Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

TRẦN THỊ NGA
Tên đề tài:
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH & CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

TRẦN THỊ NGA
Tên đề tài:
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH ĐẠM CAO TRONG TỰ NHIÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:Chính quy

Chuyên ngành:Công nghệ sinh học
Lớp

:K44 - CNSH

Khoa

:CNSH & CNTP

Khóa học

:2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Văn Chí

Thái Nguyên, năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,
em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy
cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí, giảng
viên Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em hoàn
thành khoá luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Vi Đại Lâm, giảng viên Khoa CNSH CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai
lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP,
trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá
trình học tập và hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nga


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1.Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất ........................10
Bảng 2.2. Sự hiện diện của vi khuẩn Azosprillum ở một số loại hoa màu................16
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ...................................................26
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ......................................................27
Bảng 3.3: Môi trường thạch Burk’ không đạm .........................................................27
Bảng 3.4: Môi trường thạch Ashby...........................................................................27
Bảng 3.5: Môi trường Dobereiner và cộng sự .........................................................28
Bảng 3.6: Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) ..................................................28
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, kích thước các vi khuẩn cố định
đạm phân lập được. ......................................................................................36
Bảng 4.2:Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn đã phân lập được ............38
Bảng 4.3: Hàm lượng đạm của chủng vi khuẩn ĐT1 trong môi trường Dobereiner
lỏng ..............................................................................................................39
Bảng 4.4.Kết quả đo OD của IAA chuẩn ở các nồng độ khác nhau .........................40
Bảng 4.5. kết quả đo OD của chủng ĐT1 qua thời gian ............................................41
Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái, Gram của chủng vi khuẩn ĐT1 .................................43
Bảng 4.7. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn ĐT1 .................................43
Bảng 4.8. Kết quả đo mật độ tế bào của chủng ĐT1 sau 48h ở mức sóng 660nm ....45
Bảng 4.9 Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn cố định đạm (ĐT1) phân lập.....46
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến mật độ tế bào của chủng ĐT1
sau 0h và 48h nuôi cấy ................................................................................46
Bảng 4.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của
chủng ĐT1 ....................................................................................................48

Bảng 4.12. ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng ĐT1 ..................49
Bảng 4.13. Kết quả đo mật độ tế bào trên các môi trường thay thế của chủng ĐT1 .....50


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Chủng vi khuẩn ĐT1 tuyển chọn được sau 4 ngày trên môi trường Ashby .....39
Hình 4.2. Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và
OD530nm ........................................................................................................40
Hình 4.3. Đồ thị hàm lượng IAA của chủng ĐT1 sinh ra qua thời gian ...................41
Hình 4.4. Các ống nghiệm chứa các nồng độ IAA(µg/ml) chuẩn khác nhau phản
ứng với thuốc thử Salkowski .......................................................................42
Hình 4.5. Phản ứng màu IAA với thuốc thử salkowski của chủng ĐT1 nuôi cấy
5 ngày ..........................................................................................................42
Hình 4.6. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của chủng ĐT1 .........................................43
Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng quan hệ với oxy và khả năng sinh khí của chủng
ĐT1 ...............................................................................................................44
Hình 4.8. Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể Dobereiner của
chủng ĐT1 ....................................................................................................44
Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng ĐT1...................47
Hình 4.10 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của chủng ĐT1 .48
Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn ĐT1 ....49


iv

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ATP:

Adenosin Triphosphat

DNA:

Deoxyribonucleic acd

IAA:

Indole – 3 – acetic acid

OD:

Optical Density

RNA:

Ribonucleic acid


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iii
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................................................. iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v

PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích đề tài .....................................................................................................3
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................3
1.4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4
2.1.Cơ sở khoa học ......................................................................................................4
2.1.1. Đạm ...................................................................................................................4
2.1.2. Auxin (IAA) ......................................................................................................8
2.1.3. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ................................................................11
2.1.4. Một số vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp auxin .......................15
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .........................................................20
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ...................................................................20
2.2.2. Nghiên cứu trong nước....................................................................................22
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...26
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................26
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................26
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................................26
3.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................26
3.3.2. Thiết bị sử dụng ..............................................................................................27
3.4. Môi truờng sử dụng ...........................................................................................27
3.5. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................28
3.6. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................29


vi

3.6.1. Phương pháp thu thập mẫu..............................................................................29

3.6.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn. ............................................................29
3.6.3. Phương pháp mô tả đă ̣c điể m hin
̀ h thái , đă ̣c điể m sinh ho ̣c của các chủng vi
khuẩ n cố đinh
̣ đa ̣m. ...................................................................................................32
3.6.4. Nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế .......................................................35
3.6.5. Phương pháp định danh sơ bộ .........................................................................35
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................36
4.1. Kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố
định đạm cao trong tự nhiên......................................................................................36
4.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự
nhiên ..........................................................................................................................36
4.1.2. Kết quả tuyển chọn..........................................................................................38
4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh IAA của chủng ĐT1 ....................................40
4.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi
khuẩn ĐT1 .................................................................................................................42
4.4. Kết quả định danh sơ bộ chủng vi khuẩn ĐT1 phân lập được ............................45
4.5. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối của chủng ĐT1 .........46
4.5.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của
chủng ĐT1. ................................................................................................................46
4.5.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khố của chủng
ĐT1 ............................................................................................................................48
4.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn
ĐT1 ............................................................................................................................49
4.6. Kết quả nghiên cứu sử dụng môi trường thay thế. .............................................50
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................51
5.1. Kết luận ..............................................................................................................51
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây
trồng và do đó nó quyết định năng suất và chất lượng thu hoạch. Nitơ có trong
thành phần của hầu hết các chất trong cây: protein, axit nucleic, các sắc tố quang
hợp, các hợp chất dự trữ năng lượng: ADP, ATP, các chất điều hoà sinh trưởng
,… Như vậy nitơ vừa có vai trò cấu trúc, vừa tham gia trong các quá trình trao
đổi chất và năng lượng. Nitơ có vai trò quyết định đến toàn bộ các quá trình sinh
lý của cây trồng.
Nitơ trong tự nhiên tồn tại dưới 3 dạng: N hữu cơ, N vô cơ và nitơ ở dạng tự
do(N2) trong khí quyển. Cây chủ yếu hút N vô cơ, còn dạng N2 trong khí quyển thì
cây không đồng hóa trực tiếp mà phải nhờ sự cố định của các vi sinh vật trong đất.
Dạng nitơ vô cơ mà cây đồng hóa là nitrat (NO3-) và amon (NH4+) [29].
Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu được không chỉ đối
với cây trồng, mà ngay cả đối với vi sinh vật (VSV). Nguồn dự trữ nitơ trong tự
nhiên rất lớn. Người ta ước tính rằng trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai
chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây
trồng hàng chục triệu năm (nếu như cây đồng hóa được chúng).
Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ.
Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.1015 tỷ tấn nitơ. Nhưng tất cả nguồn nitơ trên
cây trồng không thể tự đồng hóa được mà phải nhờ VSV. Thông qua hoạt động của
các loài VSV nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa thành các dạng
dễ tiêu cho cây trồng sử dụng.
Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ. Bằng cách bón
phân,con người trả lại cho đất được khoảng > 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản

được bổ sung bằng nitơ do hoạt động sống của VSV cố định nitơ [31].
Người ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng
cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ. Hiệu suất sử dụng phân hóa học của cây trồng


2

là vào khoảng 75%. Như vậy có nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá
học thì muốn có 5 tấn hạt chúng ta phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ
(tương đương với 833kg amôn sunphát). Số lượng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn
ngay cả ở nước có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển [10].
Vậy làm thế nào để trả lại độ phì nhiêu cho đất mà vẫn đảm bảo tiêu chuẩn về
năng suất và chất lượng cho cây trồng?
Đó là sử dụng sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ đa chủng từ các
nguồn khác nhau, đây chính là giải pháp hay nhất hiện nay có thể giải quyết được
các vấn đề trên. Tại Ấn Độ, sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ cho lúa, cao
lương, bông làm tăng năng suất trung bình 11,4%, 18,2% và 6,8% hay mang lại lợi
nhuận 1015 rupi, 1149 rupi và 343 rupi/ ha. Tại Liên Bang Nga, bón chế phẩm VSV
cố định nitơ cho tăng năng suất khoai tây 12,8 tạ/ha, tăng năng suất cà chua 28,0
tạ/ha, tăng năng suất ngô hạt 22,4 tạ/ha, tăng năng suất cây bắp cải 72,5 tạ/ha.
Ở Việt Nam các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh ở
15 tỉnh miền Bắc, miền Trung, và miền Nam trên diện tích hàng chục ngàn ha cho
thấy trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân VSV cố định nitơ đề
tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện ở bộ lá phát triển tốt hơn, tỉ lệ nhánh hữu hiệu,
số bông/khóm nhiều hơn đối chứng. Năng suất hạt tăng so với đối chứng 6 – 12%,
nhiều nơi đạt 15 – 20%. Những ruộng bón phân VSV cố định nitơ giảm bớt 1kg
đạm ure cho mỗi sào, năng suất vẫn tăng so vớ đối chứng. Đối với rau (xà lách, rau
diếp, khoai tây…) bón phân VSV cố định nitơ cũng làm tăng sản lượng thu hoạch
20- 30%. Việc bón phân VSV cố định nitơ còn làm tăng khả năng chống chịu cho
cây và giảm lượng nitơ tồn dư trong rau. Hiệu quả kinh tế do sử dụng phân VSV cố

định nitơ là rõ rệt.
Ngoài tác dụng trên phân VSV thông qua các hoạt chất sinh học của chúng
còn có tác dụng điều hòa, kích thích quá trình sinh tổng hợp của cây trồng, đồng
thời nâng cao sức đề kháng của cây trồng đối với một số sâu, bệnh hại.( đã được
nghiên cứu trên cây khoai tây) [31].
Do đó việc nghiên cứu phân lập các vi sinh vật cố định nitơ là rất cần thiết.


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full