Ligate chain reaction (LCR)

Ligate chain reaction (LCR)
Học viên:
Giảng viên:
ĐH khoa học tự nhiên - ĐH Quốc gia


Các phương pháp PCR



PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng để phát hiện các bệnh
rối loạn di truyền do vi khuẩn, virus và các mầm bệnh



Các phương pháp PCR



Self-sustained sequence replication (3SR)



Q-beta replicase (QI3)



Tigase chain reaction (LCR)

=> Trong đó LCR có nhiều triển vọng nhất

Phương pháp LCR


Là một phương pháp khuếch đại DNA tương tụ như PCR



LCR khuyếch đại cặp đầu dò không cần sự kéo dài chuỗi nucleotit



Sử dung 2 mồi/sợi và ligate 2 mồi đó



LCR sử dụng 2 enzym: DNA polymease và DNA ligase


Nhuyên tắc của phương pháp LCR



Nguyên tắc của LCR sử dụng 4 đoạn oligonucleotides
Hai oligonucleotides liên kết độc nhất lai với một sợi ADN mục tiêu và một bộ bổ
sung các oligonucleotides liền kề, kết hợp với sợi dây đối diện

• Đường giao nhau của hai primer thường được định vị sao cho nucleotide ở 3 đầu của
primer trên trùng với nuclotit sai khác có thể xảy ra với cặp base-pair trong chuỗi mục
tiêu

• Sự khác biệt này có thể xác định hai allel khác nhau, các loài hoặc sự đa hình cá thể


Nguyên tắc phương pháp LCR
• Nếu nucleotide mục tiêu ở vị trí đó bổ sung oligonucleotide vào đầu 3’ của
mồi, cặp mồi trên cùng 1 sợi sẽ ligase với nhau
• Nếu không có sự liên kết tại điểm mục tiêu, nó sẽ tạo ra sự khác nhau bởi
ligase có khả năng chịu nhiệt và các đầu dò sẽ không bị ligate
• Sự vắng mặt của sản phẩm ligated đã chứng tỏ có sự thay đổi ít nhất 1
nucleotit.


Thành phần của phản ứng LCR








DNA khuôn
Enzym polymerase
dNTPs
Các dung dịch đệm
Thermo-cycler (máy PCR)
4 đầu dò DNA
Các thành phần đánh dấu phóng xạ hoặc các dye huỳnh quang

=> Độ chính xác của phản ứng phụ thuộc vào thiết kế đầu dò và các điều

kiện phản ứng phù hợp


Điều kiện phản ứng LCR
Điều kiện: trong 50 ul phản ứng
- Nồng độ 25 and 200 fmol mỗi mồi



- Đệm phản ứng: 50 mM Tris-HC1 at pH 7.6, 100 mM KC1, 10 mM MgC12, 1 mM EDTA, 10 mM
dithiothreitol, 1 mM NAD +, 20 ~g of salmon sperm DNA)



75 nick-closing units củaThermus aquaticus DNA ligase



Bổ sung 0.01-0.1% Triton X-100 tạo ra tỷ lệ ligation cao hơn nhưng làm tăng nhẹ sự bắt cặp sai



Các chu kỳ phản ứng thường là 15 giây cho 1 lần tưới ở 94 ~ cho biến tính



Và 4 phút đến 6 lần tướiở 60-65oC (lý tưởng là 5oC dưới Tm thấp nhất của primer).


Phản ứng LCR

Gồm 3 bước chính:
• Biến tính: nhiệt DNA kép để biến tính nó thường ở 950C trong vài phút
• Lai với đầu dò: Thẩm thấu các đầu dò tới đích DNA (ở 60oC)
• Ligation: Kết nối các đầu dò bằng ligase DNA có khả năng chịu nhiệt. (ở 65oC).


Phương pháp LCR


Phương pháp LCR


Phương pháp phát hiện sản phẩm LCR
Cách 1: Đánh dấu phóng xạ 32P ở đầu 3 end của mồi
Tách LCR và mồi bằng điện di
Sản phẩm LCR được phát hiện bằng autoradiography
Cách 2: Winn-Deen phát hiện bằng cách kết hợp DNA huynh quang với GENESCANNER
Định lượng dễ dàng sản phẩm LCR
Phân loại các sản phẩm ligation khác nhau
Sau đó, các sản phẩm LCR được phát hiện ở dạng Southern blot sau khi tách gel điện hoặc sử dụng khay
giếng vi thể (microtiter plates)


Ưu nhược điểm



Khả năng khuyeecs đại cao, ít cho sản phẩm phụ 



Tiết kiệm thời gian

LCR rất hữu ích để xác định nucleotide ở một vị trí cụ thể mà tại có có
thay đổi là duy nhất


Một số bộ kít LCR


Bộ LCR thương mại, hệ thống Abbott LCx ít bị ảnh hưởng bởi chất ức
chế trong một số mẫu vật

• Nhiều mẫu có thể được phân tích bằng LCR nhanh hơn so với các phương
pháp phân lập
• Một xét nghiệm miRNA đơn giản và nhạy cảm đã được phát triển với phản
ứng chuỗi ligase (LCR) dựa trên sự kết hợp cụ thể của các đầu dò DNA bằng
cách sử dụng các miRNA như các mẫu.
• Một mẫu đơn có thể được sử dụng để phát hiện nhiều mầm bệnh khác
nhau, cung cấp các đầu dò phù hợp
• Có thể lấy mẫu xét nghiệm dễ dàng như nước tiểu cho các mục đích chẩn
đoán, làm sàng lọc cho một số lượng lớn người thực tế.


Một số phương pháp tương tự LCR


Ligase detection reaction (LDR)



Principle of pLCR



Principle of G-LCR


Ligase detection reaction (LDR)


Principle of pLCR


Principle of G-LCR


Các ứng dụng của LCR
Đích

Phương pháp

Trích dẫn

LCR, isotopic

Barany

PCR-LCR, fluorescent

Feero et al. ~3~

Genetic diseases
β-sickle cell
hemoglobinemia
Hyperkalemic periodic
paralysis

Wang et al. r

Phát triển các xét nghiệm ung
thư, vi khuẩn, virus

Bacteria
Borrelia burgdorfer

LCR, nonisotopic

Hu et al.

Neisseria gonorrhoeae

G-LCR, nonisotopic

Birkenmeyer and Mmstrong

Human papillomavirus

LCR, nonisotopic

Bond et al.

HIV DNA

LCR, nonisotopic

Carrino and Laffler

Viruses


Triển vọng trong tương lai


Sàng lọc đa hình bệnh trên quần thể lớn



Xác định HLA haplotypes trong mô



Sàng lọc nhiều loài vi khuẩn sau khi khuếch đại PCR trong vùng 16s
rRNA



Có lợi thế cho tự động hóa sàng lọc

Tài liệu tham khảo


1. Erlich, H.A., D. Gelfand, and J.J. Sninsky. 1991. Recent advances in the
polymerase chain




reaction. Science 252: 1643-1650.



1990. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a
multienzyme reaction modeled




after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1874-1878.



4. Barany, F. 1991. Genetic disease detection and DNA amplification
using cloned thermostable




ligase. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193.

2. Guatelli, J.C., K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh, K.J. Barringer, D.D. Richman,
and T.R. Gingeras.

3. Kramer F.R. and P.M. Lizardi. 1989. Replicatable RNA reporters. Nature
339: 401-402.

5. Barany, F. 1991. The ligase chain reaction in a PCR world. PCR
Methods Applic. 1: 5-16.




Cảm ơn mọi người đã lắng nghe