KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
****************

HỒ VĂN ÚT HẬU

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM
ASPERGILLUS FLAVUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
****************

HỒ VĂN ÚT HẬU

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM
ASPERGILLUS FLAVUS

Chuyên ngành: Thú y
Mã số

: TY2007012

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn Khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 07/2010


KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM
ASPERGILLUS FLAVUS
HỒ VĂN ÚT HẬU

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS. TS. DƯƠNG THANH LIÊM
Hội chăn nuôi Việt Nam

2. Thư ký:

TS. TRẦN XUÂN HẠNH
Công ty thuốc thú y Trung ương 2 (Navetco)

3. Phản biện 1:

TS. LÊ ANH PHỤNG
Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

4. Phản biện 2:

PGS. TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG
Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

5. Ủy viên:

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Hồ Văn Út Hậu sinh ngày 07 tháng 05 năm 1980 tại huyện Lai
Vung, tỉnh Đồng Tháp, Con Ông Hồ Chính Hải và Bà Huỳnh Thị Nhành.
Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học chuyên ban Lai Vung I, tỉnh Đồng
Tháp năm 1998.
Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ Tại chức tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức,
thành phố Hồ Chí Minh.
Sau đó làm việc tại Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp, giáo viên Khoa Nông
Nghiệp Thủy Sản.
Tháng 09 năm 2007 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm,
Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: Vợ Võ Thị Cẩm Duyên, kết hôn năm 2006, Con Hồ Ngọc
Đại, sinh năm 2008.
Địa chỉ liên lạc: 341/HT, ấp Hậu Thành, xã Tân Dương, huyện Lai Vung, tỉnh
Đồng Tháp hoặc Trường Cao Đẳng Nghề Đồng Tháp (số 02, đường Trần Phú,

Phường 03, Thị xã Sa Đéc).
Điện thoại: (067) 2215467

DĐ: 0909662729

Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên là Hồ Văn Út Hậu, xin cam đoan những kết quả trình bày trong cuốn
luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả hoàn toàn
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình hoặc luận văn nào
trước đây.
Tác giả luận văn

Hồ Văn Út Hậu

iii


LỜI CẢM ƠN
Trân trọng bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
۞ Sự giúp đỡ của Đảng ủy và Ban Giám hiệu trường Cao Đẳng nghề Đồng Tháp,
khoa Nông Nghiệp Thủy Sản.
۞ Ban Giám hiệu trường ĐHNL – Tp. HCM, Ban Chủ nhiệm khoa CNTY, phòng
Đào tạo Sau đại học, bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, bộ môn Bệnh lý – Truyền
nhiễm – Ký sinh, bộ môn Sinh lý – Sinh hóa và quí thầy cô đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho việc hoàn thành luận văn này.

۞ Thầy hướng dẫn là PGS TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện công trình này.
۞ BGĐ Bệnh viện Từ Dũ, quí thầy Lê Anh Phụng và thầy Nguyễn Văn Khanh
cùng cô Hồ Thị Nga đã giúp tôi thực hiện phân tích các mẫu thí nghiệm.
۞ Sự giúp đỡ của PGS TS Dương Thanh Liêm, PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, PGS
TS Lâm Thị Thu Hương, TS Lê Anh Phụng, TS Trần Văn Chính, TS Đỗ Hiếu
Liêm, TS Nguyễn Tất Toàn, Ths Nguyễn Thị Thu Năm đã đóng góp nhiều ý kiến
quí báu cho việc hoàn chỉnh luận văn này.
۞ Các bạn hữu, quí đồng nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian qua và đặc
biệt là sự hỗ trợ tận tình của Mẹ Huỳnh Thị Nhành với Vợ Võ Thị Cẩm Duyên cùng
Con Hồ Ngọc Đại giúp tôi vượt qua nhiều khó khăn để đạt được thành quả ngày
hôm nay.
Tp. HCM, tháng năm
Tác giả

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát tác động của vi khuẩn Bacillus subtilis đối với nấm
Aspergillus flavus” được tiến hành tại Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, khoa Chăn
nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM từ tháng 03 năm 2009 đến tháng
09 năm 2009. Qua thời gian thực hiện đề tài chúng tôi có những kết luận sau:
Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể phân lập được từ phân vịt (khoảng 2,5 tháng
tuổi).
Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các gốc vi khuẩn Bacillus subtilis phân
lập được từ phân vịt:
- Trên môi trường thạch nước cốt dừa: sau 5 ngày nuôi cấy chung vi khuẩn
Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus flavus, quan sát dưới ánh đèn tia cực tím
(bước sóng 365 nm) cho thấy một số gốc vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức

chế sự sinh trưởng và sinh độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus.
- Trên môi trường bắp xay vỡ: sau 7 ngày nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis và bào tử nấm mốc Aspergillus flavus, kết quả cho thấy một số gốc
Bacillus subtilis có khả năng làm giảm sự sản sinh aflatoxin của nấm Aspergillus
flavus trên bắp (875 ppb aflatoxin so với mẫu đối chứng 6200 ppb aflatoxin).
Thức ăn hỗn hợp gây nhiễm aflatoxin khi được xử lý với vi khuẩn Bacillus
subtilis có tỷ lệ gây chết vịt thấp hơn có ý nghĩa so với đối chứng (không xử lý với
Bacillus subtilis), lần lượt là 0 %, 3,33 % so với đối chứng 23,33 %. Tỷ lệ vịt bệnh
và mức độ bệnh tích trên gan cũng giảm rõ rệt ở lô được xử lý với vi khuẩn Bacillus
subtilis so với lô đối chứng.

v


SUMMARY
The study “The effects of Bacillus subtilis on Aspergillus flavus” was
performed in the Department of Microbiology and Contagious Diseases, Faculty of
Veterinary and Animal Sciences, Nong-Lam University Ho Chi Minh City from
March 2009 to September 2009. The results showed:
- Bacillus subtilis be isolated from feces of ducks at about 2,5 months of age.
- After 5 days of culturing on coconut juice agar the growth of both Bacillus
subtilis and Aspergillus flavus could be observed and aflatoxin production inhibition
of Bacillus subtilis to Aspergillus flavus fungus could be detected.
- On ground maize medium after 7 days of culture some Bacillus subtilis
strains might reduce the production of aflatoxin by Aspergillus flavus (6200 ppb
aflatoxin in control compared to 875 ppb aflatoxin in the experimental lot).
The treatment feed contaminated with aflatoxin with Bacillus subtilis resulted
in lower mortality (0 % and 3,33 %) in comparing to the control without Bacillus
subtilis treatment (23,33 %). Severity of liver lesions was observed less at lower
level among ducks fed with diet treated with Bacillus subtilis than those of the

control.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN ................................................................................................. ii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv
TÓM TẮT ...................................................................................................................v
SUMMARY .............................................................................................................. vi
Chương 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................1
1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU .................................................................................2
1.3 YÊU CẦU .............................................................................................................2
Chương 2. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS .........................................3
2.1.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus ...................................................................3
2.1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................5
2.1.2.1 Lịch sử phát hiện .............................................................................................5
2.1.2.2 Đặc điểm phân loại..........................................................................................5
2.1.2.3 Sự phân bố.......................................................................................................5
2.1.2.4 Đặc điểm hình thái ..........................................................................................5
2.1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy...........................................................................................6
2.1.2.6 Đặc điểm sinh hóa ...........................................................................................6
2.1.3 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................6

2.1.4 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis ................................................8
2.1.4.1 Peptide antibiotic được tổng hợp bằng ribosome............................................8
2.1.4.2 Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome.................................9
2.2 KHÁI QUÁT VỀ MYCOTOXIN VÀ AFLATOXIN ..........................................9
2.2.1 Mycotoxin ..........................................................................................................9
2.2.2 Aflatoxin ..........................................................................................................10

vii


2.2.2.1 Các loại độc tố aflatoxin ...............................................................................10
2.2.2.2 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin ......................................................................11
2.2.3 Bệnh nhiễm độc AF (Aflatoxicosis) ................................................................12
2.2.3.1 Nhiễm độc cấp tính .......................................................................................12
2.2.3.2 Nhiễm độc mãn tính ......................................................................................13
2.2.3.3 Ức chế miễn dịch và gây ung thư..................................................................14
2.2.4 Các loài nấm mốc sinh độc tố AF ....................................................................14
2.2.5 Các biện pháp làm giảm độc AF trong thực liệu .............................................15
2.2.5.1 Phương pháp vật lý học .................................................................................15
2.2.5.2 Phương pháp hóa học ....................................................................................16
2.2.5.3 Phương pháp sinh vật học .............................................................................17
2.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BACILLUS SUBTILIS VỚI NẤM ...............18
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................20
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ..............................................................................20
3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ....................................................20
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...............................................................................20
3.4 VẬT LIỆU DÙNG CHO THÍ NGHIỆM ............................................................21
3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................22
3.5.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN B. SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT .................................22
3.5.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AF CỦA VI KHUẨN B. SUBTILIS LÊN

NẤM A. FLAVUS TRÊN MÔI TRƯỜNG NƯỚC CỐT DỪA VÀ BẮP ................23
3.5.2.1 Khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm A. flavus ..........23
3.5.2.2 Khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm A. flavus .........25
3.5.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ LÀM AF CỦA KHUẨN B. SUBTILIS ..................28
3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .................................................................300
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................311
4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP B. SUBTILIS TỪ PHÂN VỊT .....................................311
4.1.1 Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ B. subtilis ........................................................311
4.1.2 Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn nghi ngờ B. subtilis ...........................311

viii


4.1.3 Xác định B. subtilis bằng xét nghiệm sinh hóa ..............................................322
4.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN B. SUBTILIS ỨC CHẾ A. FLAVUS ..333
4.2.1 Kiểm tra khả năng sinh AF của chủng nấm mốc A. flavus ............................333
4.2.2 Khảo sát khả năng ức chế nấm A. flavus của các gốc B. subtilis phân lập được...333
4.2.3 Khảo sát khả năng của các gốc B. subtilis làm giảm AF do A. flavus ..........355
4.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA B. SUBTILIS ĐỐI VỚI AF TRÊN VỊT CON 377
4.3.1 Tỷ lệ bệnh .......................................................................................................377
4.3.2 Tỷ lệ nuôi sống ...............................................................................................377
4.3.3 Khảo sát bệnh tích ............................................................................................39
4.3.3.1 Kết quả khảo sát trên vịt còn sống sau thí nghiệm .......................................39
4.3.3.2 Kết quả khảo sát bệnh tích trên vịt chết ......................................................433
4.3.4 Các chỉ tiêu sinh lý của máu trong giai đoạn 3 ngày – 2 tuần tuổi ................477
4.3.4.1 Haemoglobin ...............................................................................................477
4.3.4.2 Hồng cầu .....................................................................................................488
4.3.4.3 Bạch cầu ......................................................................................................488
4.3.4.4 Công thức bạch cầu .......................................................................................49
4.3.4.5 Nhận xét chung về khả năng làm giảm độc AF của B. subtilis ..................522

4.4 CÁC MẶT HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................522
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................544
5.1 KẾT LUẬN .......................................................................................................544
5.2 ĐỀ NGHỊ ..........................................................................................................555
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................566
PHẦN TIẾNG VIỆT NAM ....................................................................................566
PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI ..............................................................................577
PHỤ LỤC ................................................................................................................611

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TIẾNG VIỆT
KÝ HIỆU

NGUYÊN CHỮ

TĂHH

Thức ăn hỗn hợp

TIẾNG NƯỚC NGOÀI
VIẾT TẮT

NGUYÊN CHỮ NƯỚC NGOÀI

% mole GC

% mole Guanine Cytosine

AOAC

Association of Official Analytical

NGHĨA TIẾNG VIỆT
Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Chemists
CFU

Colony forming unit

Đơn vị tạo khuẩn lạc

kDa

Kilo dalton

Đơn vị đo phân tử khối protein

Ppb

Part per billion

Phần tỷ (μm/kg)

VP

Voges-Proskauer

Phản ứng VP

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Đặc tính của các loài thuộc giống Bacillus ................................................ 4
Bảng 2.2: Sự khác nhau giữa tế bào sinh dưỡng và nội bào tử vi khuẩn ................... 7
Bảng 2.3: Trọng lượng phân tử của một số loại AF ................................................ 10
Bảng 2.4: Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh AF ....................................... 14
Bảng 2.5: Điểm nóng chảy của một số loại AF ........................................................ 15
Bảng 2.6: Khả năng ức chế AFB1 của các gốc vi khuẩn B. subtilis ......................... 17
Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí các chai thí nghiệm trên môi trường bắp.............................. 26
Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí số vịt thí nghiệm trong các lô ............................................... 28
Bảng 4.1: Tỷ lệ phân lập B. subtilis trên phân vịt .................................................... 32
Bảng 4.2: Kết quả phân tích hàm lượng AF trên môi trường bắp xay vỡ ................ 35
Bảng 4.3: Tỷ lệ bệnh ở vịt (3 ngày – 2 tuần) (%) ..................................................... 37
Bảng 4.4: Tỷ lệ nuôi sống ở vịt (3 ngày – 2 tuần) (%) ............................................. 38
Bảng 4.5: Bệnh tích đại thể của gan và túi mật vịt thí nghiệm (lúc 2 tuần tuổi) ...... 39
Bảng 4.6: Bệnh tích tế bào gan thoái hóa mỡ ........................................................... 41
Bảng 4.7: Bệnh tích hoại tử tế bào gan..................................................................... 41
Bảng 4.8: Bệnh tích tăng sinh ống dẫn mật .............................................................. 42
Bảng 4.9: Bệnh tích tăng sinh mô liên kết ................................................................ 42
Bảng 4.10: Bệnh tích đại thể của gan vịt chết trong thí nghiệm .............................. 44
Bảng 4.11: Bệnh tích vi thể (đánh giá mức độ bệnh tích) của gan vịt thí nghiệm ... 44

Bảng 4.12: Hàm lượng Hb ở vịt 2 tuần tuổi (g%) .................................................... 47
Bảng 4.13: Biến đổi số lượng hồng cầu ở các lô vịt thí nhiệm ................................ 48
Bảng 4.14: Số lượng bạch cầu trên vịt thí nghiệm (2 tuần tuổi) .............................. 48
Bảng 4.15: Biến đổi về tỷ lệ bạch cầu ái toan ở vịt thí nghiệm (%) ......................... 49
Bảng 4.16: Tỷ lệ bạch cầu ái kiềm ở các lô thí nghiệm (%) .................................... 49
Bảng 4.17: Biến đổi tỷ lệ bạch cầu dị nhiễm ở vịt 2 tuần tuổi (%) .......................... 50
Bảng 4.18: Tỷ lệ lâm ba cầu ở các lô thí nghiệm (%) .............................................. 51
Bảng 4.19: Biến đổi tỷ lệ bạch cầu đơn nhân lớn ở vịt thí nghiệm (%) ................... 51

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn B. subtilis ..................................................................... 5
Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ B. subtilis trên môi trường thạch TSA ..................... 31
Hình 4.2: Hình thái vi khuẩn nghi ngờ B. subtilis dưới kính hiển vi ....................... 31
Hình 4.3: Kết quả thử phản ứng sinh hóa xác định B. subtilis ................................. 32
Hình 4.4: Khuẩn lạc của A. flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa .................. 33
Hình 4.5: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nấm mốc ................ 34
Hình 4.6: Cường độ vòng sáng AF không đều ở các phía của khuẩn lạc A. flavus . 34
Hình 4.7: So sánh các mẫu bắp sau 7 ngày ủ ........................................................... 35
Hình 4.8: Gan bình thường (lô I) .............................................................................. 40
Hình 4.9: Gan nhạt màu, xuất huyết (lô II) .............................................................. 40
Hình 4.10: Bề mặt gan bị sưng (lô III) ..................................................................... 40
Hình 4.11: Gan gần như bình thường (lô IV) ........................................................... 40
Hình 4.12: Túi mật sưng căng to (lô II).................................................................... 45

Hình 4.13: Gan nhạt màu, bề mặt xuất huyết (lô II) ................................................ 45
Hình 4.14: Túi khí phủ fibrin (lô II) ......................................................................... 45
Hình 4.15: Gan nhạt màu, bề mặt gan sưng (lô II) ................................................... 45
Hình 4.16: Vịt có tình trạng chân bị cong do ảnh hưởng của aflatoxin ................... 45
Hình 4.17: Mô gan gần như bình thường (lô I) ........................................................ 46
Hình 4.18: Tăng sinh ống dẫn mật (+++) ở lô II ...................................................... 46
Hình 4.19: Tăng sinh ống dẫn mật (+) ở lô III ......................................................... 46
Hình 4.20: Mô gan chỉ hơi bị xung huyết (lô IV) .................................................... 46
Hình 4.21: Thoái hóa mỡ (++++) ở lô IV ................................................................ 46
Hình 4.22: Tăng sinh ống dẫn mật (++) ở lô IV....................................................... 46

xii


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn B. subtilis ................................................................... 23
Sơ đồ 3.2: Các bước thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sản sinh AF
của các gốc B. subtilis phân lập được ....................................................................... 25
Sơ đồ 3.3: Phương pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn B. subtilis ............. 27
Sơ đồ 3.4: Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn B. subtilis ................... 27

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay thức ăn hỗn hợp được sản xuất với quy mô công nghiệp để đáp ứng
cho nhu cầu chăn nuôi gia súc, gia cầm ở các trang trại. Tình hình mua bán, dự trữ
các nguồn thực liệu với số lượng lớn như hiện nay cộng với điều kiện tự nhiên ở
nước ta rất thuận lợi cho nhiều loài nấm mốc phát triển, điển hình là các loài
Aspergillus sinh độc tố aflatoxin (AF). Độc tố này gây ảnh hưởng trực tiếp đến gia
súc gia cầm như giảm hiệu quả chuyển hóa thức ăn, sinh trưởng, suy giảm miễn
dịch, gây nhiễm độc, rối loạn chức năng, thoái hóa gan mỡ và gây chết trong trường
hợp nhiễm độc số lượng lớn. Nguy hiểm hơn, độc tố còn có thể ảnh hưởng gián tiếp
đến sức khỏe cộng đồng.
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra những biện pháp để làm giảm
hoặc phá hủy AF như biện pháp vật lý (loại bỏ phần nhiễm nấm, xử lý nhiệt, chiếu
xạ, dùng các chất hấp phụ, trích ly bằng dung môi, than hoạt tính,...), biện pháp hóa
học (dùng ozon, ammonia,...). Việc lựa chọn phương pháp làm giảm hoặc phá hủy
độc tố phải phù hợp với yêu cầu sau: khả thi, giá thành rẻ, hiệu quả, đồng thời
không ảnh hưởng đến khẩu vị của thú hoặc làm hạ thấp giá trị dinh dưỡng của thức
ăn hoặc hình thành các chất có hại. Định hướng mới hiện nay đang được quan tâm
là áp dụng phương pháp vi sinh vật. Một số loài vi khuẩn, nấm mốc, nấm men đã
được thử nghiệm về khả năng làm giảm tác hại của AF cho kết quả khả quan: nấm
mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus
pulimus), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), và xạ khuẩn… Các vi sinh vật của
phương pháp này có tác dụng làm giảm AF, kích thích tăng trọng, tăng hiệu lực
miễn dịch và giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngoài ra còn có tác dụng bảo

1


vệ môi trường khi được thải ra ngoài tự nhiên. Để làm rõ vấn đề trên, chúng tôi thực
hiện đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS FLAVUS”.

Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis (B. subtilis) là giải pháp hiện nay nhằm làm
giảm khả năng gây độc trên vịt khi trong khẩu phần có độc tố AF. Đặc biệt vịt là
loài rất mẫn cảm với AF. Đề tài hy vọng trở thành cơ sở để áp dụng phương pháp vi
sinh vật trong việc làm giảm khả năng sinh độc tố của nấm Aspergillus flavus (A.
flavus) nhằm góp phần tạo ra sản phẩm chăn nuôi chất lượng cao.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân lập, xác định chủng vi khuẩn B. subtilis có khả năng ức chế sản sinh AF của
nấm A. flavus nhằm có thể ứng dụng trong chăn nuôi hạn chế tác hại của độc tố nấm.
1.3 YÊU CẦU
(1) Phân lập được vi khuẩn B. subtilis từ phân vịt.
(2) Tìm ra chủng B. subtilis có khả năng ức chế sinh AF của nấm A. flavus
(in vitro).
(3) Đánh giá hiệu quả làm giảm độc AF trong khẩu phần nuôi vịt của vi khuẩn
B. subtilis phân lập.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus
Các thành viên của giống Bacillus được phân lập dễ dàng từ đất hoặc không
khí. Đây là nhóm vi sinh vật sinh bào tử. Khi xử lý mẫu đất bằng nhiệt độ (80oC
trong 10-30 phút), các tế bào sinh dưỡng bị nhiệt độ phá hủy trong khi nhiều bào
tử trong mẫu vẫn còn sống. Cấy trải các mẫu đã xử lý với nhiệt trên thạch và để ở
điều kiện hiếu khí sẽ thu được các khuẩn lạc đa số thuộc giống Bacillus. Bacillus
thường mọc tốt trên môi trường có nguồn carbon duy nhất là đường, axit hữu cơ,
rượu…; với nguồn nitơ duy nhất là ammonia; có một số dạng phân lập cần
vitamin để tăng trưởng. Nhiều sản phẩm enzyme thủy giải ngoại bào của Bacillus

phân giải polysaccharide, axít nucleic và lipid, cho phép những vi sinh vật này sử
dụng các sản phẩm đó làm nguồn carbon và chất cho điện tử. Bacillus có thể sản
xuất kháng sinh như bacitracin, polymyxin, tyrocidin, gramicidin và circulin. Hầu
hết việc tạo kháng sinh có liên quan đến quá trình bào tử hóa, và kháng sinh được
giải phóng ở giai đoạn tế bào bước vào pha tăng trưởng ổn định sau khi chuyển
sang bào tử hóa. Phân loại giống của Bacillus được liệt kê trong bảng 2.1 (Brock
và ctv, 1988; trích dẫn Trần Thu Hoa, 2003). Có thể phân biệt các loài trong giống
dựa vào RNA của tiểu đơn vị ribosome 16S (16S rRNA) (Hoa và ctv, 2000).
Nhiều trực khuẩn gây bệnh cho côn trùng, đáng lưu ý nhất là B. larvae,
B. popillae và B. thuringiensis. Trong những năm gần đây các vi sinh vật này được
quan tâm vì tiềm năng sử dụng để kiểm soát dịch côn trùng lan tràn phá hoại thực
vật. Chúng tạo protein tinh thể nằm bên ngoài của bào tử trong quá trình bào tử hóa.

3


Các trực khuẩn tạo tinh thể này gây bệnh nguy hại cho ấu trùng bướm như tằm, sâu
bắp cải... (Trần Thu Hoa, 2003).
Bảng 2.1: Đặc tính của các loài thuộc giống Bacillus
Đặc tính

Loài

DNA (% mole GC)

A. Bào tử hình trứng hoặc trụ, hiếu khí tùy
ý, thủy phân casein và tinh bột; túi bào tử
không phồng, vách bào tử mỏng
Ưa nhiệt và ái axít

B. coagulans

47

B. acidocaldarius

60

B. licheniformis

46

B. cereus

35

B. anthracis

33

B. megaterium

37

B. subtilis

43

B. thuringiensis

34

Ưa nhiệt

B. stearothermophilus

52

Ưa nhiệt trung bình

B. polymyxa

44

B. macerans

52

B. circulans

35

B. larvae

–

B. popilliae

41

B. sphaericus

37

B. pasteurii

38

Ưa nhiệt trung bình

Gây bệnh cho côn trùng
Túi bào tử phồng rõ rệt, vách bào tử dày

Gây bệnh cho côn trùng

B. Bào tử hình cầu, hiếu khí bắt buộc,
không thủy phân casein và tinh bột
Túi bào tử phồng

4


2.1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1 Lịch sử phát hiện
B. subtilis được Cohn và các bác sĩ quân y Đức Quốc Xã phát hiện vào năm
1941 trong nỗ lực tìm kiếm một giải pháp chữa trị cho hàng trăm binh lính của
quân đội bị chết vì dịch kiết lị khi đang chiếm đóng Nam Phi (Phạm Ngọc Thạch,
1963).
2.1.2.2 Đặc điểm phân loại
Theo hệ thống phân loại, vi khuẩn B. subtilis thuộc:

- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillaceae
- Giống: Bacillus
- Loài: Bacillus subtilis (Todar, 2009).
2.1.2.3 Sự phân bố
Vi khuẩn B. subtilis thường sống trong đất, phân bố ở nhiều nơi trong tự nhiên
như: bụi và cỏ khô. Vi khuẩn hiếu khí, thường tấn công vào những hợp chất hữu cơ
tạo mùi amoniac (Frobisher, 1970; trích dẫn Trần Thu Hoa, 2003).
2.1.2.4 Đặc điểm hình thái
B. subtilis có dạng hình que, bắt màu Gram dương, kích thước 3-5 x 0,6 μm,
thường kết thành chuỗi, di động bằng tiêm mao (hình 2.1). B. subtilis có khả năng
hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên và/hoặc khi vi khuẩn gặp điều
kiện bất lợi (về enzyme nội bào, enzyme ngoại bào, hoặc cạn nguồn dinh dưỡng)
(Trần Thu Hoa, 2003).

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (Widner, 2006)

5


2.1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy
Mặc dù là vi khuẩn hiếu khí nhưng B. subtilis vẫn có khả năng sống được
trong điều kiện thiếu O2. B. subtilis dễ nuôi cấy, mọc dễ dàng trên các môi trường
nuôi cấy thông thường. Môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản là nguồn
nitơ từ pepton, cao thịt…; nguồn carbon từ glucose và lactose; chất khoáng từ muối
K+, Mg++, và Na+ (Trần Thu Hoa, 2003).
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển: 37oC.
Độ pH: thích hợp nhất 7 – 7,4.
Trên môi trường thạch đĩa TSA (Trypticase Soya Agar): Khuẩn lạc dạng R

(Rough) có rìa răng cưa không đều, tròn, khô, tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu
vàng sám, đường kính 3-5 mm. Sau 1-4 ngày, bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẫm.
Môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, khuẩn lạc màu hơi xám, rìa gợn sóng.
Môi trường canh TSB (Trypticase Soya Broth): Khuẩn lạc phát triển làm đục
môi trường, tạo màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẫn
mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
2.1.2.6 Đặc điểm sinh hóa
Các phản ứng sinh hoá được sử dụng để khẳng định B. subtilis: Khả năng phân
giải casein (+), gelatin (+) và các phản ứng indol (–), citrate (+), urease (–), catalase
(+), VP (+), oxidase (+), glucose (+), arabinose (+), maltose (–), galactose (–),
mannitol (+), xylose (–), sucrose (+), lactose (+),... (Nadeem và ctv, 2007).
2.1.3 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
B. subtilis có khả năng hình thành nội bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên
hay khi gặp điều kiện sống bất lợi. Quá trình bào tử hóa bắt đầu vào cuối pha logarit
và kéo dài khoảng 8-10 giờ trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm. Bào
tử hình bầu dục, kích thước 0,9 x 0,6 μm. Nội bào tử nằm lệch tâm hoặc gần tâm,
không làm biến dạng tế bào mẹ. Đặc điểm nổi bật của bào tử B. subtilis là có khả
năng chịu đựng nhiệt, hóa chất độc và enzyme phân giải nhờ có lớp vỏ bào tử. Sự
khác nhau giữa nội bào tử vi khuẩn và tế bào sinh dưỡng được trình bày trong bảng
2.2 (Trần Thu Hoa, 2003).

6


Bảng 2.2: Sự khác nhau giữa tế bào sinh dưỡng và nội bào tử vi khuẩn
Đặc tính

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

- Cấu trúc

Tế bào gram dương

Vỏ của bào tử dày,

điển hình

Áo bào tử
Exosporium (ở vài loài)

- Soi kính hiển vi

Ít chiết quang

Chiết quang mạnh

+ Canxi, axít amin lưu huỳnh

Thấp

Cao

+ PHP, tổng hợp đại phân tử

Có

Không

+ Polysaccharide, hoạt tính enzyme

Cao

Thấp

+ Protein

Thấp hơn

Cao hơn

- Thành phần hóa học

+ Protein* diệt côn trùng (vài loài), Không

Có

axít dipicolinic
+ Chuyển hóa (tiêu thụ O2)

Cao

Không có hoặc rất ít

+ mRNA

Có

Không có hoặc rất ít

+ Đặc tính chịu nhiệt, chịu các chất

Yếu

Cao

+ Đặc tính chịu bức xạ

Kém

Mạnh

+ Khả năng bắt màu chất nhuộm

Dễ nhuộm

Dùng phương pháp đặc biệt

+ Với lysozym

Nhạy

Đề kháng

hóa học và axít

Ghi chú:
PHB: poly-b-hydroxybutyrate, nguồn năng lượng cho quá trình tạo bào tử
Protein* : Protein tinh thể

7


2.1.4 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis
Các thành viên thuộc họ B. subtilis có khả năng sản xuất nhiều chất kháng
nấm, vi khuẩn và được phân thành 2 lớp: Peptide được tổng hợp bằng ribosome như
subtilin, subtilosin A, TasA và sublancin có bản chất là bacteriocin. Còn bacylisin,
chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và những lipopeptide
(surfactin, fengycin, iturin) được gọi là các antibiotic không được tổng hợp bằng
ribosome (Leclère và ctv, 2005).
2.1.4.1 Peptide antibiotic được tổng hợp bằng ribosome
- Subtilin: Những antibiotic thuộc nhóm này có tính kháng khuẩn mạnh trên vi
khuẩn Gram dương như Propionibacterium acnes, Staphylococci, Streptococci và
Clostridia (Klein và Entian, 1994). Operon của subtilin gồm có spaS, spaC, spaB,
spaT, SpaR và spaK; trong đó SpaR và spaK mã hóa cho protein điều hòa quá trình
tổng hợp subtilin (Klein và Entian, 1993), spaI mã hóa cho thành phần protein của
lipopeptide và bảo vệ tế bào chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE và spaG
mã hóa việc thực hiện tiết subtilin ra môi trường bên ngoài (Stein và ctv, 2005)
- Subtilosin: Có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes. Các
gen chịu trách nhiệm cho quá trình tổng hợp subtilosin được mã hóa trên operon
sbo-alb. Operon của subtilosin bao gồm các gen: sboA mã hóa dạng tiền chất của
subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi
sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa protein chịu
trách nhiệm cho sự tự đề kháng của B. subtilis với subtilosin (Zheng và ctv, 2000).
- Sublancin: Không có tác động với vi khuẩn Gram âm nhưng có khả năng ức
chế mạnh trên vi khuẩn Gram dương kể cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử. Sublancin
là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thường trong khoảng thời gian 2
năm không làm mất hoạt tính của sublancin. Operon của sublancin gồm có 2 gen:
sunA, sunT (Paik và ctv, 1998).

- Tas A: Là peptide kết hợp với bào tử của B. subtilis, có phổ kháng khuẩn
rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường khoảng 30 phút sau khi quá trình tạo bào
tử bắt đầu. Tas A giúp cho B. subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nẩy

8


mầm (Stover và ctv, 1999). Operon của Tas A bao gồm 3 gen: yqxM, sipW và tasA
(Stover và Drisk, 1999).
2.1.4.2 Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome
- Surfactin: Là 1 lipopeptide, có hoạt tính bề mặt rất mạnh cho nên có tính
kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus, ít có tác động trên nấm nhưng khi kết hợp với
iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm (Vollenbroich và ctv, 1997). Surfactin được
tổng hợp phần lớn nhờ vào phức hợp gồm có 3 enzyme: SrfA, SrfB và SrfC (Sieber
và ctv, 2003).
- Fengycin: Có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm, các gen chịu trách nhiệm
tổng hợp fengycin gồm fenC, fenD, fenE, fenA và fenB (Lin và ctv, 1999).
- Mycosubtilin: Là 1 lipopeptide thuộc họ iturin, có tính đối kháng mạnh với
nấm. Operon của mycosubtilin bao gồm các gen fenF, mycA, mycB và mycC
(Duitman và ctv, 1999).
- Bacilysocin: Là 1 phospholipid; tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol
và được phát hiện đầu tiên trên vi khuẩn B. subtilis. Có tính kháng mạnh đối với
nấm nhưng cũng có hoạt tính trên vi khuẩn. Protein YtpA là 1 enzyme khóa cho
việc tổng hợp bacilysocin bởi sự thủy phân của phosphatidylglycerol (Tamehiro và
ctv, 2002).
2.2 KHÁI QUÁT VỀ MYCOTOXIN VÀ AFLATOXIN
2.2.1 Mycotoxin
Mycotoxin là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp bởi một vài loại nấm có nguồn
gốc tự nhiên (Agag, 2004) và được biết đến từ trước những năm 1962 sau hậu quả
của bệnh X gây chết khoảng 100.000 gà tây ở Anh Quốc (Blount, 1961). Trong khi

đó bệnh X ở gà tây này có liên quan đến việc làm hỏng thức ăn có chứa đậu phụng;
mà nó là sản phẩm biến dưỡng thứ cấp từ A. flavus, đã thúc đẩy các nhà khoa học
hình thành một lĩnh vực nghiên cứu mới về độc tố nấm mốc từ đó đến nay. Những
độc tố nấm mốc có thể là chất độc gây tổn thương gan, thận, hệ thần kinh, hệ miễn
dịch,... (Bennett và Klich, 2003).

9


Phần lớn mycotoxin đều có trọng lượng phân tử thấp (bảng 2.3), chúng có khả
năng gây biến đổi bệnh lý trên người và động vật (Bennett, 1987; trích dẫn Bennett
và Klich, 2003). Bệnh độc tố nấm mốc (mycotoxicosis) được định nghĩa là hội
chứng nhiễm độc khi người và động vật tiếp xúc với mycotoxin thông qua con
đường tiêu hóa (FAO, 1990; trích dẫn Lê Anh Phụng, 2002). Những triệu chứng của
bệnh độc tố nấm mốc tùy thuộc vào loại độc tố nấm mốc; số lượng và thời gian
nhiễm; tuổi, sức khỏe, giới tính trên từng cá thể (Bennett và Klich, 2003). Theo
Agag (2004), triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào tình trạng dinh dưỡng của thú.
Bảng 2.3: Trọng lượng phân tử của một số loại AF do nấm mốc sinh ra
Mycotoxin

Những loài nấm mốc sản xuất chủ yếu

Trọng lượng phân tử
(kDa)

AFB1

A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. niger

312

AFB2

A. flavus, A. parasiticus, A. nomius

314

AFG1

A. parasiticus, A. nomius

328

AFG2

A. parasiticus, A. nomius

330
(Oancea và Stoia, 2008)

2.2.2 Aflatoxin
Đây là độc tố chủ yếu do vi nấm A. flavus và A. parasiticus sản sinh ra, được
phát hiện và mô tả sau cái chết của hơn 100.000 gà tây (bệnh X ở gà tây) ở nước
Anh với tổn thương gan rất nặng như hoại tử, chảy máu trong gan, tăng sinh ống
dẫn mật,... (Blount, 1961). Các AF này thuộc nhóm độc tố nấm mốc gây ung thư; là
nguyên nhân của những trường hợp ngộ độc cấp tính, mãn tính trên người và động
vật, thêm vào đó nó còn là nguyên nhân gây ung thư gan (William và ctv, 2004;
trích dẫn Shetty và ctv, 2007).
2.2.2.1 Các loại độc tố aflatoxin
Các AF được sản xuất trong tự nhiên gồm có 4 loại chủ yếu và được ký hiệu là

AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 do tính phát huỳnh quang dưới tia UV (B: Blue; G:
Green) (Bennett và Klich, 2003).
B1 và B2: trong ánh sáng UV của đèn huỳnh quang phát ra màu xanh nước biển.

10