DSpace at VNU: Nghiên cứu sử dụng hai chủng Bacillus T20 và M27 như các chế phẩm sinh học để tăng năng suất cây rau cải làn Brassica Oleracea var. Albolabra Bailey

TẠP CHi KHOA H Ọ C DHQGHN. KHTN & CN. T.xx, số 2PT.. 2004

NGHIÊNCỨUSỬDỤNGHAI CHỦNGB A C I L L U S
T20VÀM27 NHƯCÁCCHÊ' PHAMsinh học đe tảng năng
SUẤT CÂYRAUCẢI LÀNB R A S S I C A O L E R A C E A VAR.
ALBOLABRABAILEY
N gô T ự T h à n h
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
1. M ở đ ầu

B acillus là m ột trong những chi vi khuẩn có nhiều hoạt tính sinh học quý. H àng loạt
hoạt tính enzym đã được p h á t hiện [7], đặc biệt là các proteaza kiểm [3,4,8]. Các hoạt tính
khác bao gồm: khả nãng kh án g vi khuẩn gây bệnh héo xanh ỏ cà chua [1], sinh axit indol
axetic (IAA) [2], ph ân hu ỷ p h o tp h at khó ta n [9], ph ân h u ỷ bã th ả i động v ậ t giáp xác
[10].... C hính nhò th ế, vi k h u ẩ n này đã được dùng dể đư a vào các ch ế phẩm hoặc phân
sinh học [1,2,6].
Trong nghiên cứu này chúng tôi trìn h bày những đặc tín h sinh học của hai chủng
Bacillus sp. T20 và M27 và việc ứng dụng chúng nhằm tăng năn g s u ấ t cây ra u cải làn
ịBrassica oleracea var. albolabra bailey).
2. Đ ôi tư ợ n g v à p h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
a) Vi s in h vật: Hai chủng ưa kiềm Bacillus sp. T20 và M27 được phân lập từ đất.
b) Môi trư ờ n g nuôi: Môi trường Horikoshi & Akiba cải tiến (môi trường sô' 1) để nuôi
dịch th ể hai chủng, có th àn h phần như sau (g /ỉ): glucoza 10, gelatin 5, cao nấm men 0,3,
KH2P 0 4 2, M gS 04.7H20 0,2.
•

Môi trường thạch d in h dưỡng (môi trưòng số 2) để xác định tổng sô' vi sinh v ật hiếu

khí của đ ất trồng, có th àn h ph ần như sau (g/l): pepton 5, cao th ịt 3, NaCl 5, thạch 16.

c) Xác định hoạt tính các enzym và axit indol axetic (IAA)

- Proteaza được xác địn h bằng phương pháp khuyếch tá n trê n thạch. 0,2m l dịch nuôi
được nhỏ vào các lỗ có đường kính 10m m trê n các đĩa thạch có cơ chất (gelatin, sữa gầy) rồi
giữ ờ tủ lạnh trong 36 giờ. S au đó vòng phân huỷ được p h át hiện bằng cách trá n g lên các đĩa
1m l sulphat am ôn bão hoà. Đưòng kính vòng phán huỷ được đo, tính bằng m m .
■

A m ilaza và Carboxymetyl xenlulaza (CMC-aza) được xác định bằng cách cấy điểm

trên đĩa thạch có cơ chất tương ứng (tinh bột, CMC), sau 48 giờ, trá n g lên đó 1m l lugol và đo
vòng phân huỷ x u ất hiện xung quanh khuẩn lạc, tín h bằng mm.
- Ureaza được định tính bằng cách lần lượt cho vào ông nghiệm các dịch sau (ml): dịch
nuôi vi khuẩn 1; đệm p h o tp h at 0,1M, p H 7 ,l 2; u rê 3% 1; nưốc c â t 0; toluen 2 giọt;
phenolphtalein 1% trong cồn 2 giọt. Trong ống dối chứng thì u rê được thay bằng nước cất.

167


Ngfl T ự Thành

168

Nếu dịch nuôi có hoạt tín h ureaza, th ì ông thí nghiệm sẽ có m àu hồng so với ông đối chứng
không màu.
• A xit indol axetic (IAA) được định tính bằng cách cho 1m l dịch nuôi (trê n môi trường
có bố sung tryptophan) tác dụng với 2m t thuốc thử Salkowski (Xanpe). K ết quả là dương
tính nếu xuất hiện m àu hồng, từ hồng n h ạ t đến đỏ, tuỳ theo hàm lượng IAA.
d) Đếm tô n g s ố vi s in h vậ t h iếu k h í trong đất
Cấy g ạt 0,1m l huyền dịch đ ấ t ở độ pha loãng thích hợp lên đĩa môi trưòng. Đếm các
khuẩn lạc xuất hiện, từ đó tín h ra sô’ CFU/g đ ất như sau:
Sô lương CFU/g = a . — . 10 = -----

k

Trong đó:

k

a: sô’khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa
k: độ pha loãng của huyền dịch
10: hệ sô để quy về 1m l huyền dịch.

e) X ác đ ịn h ả n h h ư ở ng c ủ a c h ế p h ẩ m 2 c h ủ n g B a c illu s lên s in h trư ở n g và n ă n g

suất của cây rau cải làn ( B r a s s i c a o l e r a c e a var. Albolabra Bailey)
Huyền dịch nuôi sục khí 24 giờ tuổi của hai chủng T20 và M27 được dùng để tưối
cho rau cải làn. Một luông ra u cải làn diện tích 30m 2 được chọn làm th í nghiệm . Luông được
chia làm nhiều ô ứng vối các công thức 1, 2, 3, (CT|, CT2, CT3) xen kẽ nh au (tổng diện tích
các 6 cúa mỗi công thức là 10m2):
CT,: tưới mỏi trường không nuôi vi khuẩn
CT>: tưới huyền dịch chủng T20
CT3: tưới huyền dịch chủng M27
• Lịch tưới là: 8; 15; 23 và 33 ngày tuổi (lúc thu hoạch). Lượng tưói (mllgốc) theo thứ
tự các lần tưới là 10, 50, 70 và 70. Nền phân bón vô cơ trê n toàn diện tích (kg ) là u rê 1,2;
supe lân 1,7; KC1 0,7.
• Các đại lượng đ ể đánh giá sinh trường của cây rau cải là n : C hiểu cao cảy (trung
bình của 10 cây ngẫu nhiên trong mỗi công thức, cm), sô’ lá (tru n g bình như trên), năng su ất
trên diện tích 10m2của mỗi công thức (tổng trọng lượng các cây (bỏ gốc và lá già) trong từng công
thức. kg).
3. K ết q u ả v à th ả o lu ậ n
a)

Một s ố đ ă c tín h s in h học củ a h a i ch ủ n g T20 và M27

• Hoạt tính proteaza
Hoạt tính này được đánh giá qua khả năng phân huỷ gelatin và sữa gầy. Kết quả nêu
trên h inh 1 cho th ấy cả h ai chủng đểu có h ai h o ạt tín h n ày , và ch ủ n g T20 m ạnh hơn
chủng M27.


Nghiên cứu sứ dụng hai chủng bacillus T20 và M27...

25 -

20s

Khả năng phâr huỷ
gelatin
■ Khả năng phâr b u ỷ rta

15

Ằ_

Chủng
Hình 1. Hoạt tính phân huỷ gelatin và sữa gầy của 2 chủng T20 và M27
Ghi chú: D là dường kính vòng phân huỷ (mrn)
• Hoạt tính am ilaza và CMC-aza
Bằng kỹ th u ặ t cấy điểm, các hoạt tính này được xác định là tương đương nhau ở hai
chủng: đường kính vòng p h ân hnỷ tin h bột của T20 và M27 lần lượt bằng 19,5 và 20mm,
đưòng kính vòng phân huỷ CMC đều bằng 20mm.

• H oạt tính ureaza và hoạt tín h sinh axit indol axetỉc (IAA)
Các phép định tín h cho thấy hoạt tính ureaza là dương tín h ở chủng M27, âm tín h ở
chủng T20, còn hoạt tính IAA đều dương tính ở cả hai chủng, ở M27 m ạnh hơn so với ở T20.
b)
Tác d ộ n g c ủ a c h ế p h ẩ m h a i ch ủ n g T20 và M27 đ ến tổ n g s ố vi s in h v ậ t (VSV)
h iếu k h í tr o n g đ ấ t trồ n g rau cả i là n
CFU(xlO ')!g

136

150

112

100a

1

H ình 2. Sô' lượng v sv hiếu khí trong 4 loại đất.
Xác định tổng sô 'v s v hiếu k h í trong 4 công thức đất: trưốc khi trồng ra u cải làn (TT),
đô'i chứng = cõng thức 1 (CTt): được tưối định kỳ môi trường không nuôi h ai chủng, công


Ngô Tự Thành

170

thức 2 (CTo): được tưới định kỳ huyền dịch nuôi chủng T20, và công thức 3 (CT3): được tưới
định kỳ huyền dịch nuôi chủng M27.
Kết quả nêu trê n hình 2 cho th ấy sô lượng v s v hiếu khí tăn g dần từ trước khi trồng

tới sau khi thu hoạch. Điểu đáng chú ý là sô' lượng này ở h ai loại đ ấ t được tưới hai huyền
dịch của hai chủng đểu cao hơn so với ờ đ ất dối chứng (CT,). Ngoài ra, chủng T20 có tác
dụng tãng cưòng sô' lượng v s v hiếu khí m ạnh hơn so vối M27.
c)

T ác động của c h ế p h ẩ m h a i chủng T20 và M27 đến sinh trưởng của cây rau cài l

Thí nghiệm được tiến hàn h theo 3 công thức như trong m ục b. K ết quả được nêu trong
hinh 3, bảng 1, và hình 4.

ŒCT1 (Tưới môi trường không nuôi 2 chủng)
■ CT2 (Tưái huyền dịch chủng T20)
EỈCT3 (Tưới huyên dịch chủng M27)
Hình 3. Chiều cao cây rau cài làn ờ ba công thúc thi nghiệm
B ả n g 1. Sô lá trung bình của cây rau cải làn ở 3 công thức th í nghiệm .
____ _________Công thức
Tuổi cây
~

CT1

CT2

Trưốc trồng (cây con)

4

4

CT3

4

15 ngày

5,8

6,2

6,1

23 ngày

7,3

8,0

8,5

33 ngày (thu hoạch)

6,7

7,5

8,3

Qua hình 3, bảng 1 và hình 4 th ấy rằ n g chế phẩm của h ai chủng đểu có tá c dụng tích
cực đến các đại lượng được theo dõi của cây (chiểu cao, sô'lá, trọng lượng cây). Tác dụng này,
theo tuổi cây, càng vê sau càng rõ.
Ngoài ra còn thấy rằng tác dụng cùa chế phẩm chủng M27 là lớn hơn của chủng T20.

Điều này có th ể liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến h ai đặc tín h vượt trội của M27: hoạt
tính ureaza m à T20 không có, và hoạt tính sinh IAA m ạnh hơn của T20.


ứ dung haj cluing bacillus T20 và M27...

CT1

CT2

CT3

Công thức
Hình 4. Tông trọng lượng các cây rau cài làn ờ từng công thức thí nghiệm (10 m2)
4. K ế t lu ậ n
Hai chủng Bacillus ưa kiểm T20 và M27 có hoạt tính phân huỷ gelatin và sữa gầy,
phân huỷ tinh bột, cacboxymetyl xenluloza, tổng hợp axit indol axetic. Riêng M27 còn có
thêm hoạt tính ureaza. Huvền dịch nuôi của hai chủng đêu có tác dụng tô t vâi cây rau cải
làn Brassica oleracea var. albolabra bailey (tăng chiểu cao, sô'lá, trọng lượng cây). Tác dụng
này của chúng M27 lớn hơn của chủng T20.
T À I L IỆ U TH A M KH Ả O
1.

Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Quỳnh Mai, Hồ Kim Anh, Nguyễn Ngọc
Dũng, Nguyễn Thị Hồng Nhị. Phạm Văn Toàn, Lựa chọn thành phần các chủng vi khuẩn
trong phân vi sinh vặt đa chức năng cho cây cà chua, Báo cáo khoa học Hội nghị Cõng nghệ
sinh học toàn quốc lần thử hai. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003, tr.194-198.

2.

Phạm Việt Cường, Phạm Văn Toản, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Kim Cúc, Sinh
tổng hợp indol-acetic-acid (IAA) của một số chủng vi khuẩn chi Bacillus phân lập từ đất
trồng tại Việt Nam, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lẩn thứ 2,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003, tr.213-217.

3.

Horikoshi K., Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms, P art I.
Alkaline protease produced by Bacillus No 221, Agr, Biol. Chem, 1971, 35, pp. 1407-1414.

4.

Horikoshi K., and T. Akiba, Alkaline microorganisms: A new microbial
Scientific Society Press, Tokyo, 1982.

5.

Madan M.. Dhillon s., Singh R-. Production of alkaline protease by a UV-mutant of
Bacillus polymvxa, Indian J. Microbiol, 2000, 40 (1), pp. 25-28.

6.

Lâm Tú Minh. Trần Vãn Tuân, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu, Nghiên cửu công nghệ
sản xuất phân bón vi sinh vặt đơn chủng và đa chủng ứng dụng cho một số cây trồng, Báo
cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần th ứ 2, NXB Khoa học và Kỳ thuật,
H à Nội. 2003, tr.325-329.

world, Japan

N g ỏ T ự Thành

172

7.

Priest F.G., Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus, Bacteriological reviews,
1977,
Vol.41, No.8, pp. 711-753.

8.

Scriban R., Biotechnologie, 2ème édition, Technique Documentation (Lavoisier), Paris, 1984.

9.

Trấn Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhương,
Nguyễn Lan Hương, sử dụng vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân để sản xuất phân hữu
cơ vi sinh từ phân mùn, rác và đánh giá hiệu quà trên cây trổng, Hội thảo Quốc tế sinh học,
Hà Nội, 2001, tr.464-469.

10. Yang J.K., L.Shihi, Y. Tzeng, and s . Wang., Production and purification of protease from a
Bacillus subtilis th a t can deproteinize crustacean w astes, Enzyme and microbial
technology, 2000, 26 (5), pp. 406-413.
VNU JOURNAL OF SCIENCE. Nat.. Sci.. & Tech.. T.xx. Np2AP.. 2004

U S E O F T W O S T R A I N S B A C I L L U S S P . T 2 0 A N D M 2 7 A S B IO L O G IC A L

PREPARATIONSAPPLIEDTOTHECABBAGE(B R A S S Ỉ C A

O LERACEA

VAR. ALBOLABRA)
Ngo T u T h a n h
D epartm ent o f Biology, College o f Science, VN U

The two alkalophilic bacterial strain s Bacillus sp. T20 and M27 showed th e following
activities: degradation of gelatin, milk, starch, carboxym ethyl cellulose. They also
synthesized indol acetic acid. Only th e strain M27 presented urease activity. Both fluid
cultures of the two s tra in s showed positive effect on th e grow th of th e cabbage (Brassica
oleracea var. albolabra): they increased th e height and th e w eight of the cabbage as well as
th e num ber of leaves.