LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐỒN THỊ TUYẾT LÊ

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU
BẰNG KỸ THUẬT PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐỒN THỊ TUYẾT LÊ

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, GÀ, TRÂU, BÒ, DÊ, CỪU
BẰNG KỸ THUẬT PCR
Chuyên ngành

: Công Nghệ Sinh Học

Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn Khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tơi tên là Đồn Thị Tuyết Lê sinh ngày 17 tháng 1 năm 1983 tại huyện Phù Cát
tỉnh Bình Định. Con Ơng Đồn Văn Trọng và Bà Lê Thị Mỹ Oanh.
Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Quốc Học Quy Nhơn, tỉnh Bình Định năm 2001
Tốt nghiệp Đại học ngành Cơng nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học Nơng
Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 2005
Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học
Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chi Minh.
Tình trạng gia đình: kết hơn
Địa chỉ liên lạc: 214B Nguyễn Ái Quốc - phường Tân Hiệp – thành phố Biên
Hòa – tỉnh Đồng Nai.
Điện thoại: 0918916861
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Tác giả luận văn

Đồn Thị Tuyết Lê

iii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:
* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất
thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học.
* TS. Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM.
* Tập thể cán bộ Phòng Đào Tạo Sau Đại Học trường ĐHNL. TP. HCM.
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Mơi trường - trường
ĐHNL. TP. HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành luận văn.
* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tơi trong suốt q trình thực
hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn
Đoàn Thị Tuyết Lê

iv


TĨM TẮT
Đề tài “Phân biệt các loại thịt trâu, bị, dê, cừu, heo, gà bằng kỹ thuật PCR”
được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông
Lâm TP. HCM từ ngày 1/4/2008 đến ngày 1/8/2009. Mục tiêu nghiên cứu là: hồn

thiện quy trình m-PCR phân biệt các loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu sử dụng
primer thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999); xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt
trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình m-PCR, PCR-trâu và PCRbị để phát hiện 6 loại thịt trên đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt khơng xử lý nhiệt,
có có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc.
Kết quả đạt được như sau:
Đã tối ưu phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, bò lẫn trâu sử dụng
các primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999). Tỷ lệ thích hợp cho các primer
FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol. Quy trình này có thể áp dụng
cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt ở nhiệt độ 80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’;
130oC/30’, 180oC/15’. Ảnh hưởng của tỷ lệ DNA hiện diện trong các hỗn hợp DNA và
hỗn hợp thịt lên khả năng phát hiện của m-PCR cũng được xác định. Đối với hỗn hợp
DNA 6 lồi có tỷ lệ bằng nhau, nồng độ DNA thấp nhất mà m-PCR phát hiện gà là
0,0001 ng/μl, heo là 0,00025 ng/μl, cừu, dê, trâu/&bò là 0,0025 ng/μl. Còn đối với hỗn
hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu, tỷ lệ thấp nhất mà m-PCR có thể
phát hiện trâu/&bị, dê là 0,1%, cừu là 1%. Tỷ lệ giống nhau giữa hỗn hợp DNA và
hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ảnh hưởng như nhau đến khả năng phát hiện của mPCR. M-PCR không phát hiện được thịt trâu/&bò, dê, cừu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn
hợp thịt xử lý ở 130oC/30’.
Quy trình m-PCR sử dụng primer thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999) chưa phân
biệt được thịt bò với thịt trâu nên đề tài tiếp tục xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt
trâu và thịt bò với các primer tự thiết kế. Các primer được thiết kế dựa vào vùng giống
và khác nhau của gen cytochrome b của thịt bò, trâu và các lồi khác.
Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình
tự như sau 5’- CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, 5’- ATGTAGCAGGGGCAT
GAGAA-3’. Mẫu DNA được biến tính ở 94oC trong 4 phút sau đó được khuếch đại
qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94oC/1’, ủ bắt cặp ở 56oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’ và
kết thúc ở 72oC/5’. Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là
v


0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò,

dê, cừu mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1%. Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu
có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. Quy trình
PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80oC/15’,
120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ nhưng khơng có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ
≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/30’ và 130oC/30’.
Quy trình PCR phát hiện thịt bị với forward primer là 5’-CTACACATCCGA
CACAACAACAGC-3’, reverse primer là 5’-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC -3’.
Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94oC/4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94oC/1’, bắt cặp
ở 54oC/ 45’’, kéo dài ở 72oC/1’; kéo dài cuối cùng ở 72oC/5’. Nồng độ DNA bị thấp
nhất mà PCR-bị có thể phát hiện là 0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn
hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-bị có thể phát hiện là 0,05%. Tỷ lệ
thịt bị thấp nhất mà PCR-bị có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò,
dê, cừu là 0,1%. PCR-bị có khả năng phát hiện thịt bị trong các hỗn hợp thịt xử lý ở
80oC/15’, 180oC/15’ nhưng khơng có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong
hỗn hợp thịt xử lý ở 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’ và 130oC/30’.

vi


SUMMARY
Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle, goat,
sheep, pig, and chicken by PCR techniques” was carried out at Institute of
Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from April 1,
2008 to August 1, 2009. The project was aimed: (i) to optimize the m-PCR reaction
used for differentiation of commercially available meat including lamb, beef and/or
buffalo meat, chicken, pork and goat meat using primers designed by Matsunaga & et
al (1998); (ii) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat;
(iii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and
processed meat mixtures.
The results were summarized as follows:

The optimal m-PCR condition for detection of the meat species was confirmed,
in which the proportion of primers for identification of pork, lamb, beef, chicken, goat
meat, and buffalo was 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol (FSIM: RG: RCH: RCB: RS: RP),
respectively. This protocol could be applied to fresh meat and meat that had been
processed at 80oC/15; 120oC/15'; 120oC/30 '; 130oC/15'; 130oC/30', and 180oC/15'. The
effect of the amount of DNA template from different meat species in the reaction was
also investigated. For DNA mixture involving the six meat species with equal ratio,
the lowest concentration for detection of DNA was 0.0001 ng/μl in chicken, 0.00025
ng/μl in pork, 0.0025 ng/μl in lamb, goat, buffalo and/or cattle . In the mixture with
reduced DNA concentrations from lamb, cattle and goat meat, the lowest rate of DNA
that can be detected in was 0.1% in buffalo meat and/or beef, 0,1% in goat meat and
1% in lamb.
The m-PCR protocol didn’t differentiate between beef and buffalo meat exactly.
So, the reseach continued to build PCR protocols detecting buffalo meat and beef with
self-designed primer. The primers was designed based on similar and different regions
of cytochrome b genes of cattle, buffalo and other species.
PCR protocol for detection of buffalo meat (buffalo-PCR) using specific primers
was accomplished. A new set of primers for buffalo meat were designed and tested
(Forward primer, 5'-CTACACATCCGACACAACAACAGC-3' and reverse primer,
5'-ATGTAGCAGGGGCATGAGAA-3'). Amplification reaction was started with predenaturation step at 94oC/4', followed by 35 cycles including 94oC/1', 56oC/45'',
vii


72oC/1’ and final extension at 72oC/5'. The lowest concentration of buffalo DNA that
could be detected by buffalo-PCR was 0.001 ng/μl. The lowest rate of buffalo DNA in
the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep
that buffalo-PCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of
buffalo meat that buffalo-PCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of
buffalo, beef, goat, sheep. The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in
mixtures having been processed at 80oC/15’, 120oC/15’, 130oC/15’, 180oC/15’ but was

not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at
120oC/30’ and 130oC/30’.
PCR protocol for detection of beef (cattle-PCR) was set up. The new set of
primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5'-CTACACATCCGACAC
AACAACAGC-3’, and reverse primer, 5'-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC-3'.
The thermal process was as follows: 94oC/4' for initial denaturation, 35 cycles of
denaturation at 94oC/1’, annealing at 54oC/45'', enlongation at 72oC/1’ and final
extension at 72oC/5’. The cattle-PCR could detect cattle DNA with the concentration
as low as 0.001 ng/μl. The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of
DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattle-PCR could detect
was 0.05%. The lowest rate of cattle meat that cattle-PCR could detect in the reduced
ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1%. This PCR protocol was
successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80oC/15',
180oC/15' but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had
been processed at 120oC/15’, 120oC/30’, 130oC/15’, and 130oC/30’.

viii


MỤC LỤC
CHƯƠNG
TRANG
Trang tựa
Trang Chuẩn Y ................................................................................................................. i
LÝ LỊCH CÁ NHÂN .......................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................iv
TÓM TẮT........................................................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................xv

DANH SÁCH SƠ ĐỒ ..................................................................................................xvi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... xvii
Chương 1 ......................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu ................................................................................................................ 2
1.3 Mục đích ................................................................................................................ 2
Chương 2 ......................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3
2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến ............................................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt ................................................................................ 3
2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến .................................................................. 4
2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam ................... 5
2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế
giới ........................................................................................................................ 5
2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt
Nam ...................................................................................................................... 5
2.2. Các phương pháp phát hiện thịt ............................................................................ 6
2.2.1 Phương pháp dựa vào protein ......................................................................... 6
2.2.1.1 Phương pháp điện di ................................................................................. 6
2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch ............................................................................ 8
2.2.1.3. Phương pháp sắc ký................................................................................. 9
2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA ........................................................................... 9
2.2.2.1 Phương pháp lai DNA .............................................................................. 9
2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR ....................................................................11
2.3 Thiết kế primer.....................................................................................................21
2.3.1 Tổng quan về thiết kế primer ........................................................................21
2.3.1.1 Giới thiệu ................................................................................................21
2.3.1.2 Các đặc điểm của primer ........................................................................21
2.3.1.3 Nguyên tắc chung của thiết kế primer ....................................................23

2.3.2 FastPCR.........................................................................................................24
2.4 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài ................................24
2.4.1 DNA ty thể ....................................................................................................24
2.4.2 Di truyền của ty thể .......................................................................................28
2.4.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản
phẩm thịt chế biến ..................................................................................................28
ix


2.5 Tổng quan các cơng trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng
phương pháp PCR và multiplex PCR ........................................................................29
Chương 3 .......................................................................................................................33
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................33
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ..........................................................................33
3.2 Nội dung nghiên cứu...........................................................................................33
3.3 Vật liệu .................................................................................................................33
3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA ..........................................................................33
3.3.2 Primer ............................................................................................................34
3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.........................................................................34
3.4 Phương pháp tiến hành ........................................................................................35
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ....................................................................................35
3.4.2 Tách chiết DNA ............................................................................................35
3.4.3 Điều chỉnh quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà,
dê, cừu, bò và/hoặc trâu .........................................................................................36
3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn.............................36
3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR ...............................................36
3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR ..............37
3.4.4 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò .............................38
3.4.4.1 Thiết kế primer .......................................................................................38
3.4.4.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ..........39

3.4.5 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bị .....................................................40
3.4.6 Ứng dụng m-PCR, PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò, dê,
cừu, heo, gà ............................................................................................................40
3.4.6.1 Ứng dụng m-PCR ...................................................................................40
a. Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của
m-PCR ............................................................................................................40
b.Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ
giảm dần của trâu, bị, dê, cừu .......................................................................41
c. Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bị, dê,
cừu trong các hỗn hợp thịt khơng xử lý nhiệt .................................................41
d. Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê,
cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ............................................................42
e. Thực hiện m-PCR với bột thịt trên thị trường ............................................42
3.4.6.2 Ứng dụng PCR-trâu ................................................................................42
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu .................................................42
b. PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của
trâu, bị, dê, cừu ..............................................................................................42
c. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không
xử lý nhiệt .......................................................................................................42
d. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý
nhiệt ................................................................................................................42
e. PCR-trâu với bột thịt trên thị trường...........................................................42
3.4.8.3 Ứng dụng PCR-bò ..................................................................................44
a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò....................................................44
b. PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của
trâu, bò, dê, cừu ..............................................................................................44
x


c. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt khơng xử

lý nhiệt ............................................................................................................44
d. PCR-bị phát hiện thịt bị trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ......................44
e. PCR-bò với bột thịt trên thị trường .............................................................44
Chương 4 .......................................................................................................................46
KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................................................46
4.1 Điều chỉnh quy trình m-PCR ...............................................................................46
4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu .................................46
4.1.2 Q trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR ......................................................47
4.1.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR .....................49
4.2 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò ..........................50
4.3 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ...............50
4.3.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR .................................................................50
4.3.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W ..................................................................51
4.3.3 Kết quả BLAST ............................................................................................51
4.4 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC ...........51
4.4.1 Bằng PCR ......................................................................................................51
4.4.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B ..................................................52
4.4.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D ..................................................52
4.4.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F ...................................................52
4.4.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H ..................................................53
4.4.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA
template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua .........................................55
4.4.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu ......................55
4.4.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò ...................................56
4.4.3.1 BLAST ...................................................................................................56
4.4.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bị ...........56
4.5 Xác định quy trình PCR-trâu ...............................................................................57
4.6 Xác định quy trình PCR-bị .................................................................................57
4.7 Ứng dụng m-PCR, PCR-trâu và PCR-bò phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu,
heo, gà ........................................................................................................................57

4.7.1 Ứng dụng m-PCR..........................................................................................57
4.7.1.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA mỗi lồi có thể phát hiện được
của m-PCR..........................................................................................................57
4.7.1.2 M-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,
bò, dê, cừu ..........................................................................................................58
4.7.1.3 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bị, dê, cừu trong các hỗn hợp
thịt khơng xử lý nhiệt .........................................................................................59
4.7.1.4 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp
thịt xử lý nhiệt ....................................................................................................60
a. Kết quả phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các
hỗn hợp thịt xử lý ............................................................................................61
b. Kết quả so sánh m-PCR với thịt không xử lý nhiệt và thịt
xử lý nhiệt ở cùng nhóm tỷ lệ phối trộn .........................................................64
4.7.1.5 M-PCR với bột thịt trên thị trường.........................................................67
4.7.2 Ứng dụng PCR-trâu ......................................................................................68
4.7.2.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu .........68
xi


4.7.2.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,
bò, dê, cừu ..........................................................................................................68
4.7.2.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý
nhiệt ....................................................................................................................69
4.7.2.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .............69
4.7.2.5 PCR-trâu với bột thịt trên thị trường ......................................................71
4.7.3 Ứng dụng PCR-bò .........................................................................................71
4.7.3.1 Giới hạn nồng độ DNA bị có thể phát hiện được của PCR-bị .............71
4.7.3.2 PCR-bị đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,
bò, dê, cừu ..........................................................................................................72
4.7.3.3 PCR-bò phát hiện thịt bị trong các hỗn hợp thịt khơng xử lý nhiệt ......72

4.7.3.4 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .................73
4.7.2.5 PCR-bò với bột thịt trên thị trường ........................................................75
Chương 5 .......................................................................................................................76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................76
5.1 Kết luận ................................................................................................................76
5.2 Đề nghị .................................................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................78

xii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

BSE

: bovine spongiform encephalophathy

F

: forward primer chung cho bò và trâu tự thiết kế ( gồm F1 và F2)

FSIM

: forward primer SIM (kí hiệu của forward primer chung của m-PCR)

GC

: gas chromatography

HPLC

: high performance liquid chromatography

IEF

: isoelectric focusing

LC

: liquid chromatography

LTRs

: long terminal repeats

m-PCR

: multiplex polymerase reaction chain

MT-ATP6

: mitochondrially encoded ATP synthase 6

mtDNA

: mitochondrial deoxyribonucleic acid

MT-ND1

: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1

MT-ND4

: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4

MT-ND4L

: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L

MT-ND5

: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5

MT-ND6

: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6

MT-RNR1

: mitochondrially encoded 12S RNA

MT-TH

: mitochondrially encoded tRNA histidine

MT-TL1

: mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G)

MT-TS1

: mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN)

MT-TV

: mitochondrially encoded tRNA valine

NADH

: Nicotinamide adenine dinucleotide

PCR

: polymerase chain reaction

Prion

: proteinaceous infectious particle

RBU

: reverse primer buffalo (gọi chung cho RBU1 và RBU2 tự thiết kế)

RC

: reverse primer cattle (gọi chung cho RC1 và RC2 tự thiết kế)

RCB

: reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999)

RCh

: reverse primer chicken

RG

: reverse primer goat
xiii


RP- HPLC

: reverse phase high performance liquid chromatography

RP

: reverse primer pig

RS

: reverse primer sheep

SSRs

: simple sequence repeats

xiv


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mơ hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA ......................................10
Hình 2.2: Genome của ty thể .........................................................................................27
Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ của heo, cừu, bị, gà, dê ..........................................46
Hình 4.2: Sản phẩm PCR của thịt bị và trâu.................................................................47
Hình 4.3: Kết quả m-PCR theo PCR riêng lẻ ................................................................48
Hình 4.4: Kết quả tối ưu m-PCR ...................................................................................48
Hình 4.5: Kết quả thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu ...........................49
Hình 4.6: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2) ..................53
Hình 4.7: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2) ........................53
Hình 4.8: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2) ....................54
Hình 4.9: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2) ......................54
Hình 4.10: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56oC) ..................................54
Hình 4.11: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template
của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua .................................................55
Hình 4.12: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR ........................57
Hình 4.13: Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu,
bị, dê, cừu ...................................................................................................59
Hình 4.14: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt khơng xử
lý nhiệt.........................................................................................................60
Hình 4.15: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử
lý nhiệt ở 80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) ....................63
Hình 4.16: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử
lý nhiệt ở 120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7) ..................63
Hình 4.17: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bị, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử
lý nhiệt ở 130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) ..................63
Hình 4.18: Kết quả m-PCR với bột thịt trên thị trường ................................................67

Hình 4.19: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu ..............68
Hình 4.20: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bị, dê,
cừu ...............................................................................................................68
Hình 4.21: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .......69
Hình 4.22: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
80oC/15’(M2.1-M2.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) .....................................70
Hình 4.23: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
130oC/30’(M6.1-M6.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) ...................................70
Hình 4.24: PCR-trâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
130oC/15’(M5.1-M5.7) và 120oC/30’ (M4.1-M4.7) ...................................70
Hình 4.25: PCR-trâu với bột thịt ...................................................................................71
Hình 4.26: Giới hạn nồng độ DNA bị có thể phát hiện được của PCR-bị ..................71
Hình 4.27: PCR-bị đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bị, dê,
cừu ...............................................................................................................72
Hình 4.28: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt khơng xử lý nhiệt ...........73
Hình 4.29: PCR-bị phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
80oC/15’(M2.1-M2.7) và 120oC/15’ (M3.1-M3.7) .....................................74
Hình 4.30: PCR-bị phát hiện thịt bịtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
120oC/30’(M4.1-M4.7) và 130oC/15’ (M5.1-M5.7) ...................................74
xv


Hình 4.31: PCR-bị phát hiện thịt bị trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở
130oC/30’(M6.1-M6.7) và 180oC/15’ (M7.1-M7.7) ...................................75
Hình 4.32: PCR-bò với bột thịt trên thị trường .............................................................75

DANH SÁCH SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt......................................................20
Sơ đồ 2.2: Nguyên tắc chung của thiết kế primer .........................................................23
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu .........................................................................................45

xvi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mơ trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt
xẻ) ................................................................................................................... 3
Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển ............................................25
Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA.....................................................................................26
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho từng phản ứng PCR thịt tươi................................36
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến của phản ứng PCR thịt tươi ........................................36
Bảng 3.3: DNA template của thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu .........37
Bảng 3.4: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu primer ...............39
Bảng 3.5: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp ..............................41
Bảng 3.6: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt ...............................43
Bảng 4.1: Các primer thiết kế ........................................................................................50
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR.................................................................51
Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự
cytochrome b các lồi trâu, bị, heo, gà, dê, cừu...........................................51
Bảng 4.4: Các tổ hợp primer .........................................................................................52
Bảng 4.5: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR..........................58
Bảng 4.6: Tỷ lệ thấp nhất của trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR phát hiện trong các hỗn hợp
thịt xử lý ở cùng nhiệt độ và thời gian ..........................................................61
Bảng 4.7: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 1 (30:30:10:10:10:10) .....................................................64
Bảng 4.8: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 2 (40:40:5:5:5:5) .............................................................64
Bảng 4.9: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 3 (48:48:1:1:1:1) .............................................................65
Bảng 4.10: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt

của tỷ lệ phối trộn 4 (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) .................................................65
Bảng 4.11: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 5 (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) ...........................................65
Bảng 4.12: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 6 (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) ...................................66
Bảng 4.13: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt
của tỷ lệ phối trộn 7 (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03) ...............................66

xvii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, khi nhu cầu về lương thực thực phẩm tăng cao thì việc đảm bảo chất
lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm là điều cần thiết. Trong đó, các sản phẩm có
nguồn gốc từ thịt đã và đang là mối quan tâm của xã hội.
Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác
nhau. Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế
biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại. Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi
thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản
phẩm. Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một
vài loài thịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tơn giáo (ví dụ, đạo
Hindu khơng ăn thịt bị, đạo Hồi và đạo Do Thái không ăn thịt heo).
Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 1000C (khoảng 1200C đối với thịt
hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy
xử lý ở nhiệt độ khoảng 1300C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong
công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn
tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform
encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người. Vì

lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam khơng cho nhập bột xuơng
thịt có nguồn gốc từ thịt bị, cừu... của các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE.
Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và
nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác
nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội. Có nhiều phương pháp để xác định
nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch,
sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc trưng

1


cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR
sequencing, PCR-SSCP.)
Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng
dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt. Do đó, các phương pháp dựa vào DNA
thường được sử dụng hơn đặc biệt là các phương pháp PCR đặc trưng cho lồi. Trong
đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP địi hỏi
máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao. Cịn phương pháp standard –
PCR (thường gọi là PCR) và multiplex PCR dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi
trong việc phân biệt lồi của thịt. Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục
tiêu thích hợp sẽ có thể phân biệt được các loại thịt đã xử lý nhiệt.
1.2 Mục tiêu
- Điều chỉnh quy trình multiplex PCR để phát hiện các loại thịt heo, gà, dê, cừu,
trâu/& bò sử dụng primer được thiết kế bởi Matsunaga & ctv (1999).
- Xây dựng quy trình PCR để phát hiện thịt trâu.
- Xây dựng quy trình PCR để phát hiện thịt bị.
1.3 Mục đích
- Góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt chế biến cho
con người và bột thịt làm nguyên liệu trong chế biến thức ăn gia súc.
- Ngăn ngừa sự lan truyền mầm bệnh BSE từ thức ăn gia súc sang các loài thú nhai

lại và người

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến
2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt
Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mơ có giá trị sử dụng làm thực phẩm
có nguồn gốc từ động vật. Trong thương mại, thịt gồm có các mơ: mơ cơ, mô mỡ, mô
liên kết, mô xương sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt bao gồm nước,
protein, lipid, glucid, các chất trích ly chứa nitơ và khơng chứa nitơ, khoáng, vitamin
và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào lồi thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử
dụng, khẩu phần nuôi dưỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể
học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004).
Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mơ trong các loại thịt (tính theo khối lượng
thịt xẻ)
Loại mơ

Thịt bị (%)

Thịt heo (%)

Thịt cừu (%)

Mơ cơ

57-62

40-62

49-58

Mơ mơ

3-16

15-40

4-18

Mơ liên kết

9-12

6-8

7-11

Mơ xương sụn

17-29

8-18

18-38

Mơ máu

0,8-1

0,6-0,8

0,8-1
(Theo Xmolxki, 1975)

Tính chất của các mơ và thành phần cấu tạo của nó đều khác nhau. Do đó, tùy
theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính
chất của thịt. Trong súc thịt, mơ cơ là mơ có giá trị dinh dưỡng cao nhất, thấp nhất là
mơ liên kết. Mơ mỡ có giá trị năng lượng cao và cịn làm cho thịt có vị béo. Giá trị

3


thực phẩm của thịt đầu tiên được đánh giá qua tỉ lệ protein chứa trong đó và giá trị sinh
học của lượng protein đó.
Trong dinh dưỡng con người và động vật, thịt và sản phẩm của thịt là nguồn
đạm, chất béo, vitamin, chất khống và các chất hịa tan. Tất cả được sử dụng trong cơ
thể nhằm mục đích sinh tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể cũng như bù đắp năng
lượng tiêu hao do hoạt động. Thịt các loài động vật chứa hầu hết các nguyên tố đa
lượng và vi lượng cần thiết cho cơ thể, các vitamin nhóm B, acid pantotenic, vitamin
PP. Thịt heo chứa nhiều vitamin B1, B6 và acid pantotenic. Thịt bò chứa nhiều
vitamin B12.
2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến
Nguyên liệu chủ yếu để sản suất thịt và các sản phẩm thịt là đại gia súc có sừng
(trâu, bị…); gia súc (heo, cừu, dê...); và gia cầm (như gà, vịt, ngỗng,…). Để đa dạng
hóa sản phẩm chế biến từ thịt và nâng cao giá trị sử dụng của thịt thì chúng phải được
chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác nhau tùy theo mục tiêu sử dụng. Chế biến
làm tăng sự ngon miệng, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất dinh dưỡng từ thịt,

hạn chế sự nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, kéo dài tuổi thọ của sản phẩm do
đó tăng giá trị sử dụng của thịt chế biến.
Thịt chế biến có hai nhóm lớn: thịt chế biến làm thức ăn cho người và thịt chế
biến làm thức ăn cho gia súc. Thịt chế biến làm thức ăn cho người thường được chế
biến từ mô cơ, mô mỡ. Thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường là bột thịt) còn
được chế biến từ các nguồn vật liệu giàu protein khác là phụ phế phẩm trong giết mổ
gia súc như da, lơng, xương, móng và các nội quan.
Có nhiều phương pháp chế biến thịt cung cấp thực phẩm cho con người: phơi
khô, ướp muối, ướp đường, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy), hun khói. Trong đó
phương pháp sử dụng nhiệt độ là phổ biến nhất. Tùy theo loại sản phẩm và mục tiêu sử
dụng mà người ta xử lý ở mức nhiệt độ khác nhau. Hiện nay, hầu hết các sản phẩm chế
biến như xúc xích, lạp xưởng, thịt hộp, cá hộp... được xử lý ở 800C; xúc xích tiệt
trùng, thịt hộp được xử lý ở 1200C; đối với bột thịt sử dụng cho gia súc và con người,
nhiệt độ xử lý là 1300C (Hồ Thị Thu Nguyệt, 2003).

4


2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam
2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới
Cơ quan tiêu chuẩn về thực phẩm (FSA – Food standard Agency) đã tổ chức
nhiều cuộc điều tra trên đối tượng thịt và các sản phẩm thịt chế biến, kết quả cho thấy
có rất nhiều sai lệch giữa thành phần thực tế với nhãn hiệu của sản phẩm. Đặc biệt là
sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt gia súc khác nhau, các nhà sản xuất thường
ghi trên nhãn sản phẩm những loại thịt có giá trị cao và tránh ghi những loại thịt có giá
trị thấp được trộn vào trong sản phẩm. Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ giữa các loại
thịt. Trong khi đó, khả năng kiểm sốt thành phần lồi, độ an tồn và chất lượng sản
phẩm thịt chế biến trên thị trường của các tổ chức ban ngành có liên quan vẫn cịn ít
().
Một cuộc điều tra khác của bộ môn Công Nghệ thực phẩm và vệ sinh thực

phẩm, trường Thú y, Đại học Ankara (Mỹ) (2006) về các loại thịt được trộn vào trong
các sản phẩm thịt tươi và thịt chế biến. Trên 100 mẫu điều tra, kết quả là 39,2% xúc
xích lên men 35,7% xúc xích Ý, 27,2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên
có chứa thịt của những lồi động vật khơng cơng bố trên nhãn sản phẩm. Cụ thể là xúc
xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức với thành phần ghi trên nhãn là thịt bị nhưng
kết quả kiểm tra lại có lẫn thịt gia cầm. Các mẫu thịt bò tươi kiểm tra cho thấy dương
tính với thịt hươu và thịt ngựa.
2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại trong sản xuất, tiêu thụ thịt và sản
phẩm chế biến từ thịt là vấn đề nhức nhối đối với nhà quản lý. Ngay cả thịt tươi bán ở
chợ hay ở các cửa hàng cũng bị gian lận như thịt trâu giả bò, thịt ngựa giả bò, thịt heo
giả dê...Đối với các sản phẩm thịt chế biến như xúc xích tơm, xúc xích bị, chả giị, thịt
hộp...trên thị trường có nhiều sản phẩm nghi ngờ không đúng với thành phần trên nhãn
hiệu đã đăng kí, đặc biệt các thực phẩm chế biến nhập khẩu.
Những năm gần đây, Việt Nam đặc biệt quan tâm đến vấn đề vệ sinh an toàn
thực phẩm. Các bệnh dịch nguy hiểm đã và đang diễn ra. Tình trạng vận chuyển lậu
động vật và các sản phẩm động vật vẫn thường xảy ra. Cục Thú y đã phối hợp với Vụ
pháp chế - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nơng thơn, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm –
Bộ Y tế, Cục quản lý Thị trường – Bộ Công thương thường xuyên tổ chức thanh tra,
5


kiểm tra công tác kiểm dịch nhập khẩu động vật, sản phẩm động vật, đặc biệt là hoạt
động chống nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới diễn biến hết sức phức
tạp. Tuy nhiên, chính quyền địa phương chưa thực sự quan tâm chỉ đạo công tác ngăn
chặn và xử lý nhập lậu động vật, sản phẩm động vật qua biên giới, sự phối hợp giữa
các cơ quan, ban ngành tại địa phương chưa thống nhất và chặt chẽ
( />mid=65).
Thêm vào đó, cơng tác kiểm tra đối với các mặt hàng xuất nhập khẩu có nguồn
gốc động vật vẫn còn nhiều vấn đề bất cập:

-

Các nhà xuất nhập khẩu đều có thể đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn kỹ
thuật và tiêu chuẩn của Việt Nam. Tuy nhiên, do thiếu trang thiết bị và cán bộ,
nên việc kiểm tra chất lượng , kiểm dịch và thủ tục phê duyệt thường kéo dài.

-

Trong khi đó, các nước nhập khẩu yêu cầu về đăng ký công bố chất lượng, kiểm
dịch, kiểm soát giết mổ của các nước nhập khẩu thường rất chặt chẽ. Các yêu
cầu, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của các nước này cũng rất cao.

-

Các nhà nhập khẩu nước ngồi cịn u cầu thịt và sản phẩm của thịt phải được
lấy từ vùng an tồn đối với bệnh lở mồm lơng móng, dịch tả heo, dịch tả gà
(newcastle), BSE và những vùng này phải được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE)
công nhận.

-

Yêu cầu tiêu chuẩn của Việt Nam thường không chặt chẽ bằng các yêu cầu tiêu
chuẩn của các nước nhập khẩu (Bùi Thị Cúc, 2006).

2.2. Các phương pháp phát hiện thịt
2.2.1 Phương pháp dựa vào protein
Những phương pháp dựa vào protein sau đây có thể ứng dụng để xác định thành
phần và nguồn gốc của các sản phẩm thịt và từ thịt:
¾ Phương pháp điện di
¾ Phương pháp miễn dịch

¾ Phương pháp sắc ký
2.2.1.1 Phương pháp điện di
™ Bản chất của phương pháp điện di

6


Phương pháp điện di dựa vào sự phân tách của các phân tử protein trong điện
trường sau khi ly trích từ mô. Đầu tiên, protein đi qua lớp starch gel, sau đó đi qua lớp
polyarylamide và agarose. Sự phân tách protein được biểu hiện trên polyarylamide gel
(PAGE), trên polyacrylamide gel chứa một tác nhân biến tính (sodium dodecyl sulfate)
(SDS-PAGE) hoặc nhờ điểm đẳng điện (isoelectric focusing - IEF) trên gel agarose
hoặc gel polyacrylamide (PAGIF).
Phương pháp IEF bao gồm sự phân tách trên một gel mà được xác định nhờ sự
thay đổi pH. Các protein riêng lẻ di chuyển theo giá trị pH mà tương đương với điểm
đẳng điện (isoelectric point ). Điện di PAGE cũng được quan tâm nhờ sự vắng mặt của
tác nhân biến tính. Trong phương pháp này, sự phân tách protein phụ thuộc vào vật
mang và kích thước của phân tử protein. Các protein di chuyển từ cực dương sang cực
âm phụ thuộc vào điện tích của chúng. Trong trường hợp của SDS – PAGE, phân tử
protein mang điện tích âm được lấy từ SDS di chuyển từ cực dương với vận tốc phụ
thuộc chủ yếu vào trọng lượng phân tử của chúng. Có một mối tương quan tuyến tính
giữa khoảng cách di chuyển của protein và giá trị logarit thập phân của trọng lượng
phân tử mà có thể dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein. Với sự hỗ trợ của
điện di hai chiều (two dimensional electrophoresis 2-DE), nó có thể dùng để xác định
thịt của nhiều loài liên quan của cá, chim, gia súc. Sự phân tách protein có thể nhìn
thấy được bằng mắt thường (trong trường hợp protein có chứa chất màu) hoặc sau khi
nhuộm màu. Những thuốc nhuộm thông thường gồm: coomasie blue, muối bạc, hoặc
chất nhuộm có bản chất enzym (Hofmann, 1997).
™ Ứng dụng của phương pháp IEF
Sự phân tách protein nhờ IEF chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: pH thịt,

tuổi và giới tính của gia súc cho thịt, dinh dưỡng, điều kiện nuôi, điều kiện dự trữ, hoạt
tính tự nhiên hoặc protease vi sinh vật. Có thể phân tách dựa vào thành phần đơn, ví dụ
myoglobin là sắc tố cơ chuyên biệt loài. Myoglobin sử dụng như là chỉ thị lồi, sự
phân tách cùng nhau có thể đạt được bởi những thịt thí nghiệm khác nhau của cùng
một con vật hay của những con vật khác nhau của cùng một loài. Điều này đã được
chứng minh đối với thịt của các lồi như bị, ngựa, heo, cừu, dê, kangaroo, lạc đà, gấu,
thỏ, gà, vịt, đà điểu, band myoglobin được xác định và chúng có thể được phân biệt cơ
bản những myoglobin (Hofmann, 1997). Trong trường hợp, những thú có quan hệ gần
nhau, ví dụ như heo và heo rừng, mẫu myoglobin thì tương tự nhau. Kỹ thuật IEF có
7