20
v/v) từ 20-60 phút, (100:0
v/v) từ 60-65 phút và lặp
lại(50:50 v/v) trong 65-75
H. Phân tích HPLC vs B.subtilis B7 phát hiện Iturin phút
( xhien 5 peaks )


E/ Kết quả
 Antagonistic effect (ảnh hưởng đối kháng)
Chủng B1 có ảnh hưởng lớn tới R.solani trên dâu tây (R2), khoai tây(R3)
và Helminthosporum , nhưng ít tác động đến F.oxysporum
 Chủng B8, B7,B11 có tác dụng đối kháng không mấy khác biệt, và là các
chủng ảnh hưởng nhiều nhất, tiếp theo là B1 và B4 trong ức chế nấm
F.oxysporum phát triển.



• Khi nuôi trong bình lắc có chứa một môi trường
với chủng thuần khiết của mỗi B. subtilis phân lập,
bình được ủ ở 30 độ celcius trong 16h.
• Đường cong tăng trưởng điển hình được theo
dõi trong bình lắc bằng cách đo mật độ quang học
là một hàm của thời gian . Tất cả các đường cong
bắt đầu với một pha kéo dài khoảng 2 giờ. Pha
này được theo sau bởi các pha theo cấp số nhân,
trong đó mật độ quang học tăng lên đều đặn theo
thời gian thể hiện một tốc độ tăng trưởng liên tục.

• Pha cần bằng bắt đầu vào cuối pha sinh trưởng ,
sau đó môi trường bước vào giai đoạn suy vong.


 Inhibitory effect

-Chủng B8, B10, B14, B7, B4, B1, B11 và B13 có hiệu lực đối kháng trên
R.solani tách từ dâu tây(R2). B8, B7, B10, B14, B11, B4, B13 và B1 ức
chế theo thứ tự giảm dần sự phát triển của nấm R.solanni thu được từ
khoai tây(R3).
-Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều ảnh hưởng ức chế hơ
trên Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13


-Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều hiệu quả hơn trên
Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13.
- Dịch ngoại bào các chủng B7, B10, B4, B14 không quá khác biệt và
chúng đều là các chủng hiệu lực nhất sau đó đến B1,B3,B8,B13 trong
ảnh hưởng ức chế Alternaria spp trên cây cà chua.


+Chủng B.subtilis B7 có hiệu quả làm giảm tỷ lệ và nguy cơ mắc các bệnh nghiêm
trọng khi nhiễm nấm Fusarium và R.solani, và kích thích sự phát triển của cây cà
chua.
+Khối lượng tươi của thân và lá của cây cà chua ở lô thí nghiệm cao hơn so với
đối chứng. Chiều cao cây, số lượng lá/cây ở lô xử lí với dịch ngoại bào cao hơn so
với đối chứng

Fig 4. Cà chua nhiễm Fusarium

Fig 5. Cà chua nhiễm R.solani


Thảo luận
• Các nghiên cứu về B.subtilis đem đến nhiều ý tưởng và
ứng dụng vk này trong đời sống.
 Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để
diệt nấm gây hại trên cây trồng. VD1996, Asaka và Shoda
cho rằng B.subtilis RB14 có tác dụngức chế chống lại sự
chết rạp cây cà chua con bởi R.solani
 Sư ng trong ngành công nghê sinh c n
t các axit
amin quan ng như: lysine, valine, tyrozine, proline,
threonine, isoleusine, aspastic…
 1999, Marten cho rằng B.subtilis B2 có thể ngăn chặn các
tác nhân gây bệnh truyền qua rễ của thực vật. B. B2
subtilis có thể được sử dụng để sản xuất một loại thực
phẩm có nguồn gốc từ DNJ như là một thực phẩm chức
năng cho bệnh nhân tiểu đường.


Các nghiên cứu ứng dụng liên quan vi
khuẩn B.subtilis
 B.subtilis B2:
-

Ức chế mạnh mẽ tới α-glucosidase. Bản chất kháng sinh
1-deoxynojirimycin (DNJ) là một đường imino với trọng
lượng phân tử 163 Dalton.

 Phương pháp:
-

HPLC (TSKgel amit-80, CH3CN: H2O)
phân tích các hợp chất B2 Bacillus subtilis
Thẩm tách màng, than hoạt tính,
sắc ký CM-Sepharose, và
n
sắc ký lớp mỏng (TLC), khối phổ (MS),
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).


B.Subtilis RB14
•

RB14 Bacillus subtilis, cho thấy hoạt động kháng sinh chống lại các
phytopathogens bằng cách sản xuất các kháng sinh iturin A và surfactin
Iturin A, một lipopeptide,có đặc tính kháng nấm mạnh mẽ và độc tính với động vật
có vú thấp

•

Bacillus subtilis RB14-C chống lại Rhizoctonia solani lây nhiễm cà chua bằng cách
phủ quanh rễ cây và sản xuất iturin.
Sự tích hợp của RB14-C và flutolanil giảm số lượng của flutolanil, với cùng hiệu
quả làm giảm sự xuất hiện bệnh.

•

Ngiên cứu chế phẩm sinh học từ vi
khuẩn có tác dụng diệt nấm
• Tế bào của các chủng vi khuẩn đối kháng Burkholderia,
Pseudomonas và Bacillus tác dụng tích cực đến sinh trưởng của rau diếp và
cà chua. Ko ảnh hưởng tốc độ nảy mầm và sự phát triển của rễ, lá ( khi nuôi
trong nhà lưới)
• Trong điều kiện in vitro trên môi trường thạch, dịch ngoại bào của chủng vi
khuẩn đối kháng này diệt 70-90% nấm F. oxysporum, và diệt 75-81%
nấm R. solani.

A. R.solani hại rau diếp
B. Rau diếp nhiễm nấm R. solani được xử với dịch ngoại bòa chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc.
C. Rau diếp nhiễm nấm R.solani được xử với tế bào chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc.


Tài liệu tham khảo:
• Asian Network for scientific Information
• http//:TextbookofBaterial.com/Genus
Bacillus
• The Korean Society of Biology.
• Việncôngnghệsinhhọc/tài liệu tham khảo.