LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE
NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
TRÊN HEO (PRRS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC
ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH
SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS)
Chuyên ngành

: Công Nghệ Sinh Học

Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn Khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE
NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
TRÊN HEO (PRRS)
ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS.TS. TRẦN ĐÌNH TỪ
Hội Thú y Việt Nam

2. Thư ký:

TS. NGUYỄN ĐÌNH QUÁT
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

3. Phản biện 1:

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

4. Phản biện 2:

PGS.TS TRẦN THỊ DÂN
Hội Thú y Việt Nam

5. Ủy viên:

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên Đặng Ngọc Thùy Dương sinh ngày 16 tháng 11 năm 1983 tại Tp.
Long Xuyên, tỉnh An Giang. Con ông Đặng Hoàng Hải và Bà Lê Thị Cam.
Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTH chuyên Thoại Ngọc Hầu,
tỉnh An Giang năm 2001.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học
Nông Lâm Tp.HCM năm 2005.
Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học
Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: độc thân.

Địa chỉ liên lạc: 477/36 Kinh Dương Vương – Phường An Lạc – Quận Bình
Tân – Tp.HCM.
Điện thoại: 0958.172.034
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các
số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn,

Đặng Ngọc Thùy Dương

iii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc
đến:
* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ
trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn
Công Nghệ Sinh Học và Phòng Sau Đại Học.
* PGS. TS. Trần Thị Dân đã bước đầu hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên
cứu.
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường –
trường ĐHNL Tp.HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn

thành luận văn.
* Các anh chị phòng huyết thanh, chi cục Thú Y Tp.HCM.
* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn,
Đặng Ngọc Thùy Dương

iv


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc
và thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được
tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm
Tp.HCM từ tháng 7/2008 – 8/2009. Đề tài được thực hiện với 3 nội dung nghiên
cứu nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS
vaccine nhược độc để phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh và nghiên cứu
sự đa dạng di truyền của PRRSV. Các kết quả thu được như sau:
Quy trình RT-PCR phát hiện các chủng virus PRRS khác nhau dựa vào
vùng ORF7 đã xác định được 12 mẫu dương tính với PRRSV trong tất cả 18 mẫu
khảo sát. Cặp primer P71/P72 tham khảo Murtaugh và Elam (1996) cho phép xác
định dương tính PRRSV với cả 2 genotype Bắc Mỹ và châu Âu trong điều kiện thí
nghiệm.
Phương pháp RT-PCR-RFLP dựa trên đoạn ORF5 đã được ứng dụng thành
công để chẩn đoán phân biệt 11 chủng virus PRRS thực địa và PRRS vaccine. Cả 4
loại enzyme MluI, HincII, SacII và HaeIII đều có thể sử dụng riêng lẻ để phân biệt
virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine thuộc genotype Bắc Mỹ. Phân tích
RFLP bằng phần mềm Chromas Pro cho thấy sự kết hợp các enzyme PstI, HaeII,
HincII hay ClaI, HaeII, HincII sẽ có thể giúp phân biệt virus PRRS vaccine với
virus PRRS thực địa thuộc genotype châu Âu dựa trên ORF5.

Phân tích đa dạng di truyền dựa vào cây sinh dòng được xây dựng trên kết
quả giải trình tự vùng ORF5 của 12 chủng PRRSV xác định được trong nghiên cứu
bằng phần mềm MEGA 4.1 và DNAStar. Dựa trên ORF5, 12 mẫu virus PRRS xác
định được đều thuộc genotype Bắc Mỹ, không có mẫu thuộc genotype châu Âu.
Các chủng này nằm cùng nhóm với các chủng độc lực cao của Trung Quốc và
chủng 07QN đã được phân lập tại Việt Nam 2007 với độ tương đồng di truyền ở
mức 98 – 98,7 % và có khác biệt với chủng virus PRRS vaccine nhược độc Besta
hiện đang được sử dụng tại Việt Nam với độ tương đồng di truyền ở mức 85,9 –
86,7 %.
v


SUMMARY
Research project “Differentiation of a porcine reproductive and
respiratory syndrome virus vaccine strain from field isolates by restriction
fragment length polymorphism analysis of ORF5” was carried out at Institute of
Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from
7/2008 to 8/2009. The project was aimed to distinguish a PRRSV MLV-vaccine
from PRRSV field isolates by RT-PCR-RFLP analysis of ORF5 and to study
genetic variation of ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
isolates.
The results were summarized as follows:
12 field isolates and 2 MLV-vaccine could be detected by RT-PCR when
primers from ORF7 were used for amplification. These primers could detect both
NA genotype and EU genotype.
RT-PCR-RFLP analysis for differentiating a porcine reproductive and
respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine strain from isolated strains was
succeeded. ORF5 was amplified for each genotype. The restriction enzymes such as
MluI, HincII, SacII, HaeIII were used to cut NA genotype and none of the field
isolated had a similar cutting pattern when compared to modified live virus vaccine.

Using Chromas Pro for RFLP analysis, combining PstI, HaeII, HincII or ClaI,
HaeII, HincII could help to differentiate a PRRSV vaccine strain from EU isolated
strains.
Twelve isolates of PRRSV were studied and compared with several PRRSV
isolates from other countries. Phylogenetic analysis showed that all isolates of
PRRSV in this study belong to the NA genotype. Sequence analysis revealed that
these isolates shared a close relationship with high virulent of Chinese PRRSV in
2006 and 07QN isolated in Quang Nam, VietNam (98 – 98,7 %). However, these
twelve isolates shared only 85,9 – 86,7 % nucleotide sequence identities with that of
the MLV-Besta.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang Chuẩn Y ......................................................................................... i
LÝ LỊCH CÁ NHÂN .............................................................................. ii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................ iv
TÓM TẮT ............................................................................................... v
SUMMARY ........................................................................................... vi
MỤC LỤC ............................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................... xii

Chương 1. Mở đầu
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2
1.3 Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 2

Chương 2. Tổng quan tài liệu
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) ............................................ 3
2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh .................................................................................. 3
2.1.2 Đặc điểm bệnh ............................................................................................... 4
2.1.3 Virus PRRS ................................................................................................... 5
2.1.3.1 Phân loại................................................................................................. 5
2.1.3.2 Kích thước và hình thái học ................................................................... 6
2.1.3.3 Cấu trúc gen ........................................................................................... 7
2.1.3.4 Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ ....... 8
2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc ..................................... 9
2.1.3.6 Virus PRRS vaccine............................................................................. 11

vii


2.1.4 Vaccine phòng bệnh do virus PRRS .......................................................... 13
2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS ở Việt Nam ...................................... 15
2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS ............................................................. 16
2.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh .................................. 16
2.2.2 Phương pháp RT-PCR................................................................................. 17
2.2.3 Phương pháp RFLP ..................................................................................... 18
2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự ................................................................... 18
2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở nước ngoài ....... 19
2.4 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở trong nước ....... 21
Chương 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ............................................................................ 23
3.1.1 Thời gian ....................................................................................................... 23
3.1.2 Địa điểm ........................................................................................................ 23
3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 23
3.3 Vật liệu và hóa chất ............................................................................................... 23
3.3.1 Nguồn mẫu .................................................................................................... 23
3.3.2 Hóa chất......................................................................................................... 25
3.3.2.1

Hóa chất để tách chiết RNA.................................................................. 25

3.3.2.2

Hóa chất trong phản ứng RT- PCR ....................................................... 25

3.3.2.3

Hóa chất điện di .................................................................................... 25

3.3.2.4

Hóa chất để tinh sạch sản phẩm RT-PCR ............................................. 25

3.3.2.5

Hóa chất dùng trong RFLP ................................................................... 25

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 26
3.4 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................... 26
3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR .................... 26

3.4.1.1

Ly trích RNA từ huyết thanh ................................................................ 26

3.4.1.2

Khuếch đại gen ORF7 ........................................................................... 26

3.4.2 Phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine bằng kỹ thuật
RT - PCR - RFLP trên đoạn ORF5. .............................................................. 27
3.4.2.1

Khuếch đại gen ORF5 .......................................................................... 28

viii


3.4.2.2

Tinh sạch sản phẩm RT-PCR................................................................ 29

3.4.2.3

Phân tích RFLP ..................................................................................... 29

3.4.3 Thiết lập cây sinh dòng dựa trên trình tự ORF5 của các chủng PRRSV ...... 30
3.4.3.1

Giải trình tự gen ORF5 ........................................................................ 30

3.4.3.2

Phân tích trình tự nucleotide, thiết lập cây sinh dòng .......................... 31

Chương 4. Kết quả và thảo luận
4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR ......................... 33
4.2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP trên
đoạn ORF5 .......................................................................................................... 34
4.2.1 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype châu Âu ............................................ 34
4.2.2 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype Bắc Mỹ............................................. 36
4.2.3 Phân tích RFLP ............................................................................................. 36
4.2.3.1

Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype châu Âu ...... 37

4.2.3.2

Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype Bắc Mỹ ....... 42

4.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng ORF5 ............................................... 45
4.4 Giả thuyết nguồn gốc của các chủng PRRSV tại Tp.HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu
và Đồng Nai......................................................................................................... 51
Chương 5. Kết luận và đề nghị
5.1 Kết luận .............................................................................................................. 53
5.2 Đề nghị .................................................................................................... 53
Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 55
Phụ lục ............................................................................................................. 63

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa: amino acid
EAV: Equine Arteritis Virus
ELISA: Enzyme Linked-Immunosorbent Assay
EU: Europe
E: Envelope
GP: Glycoprotein
IFA: Indirect Immunofluorescent Antibody
IMPA: Immunoperoxidase Monolayer Assay
LDV: Lactate Dehydrogenase Virus
LV: Lelystad Virus
M: Membrane
N: Nucleocapsid
NA: North American
Nsp: Nonstructural protein
Nu: Nucleotide
OIE: Office International des Epizooties (World organization for animal health)
ORF: Open Reading Frame
PEARS: Porcine Epidemic and Respiratory Syndrome
PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
RE: Restriction Enzyme
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
RFS: Ribosomal frame shifting
RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
S/P: Sample/Positive
SHFV: Simian Hemorrhagic Fever Virus
SIRS: Swine Infertility and Respiratory Syndrome

SVN: Serum Virus Neutralization

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 So sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus PRRS vaccine với
virus PRRS gốc và 16 chủng phân lập ............................................. 12
Bảng 3.1 Các chủng virus PRRS trong nghiên cứu ..................................... 24
Bảng 3.2 Primer sử dụng để khuếch đại vùng ORF5 ................................... 28
Bảng 3.3 Các chủng virus PRRS được giải trình tự ..................................... 31
Bảng 3.4 Các chủng virus PRRS tham khảo trên thế giới ........................... 32
Bảng 4.1 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro ................ 38
Bảng 4.2 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro ............ 40
Bảng 4.3 Mã hóa code các enzyme .............................................................. 41
Bảng 4.4 Tổng hợp kiểu RFLP của các chủng virus PRRS genotype châu Âu...... 41
Bảng 4.5 ORF5 RFLP code của các chủng PRRSV xác định được ............ 44

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các quốc gia khác nhau ..............6
Hình 2.2 Mô hình các protein cấu trúc PRRSV ..............................................7

Hình 2.3 Cấu tạo bộ gen của PRRSV .............................................................8
Hình 3.1 Sơ đồ các bước thực hiện để phân biệt chủng virus PRRS vaccine
và virus PRRS thực địa bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP ................ 30
Hình 4.1 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF7 ................................................ 33
Hình 4.2 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF5 genotype châu Âu .................. 35
Hình 4.3 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF5 genotype Bắc Mỹ ................... 36
Hình 4.4 Kết quả phân tích RFLP vaccine Porcillis .................................... 37
Hình 4.5 Kết quả phân tích RFLP vaccine Porcillis .................................... 39
Hình 4.6 Kết quả phân tích RFLP genotype Bắc Mỹ .................................. 42
Hình 4.7 Sự thay đổi aa vị trí 137 ................................................................ 43
Hình 4.8 Cây sinh dòng của virus PRRS dựa trên vùng ORF5 ................... 48
Hình 4.9 Cây sinh dòng của virus PRRS dựa trên vùng ORF5 ................... 49

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp – PRRS (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome) – được xem là một bệnh nghiêm trọng ở heo, với biểu hiện
sẩy thai ở heo nái và triệu chứng hô hấp trên heo thịt. Từ khi được phát hiện lần đầu
tiên ở Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989; Hill, 1990) và ở châu Âu, châu Á vào
đầu những năm 90 của thế kỷ 20 , hội chứng này đã nhanh chóng phát triển thành
dịch ở nhiều nơi trên khắp thế giới (Meredith, 1995).
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ
(Phòng dịch tễ, Cục thú y Việt Nam). Từ đó, PRRSV đã nhanh chóng lây lan và

nhiều lần bùng phát thành dịch, gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến ngành chăn
nuôi và đời sống của hàng ngàn hộ dân Việt Nam.
Để phòng bệnh, vaccine nhược độc đã được sử dụng. Đây là loại vaccine
sống nên khi vào cơ thể heo, virus được nhân lên và tồn tại trong nhiều tuần, thậm
chí trong vài tháng (Mengeling và ctv, 1996). Các kỹ thuật phát hiện virus hiện có ở
VN như ELISA hay RT-PCR vẫn chưa có khả năng phân biệt được virus PRRS trên
heo có nguồn gốc từ virus vaccine hay virus thực địa. Vì vậy, cần phải có một
phương pháp giúp xác định được virus trên heo có nguồn gốc từ loại virus nào để
kiểm soát dịch bệnh hữu hiệu hơn, từ đó nâng cao hiệu quả quản lý phòng dịch ở
cấp độ vĩ mô.
Nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc và thực địa
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được tiến hành nhằm
xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine
nhược độc để phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh PRRS. Hơn nữa nghiên

1


cứu cũng tìm hiểu sự biến đổi nếu có của các chủng virus PRRS trong mẫu khảo sát
qua việc phân tích sự phát sinh loài của các chủng PRRSV thực địa.
1.2.

Mục tiêu nghiên cứu

-

Xác định quy trình RT-PCR phát hiện các genotype virus PRRS khác nhau.

-

Phân biệt virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa bằng kỹ thuật RTPCR-RFLP.

-

Phân tích đa dạng di truyền và biến chủng dựa vào kết quả giải trình tự
ORF5 của virus PRRS thu nhận từ các loại mẫu khảo sát.
1.3.

-

Mục đích nghiên cứu

Phân biệt được heo chủng ngừa PRRSV và heo nhiễm PRRSV thực địa góp
phần nâng cao hiệu quả quản lý phòng chống dịch bệnh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS)
2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh
Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (Porcine reproductive and respiratory
syndrome – PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên ở Hoa Kỳ trước khi lan rộng khắp
Bắc Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989; Hill, 1990). Vào thời điểm này, bệnh được
gọi là “bệnh bí ẩn trên heo” vì tác nhân gây bệnh chưa được xác định. Cuối năm
1990, trận dịch PRRS đầu tiên ở châu Âu đã nổ ra tại Đức và nhanh chóng lan ra
khắp châu Âu sau đó. Giữa tháng 1 năm 1991, bệnh được ghi nhận ở Hà Lan trên
đàn heo giống, và đến cuối tháng 3 cùng năm, bệnh đã lan rộng khắp các trang trại
nuôi heo (Meredith, 1995). Ở châu Á, trận dịch PRRS đầu tiên xuất hiện ở Nhật

vào năm 1988 và được ghi nhận ở Đài Loan năm 1991. Như vậy, đến năm 1994, hội
chứng rối loạn sinh sản hô hấp đã chính thức xuất hiện ở 16 nước và rộng khắp ở cả
3 châu lục: châu Mỹ, châu Á, và châu Âu.
Tại châu Âu, vào năm 1991, tác nhân gây ra hội chứng PRRS đã lần đầu tiên
được phân lập trên đại thực bào bởi Wensvoort và cộng sự, và được gọi là virus
Lelystad (LV). Ngay sau đó, năm 1992 tại Mỹ, virus gây bệnh (ATCC VR-2332)
cũng đã được phân lập bởi Collins và cộng sự và được định danh là virus gây hội
chứng vô sinh và hô hấp trên heo (swine infertility and respiratory syndrome (SIRS)
virus). Đến tháng 9 – 2006, bệnh này đã xảy ra đại dịch ở Trung Quốc làm hàng
triệu heo bị mắc bệnh và trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của virus
thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây chết rất nhanh trên heo.
Từ khi xuất hiện, bệnh này đã được gọi nhiều tên khác nhau như: bệnh bí ẩn
trên heo, hội chứng vô sinh và hô hấp trên heo (SIRS), hội chứng sẩy thai dịch vùng

3


và hô hấp trên heo (PEARS), bệnh heo tai xanh. Tuy nhiên, đến năm 1992, tại hội
nghị quốc tế về bệnh này ở St. Paul, Minnessota, Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã
nhất trí sử dụng tên chung của bệnh này là “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở
heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS).
2.1.2 Đặc điểm bệnh
Đầu tiên, PRRS bùng nổ trên thế giới với mức tàn phá dữ dội như gây sẩy
thai hàng loạt ở heo nái hay triệu chứng hô hấp trên heo con. Heo ở mọi lứa tuổi
đều có thể mắc bệnh. Bệnh rõ hơn trên heo nái mang thai, nái nuôi con, heo con
theo mẹ và tăng trưởng khi bệnh xâm nhập vào đàn lần đầu tiên.
Heo có thể cảm nhiễm qua đường miệng, mũi, sinh dục hay thông qua tiêm
bắp, tiêm phúc mạc. Khả năng gây bệnh của virus này rất cao, thí nghiệm đã chứng
minh chỉ cần 10 virion là có thể gây nhiễm cho heo qua đường mũi hoặc tiêm bắp
(Straw và ctv, 1999).

Trên heo nhiễm bệnh và chết, tất cả các phủ tạng đều có độc lực. Máu chứa
virus rất sớm, trong vòng 12 – 24 giờ sau khi nhiễm. Hạch amidan và hạch bạch
huyết chứa nhiều virus vì đây vốn là nơi nhân lên đầu tiên của virus PRRS. Virus có
thể tồn tại trong vùng miệng hầu họng đến vài tháng sau khi nhiễm.
Sau khi virus vào cơ thể, có sự bài thải virus qua nước bọt, nước tiểu và tinh
dịch. Sự bài thải virus qua phân cũng được ghi nhận nhưng được xem là không liên
tục. Bởi vì virus PRRS có thể gây ra tình trạng mang trùng và nhiễm dai dẳng nên
cần phải lưu ý sự thải virus sau nhiễm. Sự thải virus có thể diễn ra trong 2 – 3 tháng
sau đó.
Do virus tồn tại ở vùng hầu – họng rất lâu sau khi nhiễm nên các chất tiết
vùng mũi, miệng đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh. Sự truyền ngang
do tiếp xúc “từ mõm sang mõm” là con đường truyền lây phổ biến. Bệnh có thể lây
lan qua vết cắn, đó là hành vi thường xảy ra trên đàn heo có heo mới nhập đàn.

4


Nhìn chung, do khả năng truyền lây của virus PRRS tương đối mạnh nên khi
không có biện pháp quản lý phòng ngừa bệnh tốt thì bệnh sẽ bùng nổ và gây thiệt
hại lớn về mặt kinh tế.
2.1.3 Virus PRRS
2.1.3.1

Phân loại

Virus gây ra hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo thuộc giống
Arterivirus, họ Arteriviridae và bộ Nidovirales. Những virus thuộc nhóm họ
Arteriviridae bao gồm EAV (equine arteritis virus) gây viêm động mạch ngựa, LDV
(lactate dehydrogenase elevating virus) gây tăng enzyme khử hydro của lactate trên
chuột và SHFV (simian hemorrhagic fever virus) gây sốt xuất huyết ở khỉ. Những

virus thuộc họ này có những đặc điểm chung sau:
(1) Gây nhiễm dai dẳng, không có biểu hiện triệu chứng và thường gây chết
(Plagemann và Moenning, 1992).
(2) Có khả năng xâm nhiễm và nhân lên trong đại thực bào (Plagemann và
Moenning, 1992)
(3) Có khả năng biến đổi gen rất lớn (Chang và ctv, 2002).
Các chủng virus PRRS phân lập được cho thấy PRRSV có quan hệ gần về
mặt sinh học, cấu trúc, và về gen với LDV hơn là EAV (Meulenberg và ctv, 1993;
Meng và ctv, 1995). Những nghiên cứu về kháng thể đơn dòng và đa dòng đã chứng
minh được giữa virus PRRS ở Bắc Mỹ và châu Âu có sự khác nhau về kháng
nguyên (Drew và ctv, 1995; Magar và ctv, 1997) và thậm chí giữa những chủng
PRRSV Bắc Mỹ phân lập được cũng có sự khác nhau (Magar và ctv, 1995). Hơn
nữa, những nghiên cứu về trình tự cũng cho thấy những chủng phân lập ở Bắc Mỹ và
ở châu Âu đã chia làm 2 nhánh riêng biệt. Do đó, hiện nay PRRSV được chia làm 2
genotype:
¾ Genotype châu Âu (EU)
¾ Genotype Bắc Mỹ (NA)

5


Theo Mardassi và ctv (1994) và Meng và ctv (1995), sự tương đồng về trình
tự nucleotide giữa virus thuộc genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ chỉ khoảng
67 %.

Chủng Châu
Âu (PRRSV- EU)
Genotype
châu Âu

PRRSV- NA

Đức
Lelystad virus
Lithuania
Genotype
ChủngBắc
BắcMỹ
Mỹ (PRRSV-NA)

Châu Á
Bắc Mỹ

Hình
2.1:
Cây
sinh
dòng
khác
nhau
Hình
2.1:
Cây
sinh
dòngcủa
củacác
cácchủng
chủngPRRSV
PRRSVtừtừcác
cácquốc

nướcgia
khác
nhau
(xây
dựng dựa trên vùng ORF5)
(dựa trên vùng ORF5)
(www.porcilis-prrs.com/images/virus-structure.jpg)

(www.porcillis-PRRS.com/images/virus-structure.jpg)

2.1.3.2 Kích thước và hình thái học
Virus PRRS là một RNA virus, có vỏ bọc với đường kính 50 – 65 nm, bề
mặt nhẵn, và lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm. Trong đại thực
bào của phổi heo, virus PRRS hình cầu, kích thước 45 – 65 nm, lõi capsid 30 – 35
nm và màng kép lipid trơn láng bao bọc bên ngoài.

6


RNA
Protein N (ORF7) – 15kDa
Protein E (ORF5) – 24 - 26kDa
Protein (ORF4) – 30 - 40kDa
Protein M (ORF6) – 18 - 19kDa
Vỏ lipid
Hình
2.2:Mô
Môhình
hìnhcác
cácprotein

proteincấu
cấutrúc
trúcPRRSV
PRRSV
Hình
2.2:
(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)
(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)

2.1.3.3 Cấu trúc gen
Bộ gen của virus PRRS cũng tương tự như các Arterivirus khác về mặt tổ
chức (Snijder và Meulenberg, 1998). RNA virus có chiều dài 15,1 kb, dạng thẳng, 1
mạch. Bộ gen chứa 9 vùng ORF mã hóa cho những protein đặc hiệu của virus.
ORF1a và ORF1b chiếm 75 % bộ gen (12 kb tính từ đầu 5’) và mã hóa cho
protein không cấu trúc (nsp). Những protein từ hai vùng này sẽ tham gia vào quá
trình chuyển hóa để tạo thành 12 protein nhỏ hơn nhờ protease do virus tạo ra. Chức
năng chính xác của các protein này vẫn chưa được hiểu hết, chỉ biết rằng chúng liên
quan đến việc mã hóa RNA và dịch mã.
Bảy vùng ORF nhỏ còn lại (ORF2 – ORF7) nằm ở đầu cuối 3’ của bộ gen và
mã hóa cho những protein cấu trúc (Dee và Joo, 1994; Dea và ctv, 2000). Protein
nucleocapsid (N) được mã hóa ở vùng ORF7 và protein màng (M) được mã hóa ở
vùng ORF6 là các protein không được glycosyl hóa. Ngược lại, GP2a (mã hóa bởi
ORF 2a), GP3 (mã hóa bởi ORF 3), GP4 (mã hóa bởi ORF 4), và GP5 (mã hóa bởi
ORF5) là những protein được glycosyl hóa. Gần đây, phát hiện thêm một protein
mới được mã hóa bởi một vùng nằm trong đoạn ORF2 (được gọi là vùng ORF2b).

7


Vùng ORF2b này mã hóa cho một protein nhỏ không glycosyl hóa, được gọi là

protein 2b ở PRRSV và protein E ở EAV (Snijder và ctv, 1999; Wu và ctv, 2001).
Gen mã hóa RNA polymerase

Các gen cấu trúc

ORF 1a
ORF 1b

3’

Hình
2.3:Cấu
Cấutạo
tạobộ
bộgen
gencủa
củaPRRSV
PRRSV
Hình 2.3:
(www.porcilis-prr.com/pathohenesis-PRRS.asp)
(www.porcillis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)
(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)
Trong đó:
Nsp 1- 12
GP 2, GP3, GP4:
E (GP5)
:
M
:
N

:

2.1.3.4

: Protein không cấu trúc
(ORF1a, ORF1b)
Protein màng – Glycoprotein (ORF2a, ORF3, ORF4)
Protein của vỏ ngoài
(ORF5)
Protein gian màng
(ORF6)
Protein của capsid
(ORF7)

Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ

Những nghiên cứu về trình tự virus hai genotype châu Âu và Bắc Mỹ cho
thấy chúng ít tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid (Suarez và ctv, 1996;
Nelsen và ctv, 1999; Allende và ctv, 1999). Protein GP5 (do vùng ORF5 mã hóa) là
protein có cấu trúc thay đổi nhiều nhất, chỉ khoảng 51 – 55 % trình tự amino acid

8


giống nhau giữa hai genotype, trong khi đó protein M (do vùng ORF6 mã hóa) có
cấu trúc ổn định nhất, với sự tương đồng giữa khoảng 78 – 81 %.
So sánh chi tiết trình tự nucleotide trên vùng ORF1 của virus Lelystad (LV)
ở châu Âu và 2 chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ (Allende và ctv, 1999) đã cho
thấy nhiều khác biệt trong vùng gen này, đặc biệt là các khác biệt nằm trên nsp2
(protein không cấu trúc 2). Protein nsp2 của genotype Bắc Mỹ dài hơn nsp2 của LV

khoảng 102 amino acid, hơn nữa, trình tự amino acid tương đồng giữa 2 genotype
này chỉ đạt khoảng 32 %.
2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc
Trong những năm gần đây, dòng virus PRRS của Trung Quốc đã được nhắc
đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết cao. Tuy nhiên, bệnh PRRS đã xuất hiện ở
Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to
lớn cho ngành công nghiệp chăn nuôi heo của quốc gia này (Chen và ctv, 2006).
PRRSV được các nhà khoa học Trung Quốc đưa vào nghiên cứu và phân lập
từ năm 1996. Đến năm 2001, trình tự bộ gen PRRSV đã được giải mã trọn vẹn và
công bố lần đầu tiên bởi Yang và ctv (2001). Nhiều công trình sau đó được thực
hiện nhằm nghiên cứu sự phân dòng và sự đa dạng địa lý của các genotype PRRSV
phân bố trên khắp Trung Quốc đại lục (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và
ctv, 2007; Tian và ctv, 2007). Kết quả của các nghiên cứu này đã cung cấp những
thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV Trung Quốc với các chủng
virus khác trên thế giới và thiết lập những giả thiết ban đầu cho sự tiến hóa của
PRRSV tạo ra các chủng virus độc lực cao như hiện nay.
Đặc điểm về bộ gen của hai chủng PRRSV Trung Quốc HB-1 và HB-2 bước
đầu được miêu tả và so sánh với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ và châu Âu
trong nghiên cứu của Gao và ctv vào năm 2004. Hai chủng HB-1 và HB-2 đều có
tỷ lệ tương đồng cao (89,4 – 89,6 %) với chủng virus PRRS đại diện cho genotype
Bắc Mỹ (VR-2332) và chủng Trung Quốc BJ-4 được nghiên cứu trước đó, trong khi
đó chỉ tương đồng khoảng 54,3 – 54,7 % với chủng virus PRRS đại diện cho

9


genotype châu Âu (Lelystad virus). Điều này đã chứng minh là hai chủng virus HB1 và HB-2 đều nằm trong nhóm genotype Bắc Mỹ. Ngoài ra nghiên cứu còn phát
hiện một vùng đột biến mất đoạn 12 aa ở nsp2 thuộc dòng HB-2 khi so sánh với các
chủng thuộc genotype Bắc Mỹ khác và khẳng định đây là một chủng virus PRRS
mới.

Năm 2006, nghiên cứu của Chen và cộng sự trên đoạn GP5 do OFR5 mã hóa
của 13 chủng PRRSV Trung Quốc cho thấy chỉ có 1 chủng tương đồng với
genotype châu Âu, 12 chủng còn lại đều tương đồng với genotype Bắc Mỹ. Trong
12 chủng này, các tác giả ghi nhận đến 6 chủng tương đồng cao với virus PRRS
vaccine nhược độc và với chủng VR-2332. Kết quả này đã đặt ra giả thiết cho sự
tiến hóa của một số chủng PRRSV từ vaccine virus tạo ra các thể gây độc và làm
giảm hiệu quả tiêm chủng của các vaccine nhược độc này ở Trung Quốc.
Công trình của An và cộng sự (2007) khẳng định lại sự liên hệ giữa các dòng
PRRSV Trung Quốc với PRRSV nguồn gốc Bắc Mỹ và virus vaccine nhược độc.
Trong 42 trình tự GP5 của các chủng PRRSV nghiên cứu (bao gồm 15 trình tự được
phân lập và giải mã từ các tỉnh miền nam Trung Quốc cộng với 27 trình tự đã công
bố trên GenBank), sau quá trình phân tích cây sinh dòng, cho thấy tất cả đều có sự
liên hệ di truyền với genotype Bắc Mỹ và có thể được chia thành 2 phân nhóm:
Phân nhóm 1 bao gồm 21 chủng PRRSV với các đặc điểm là đều có độ tương đồng
cao với chủng gốc VR-2332 và có sự biến đổi cao ở vùng epitope trung hòa đầu
tiên; phân nhóm 2 gồm 17 chủng virus có sự tương đồng cao với virus của vaccine
MLV RespPRRs/Repro. Kết quả phân tích phân bố địa lý cho thấy phân nhóm 1
phân bố giới hạn ở các tỉnh miền Nam, trong khi phân nhóm 2 có mặt tại tất cả các
vùng có bệnh PRRS. Điều này được các tác giả đánh giá là một yếu tố gây giảm
hiệu lực của các chương trình tiêm chủng PRRS với vaccine nhược độc hay vaccine
chết.
Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn bùng nổ ở Trung Quốc. Trái với các biểu
hiện thông thường của bệnh trước đó, bệnh thường ảnh hưởng lên heo con với tỷ lệ
chết không cao, đợt dịch lần này gây tỷ lệ chết lớn và chủ yếu ảnh hưởng đến heo

10


nái và heo trưởng thành. Nghiên cứu của Tian và ctv (2007) cho thấy virus gây
bệnh vẫn là PRRSV nhưng với độc lực cao hơn nhiều. Kết quả tìm hiểu sự đột biến

liên quan đến tạo nên dòng virus độc lực cao của các tác giả cho thấy chủng gây
bệnh tương đồng cao với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ ở vùng ORF5, nhưng
đặc biệt có sự xuất hiện hai đột biến trên nsp2 (vùng ORF1). Đột biến thứ nhất là
đột biến mất leucine ở aa 482 và đột biến thứ hai là mất đoạn liên tục 29 aa từ aa
534 – aa 562. Những đột biến này chỉ xuất hiện trên những dòng gây tỷ lệ chết cao
và chỉ xuất hiện sau đợt dịch 2006. Từ các kết quả này, Tian và cộng sự (2007) đã
xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực
cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ với vùng tiến hóa tiềm
năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1. Các tác giả cũng gợi ý một số nguyên nhân
tiến hóa là do các chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc
chịu ảnh hưởng về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ, ẩm độ cao vào mùa hè
hay sự nhiễm các vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng virus
độc lực.
2.1.3.6 Virus PRRS vaccine
Yang và ctv (1997) đã so sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus vaccine
nhược độc với virus gốc VR-2332 và 16 chủng thuộc genotype Bắc Mỹ phân lập
nhằm tìm ra điểm khác biệt mã hóa cho virus vaccine nhược độc. Kết quả so sánh
nucleotide từ đầu 3’ của vaccine nhược độc và virus gốc cho thấy virus vaccine
nhược độc có 98 base thay đổi: 94 base được thay thế, 3 base bị mất và 1 base được
thêm vào (15, 26, 17, 29, 9, 6 base thay đổi tương ứng với các vùng ORF2, ORF3,
ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7). Tuy nhiên, hầu hết những base thay đổi này đều là
những thay đổi lặn, nghĩa là những thay đổi này không làm thay đổi amino acid
tương ứng, ví dụ như với 15 base thay đổi ở ORF2 chỉ làm thay đổi 5 amino acid
hay 29 base ở ORF5 thay đổi 13 amino acid. Trong những amino acid thay đổi đó
có rất nhiều amino acid đã hiện diện trong những dòng virus PRRS thực địa hay
virus PRRS độc lực được phân lập từ Bắc Mỹ hay châu Âu, chỉ có 7 amino acid là
hoàn toàn của riêng virus PRRS vaccine.

11