Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân lơxêmi cấp dòng tủy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ
FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ
FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015

Người hướng dẫn khoa học:

Th.S. NGUYỄN VŨ BẢO ANH


HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em xin gửi lời cảm ơn tới Đảng ủy, Ban
giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo
mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Quang Vinh, chủ nhiệm Bộ
môn Huyết học Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô trong Bộ
môn đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học
tập và thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi tới ThS. Nguyễn Vũ Bảo Anh lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc, người thầy đã cho em những bài học đầu tiên về nghiên cứu khoa
học, luôn tận tình dành thời gian quý báu và công sức chỉ bảo cho em trong
suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban lãnh đạo Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện tốt nhất cho e hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bác sỹ, các anh chị kỹ
thuật viên đang làm việc tại khoa Tế bào tổ chức học, khoa Di truyền sinh học
phân tử, phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương
đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bệnh nhân đã cung cấp cho em những
số liệu quý giá để thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
bên cạnh, cổ vũ và động viên cả em học tập và hoàn thành khóa luận này.
Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Văn Huy


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, do nỗ lực
của bản thân dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS. Nguyễn Vũ Bảo Anh. Các
số liệu, kết quả được trình bày trong nghiên cứu này là trung thực do tôi thu
thập tỷ mỉ và chính xác tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.
Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào
khác. Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khoa học, không nhằm mục đích riêng
nào khác.
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Văn Huy


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 2
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP ...................... 2
1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP ............................................... 2
1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc ......................................... 2
1.2.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư............... 3
1.2.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc ................................... 3
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc ........... 5

1.3.1. Phương pháp hình thái học ............................................................. 5
1.3.2. Phương pháp hóa học tế bào ........................................................... 6
1.3.3. Phương pháp miễn dịch học ........................................................... 7
1.3.4. Phương pháp di truyền tế bào ......................................................... 7
1.3.5. Xếp loại LXMc ............................................................................... 7
1.4. CÁC ĐỘT BIẾN GEN TRONG LXMc DÒNG TỦY ........................ 10
1.4.1. Đột biến gen NPM1 ...................................................................... 10
1.4.2. Đột biến gen FLT3 ........................................................................ 12
1.4.3. Một số đột biến gen khác .............................................................. 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 15
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 15
2.2.2. Nội dung và biến số nghiên cứu ................................................... 15
2.2.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc dòng tủy ........................................ 16


2.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 16
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................... 21
2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU .................................. 22
2.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 23
3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ......................... 23
3.1.1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo tuổi ...................................... 23
3.1.2. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo giới ...................................... 24
3.1.3. Phân bố bệnh nhân theo thể bệnh FAB ........................................ 24
3.2. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3-TKD
CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ................................................................. 25
3.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD . 25
3.2.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và

FLT3-TKD theo giới .................................................................... 25
3.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 26
3.2.4. Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo
xếp loại FAB................................................................................. 27
3.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC Ở BỆNH NHÂN CÓ
CÁC ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3-TKD ..... 28
3.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen
NPM1-mutA ................................................................................. 28
3.3.2. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD... 30
3.3.3. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen
FLT3-TKD.................................................................................... 32
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 34
4.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ......................... 34


4.1.1. Đặc điểm về tuổi ........................................................................... 34
4.1.2. Đặc điểm về giới ........................................................................... 34
4.1.3. Đặc điểm phân bố thể bệnh của bệnh nhân theo xếp loại FAB .... 35
4.2. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3TKD CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU ............................... 35
4.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD trong nhóm nghiên cứu ............................................. 35
4.2.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo giới ............................................................................... 36
4.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 37
4.2.4. Tỷ lệ bệnh nhân có đột pbiến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo xếp loại FAB ............................................................... 37
4.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC CỦA BỆNH NHÂN CÓ
ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD, FLT3-TKD .................... 38
4.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen
NPM1-mutA ................................................................................. 38

4.3.2. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen
FLT3-ITD ..................................................................................... 39
4.3.3. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen
FLT3-TKD.................................................................................... 41
KẾT LUẬN .................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN

: Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

: Acid ribonucleic

CD

: Cluster of differantiation (Kháng nguyên biệt hóa)

FAB

: French – American – Bristish (Pháp - Mỹ - Anh)

FLT3

: FMS – like tyrosine kinase 3

Hb

: Hemoglobin (Huyết sắc tố)

ITD

: Internal Tandem Duplication (Đột biến lặp đoạn liên tục)

LXMc

: Lơ xê mi cấp

MPO

: Myeloperoxydase

NPM1

: Nucleophosmin 1

NST

: Nhiễm sắc thể

PAS

: Periodic – Acid - Schiff

SLBC

: Số lượng bạch cầu

SLHC

: Số lượng hồng cầu

SLTBTX

: Số lượng tế bào tủy xương

SLTC

: Số lượng tiểu cầu

TKD

: Tyrosin Kinase Domain (Đột biến vùng Tyrosin kinase)

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung ............................. 8
Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008 .................................... 9
Bảng 3.1: Phân bố tuổi của nhóm nghiên cứu ............................................... 23
Bảng 3.2: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD ....... 25
Bảng 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và

FLT3-TKD theo nhóm tuổi........................................................... 26
Bảng 3.4: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo
xếp loại FAB ................................................................................. 27
Bảng 3.5: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA ...... 29
Bảng 3.6: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD ..... 31
Bảng 3.7: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD ... 33
Bảng 4.1: Tỷ lệ LXMc dòng tủy theo xếp loại FAB của một số tác giả ....... 35


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính của nhóm nghiên cứu .................................... 24
Biểu đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân theo xếp loại FAB ...................................... 24
Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3ITD và FLT3-TKD .................................................................... 25
Biểu đồ 3.4: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA .... 28
Biểu đồ 3.5: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD .... 30
Biểu đồ 3.6: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD .. 32

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST ..................................................... 11
Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST....................................................... 12
Hình 2.1: Kết quả điện di trên gel của gen NPM1 ........................................ 21
Hình 2.2: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-ITD ................................. 21
Hình 2.3: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-TKD................................ 21

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu .................................................... 22


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp (LXMc) là một bệnh lý ác tính không thuần nhất, bệnh
được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non ác tính trong tủy
xương và ở máu ngoại vi. Những tế bào này lấn át và ức chế quá trình trưởng
thành và phát triển của các tế bào bình thường trong tủy xương [1].
Từ năm 2001, Tổ chức Y tế thế giới đã đề xuất phân loại LXMc dòng
tủy dựa trên những biến đổi di truyền. Một số gen đã được nghiên cứu và ghi
nhận có vai trò quan trọng trong tiên lượng và đáp ứng điều trị bệnh. Trong
đó, 2 đột biến gen đặc trưng cho LXMc dòng tủy là NPM1 và FLT3 [2].
Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự năm
2005. Đột biến gen NPM1 gặp khoảng 50% bệnh nhân LXMc dòng tuỷ có
kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi (2-8%).
Bệnh nhân có đột biến gen này thường có tiên lượng tốt [3].
Đột biến gen FLT3 gặp khoảng 30% bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểu
hình nhiễm sắc thể bình thường. Bệnh nhân có đột biến gen FLT3 có tiên
lượng xấu ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao
và thời gian sống chung ngắn [4].
Để đánh giá vai trò của 2 đột biến gen NPM1 và FLT3 trong tiên lượng
và điều trị bệnh nhân LXMc dòng tủy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp
dòng tủy” với mục tiêu:
1. Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen NPM1 và FLT3 ở bệnh nhân LXMc
dòng tủy tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.
2. Mô tả đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến
gen

NPM1

và

FLT3.


2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP
Năm 1827, Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên. Năm 1845, Bennett đã
đặt tên cho bệnh là “leucocythemia” (tăng bạch cầu).
Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Virchow đã dùng kính hiển vi
quang học để soi tiêu bản máu bệnh nhân và ông đã thấy bạch cầu ở những
bệnh nhân này tăng rất cao làm máu trắng như sữa. Virchow gọi bệnh này là
“leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) hay tiếng Việt gọi là Lơ xê
mi, tên gọi này được sử dụng cho đến hiện nay.
Năm 1877, nhờ vào phát minh nhuộm tiêu bản máu, Ehrlich đã phân biệt
được những dạng khác nhau của bạch cầu.
Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (lơ xê mi cấp)
để chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính. Năm 1900, Naegeli đã chia lơ xê mi
cấp thành dòng tủy và dòng lympho. Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương
đơn dòng mono năm 1913. Vào năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh lơ xê mi
cấp tiền tủy bào lần đầu tiên.
Đến nay, bằng các phương pháp hình thái học và hóa học tế bào, miễn
dịch, di truyền chúng ta đã hiểu rõ và có cái nhìn cụ thể về bệnh lơ xê mi cấp.
1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP
1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc
Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro,
người ta phát hiện rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa, bắt
nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra các tế bào máu đa năng rồi tới tế bào máu
đầu dòng cho từng dòng [5]. Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do

3

nhu cầu của cơ thể thông qua cơ chế điều khiển ngược mà đích tác động cuối
cùng là gen có vai trò trong biệt hóa. Khi có rối loạn một khâu nào trong dây
chuyền này sẽ dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát được của tế bào, hoặc
làm tế bào ngừng trưởng thành nhưng vẫn phân chia và dẫn đến LXMc [6].
1.2.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư
Có hai hệ thống gen với các chức năng khác nhau, cùng phối hợp để
kiểm soát sự tăng sinh ác tính, duy trì quá trình sống bình thường của tế bào
và cơ thể:
 Các tiền gen sinh ung thư (proto - oncogene): Là các gen có vai trò
trong quá trình tăng sinh và biệt hoá tế bào. Sự ổn định tương đối về cấu trúc
và chức năng của các gen này giúp tế bào phát triển bình thường. Ngược lại,
khi có rối loạn cấu trúc đáng kể như bị tái tổ hợp với retrovirus thì nó sẽ
chuyển thành gen ung thư (oncogene) và sinh ra một protein ung thư, tác động
lên chính bộ máy phân bào và tạo ra các đặc tính ác tính [6].
 Các gen ức chế khối u (anti - oncogene): Có vai trò ức chế sự phát
triển của khối u. Sự đột biến, sắp xếp lại hoặc chuyển đoạn làm bất hoạt các
gen này, mất khả năng ức chế sự tăng sinh ác tính [7]. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng, các gen này thường đóng vai trò trong sự tiến triển của bệnh từ
âm ỉ trở thành toàn phát.
Sự hoạt hoá proto - oncogene và bất hoạt anti - oncogene làm cho tế bào
tăng sinh dễ dàng và không bị kiểm soát, ngăn cản sự biệt hóa và ngăn cản
quá trình tế bào chết theo chương trình dẫn đến các bệnh ác tính. Trong cơ
thể, gen sinh ung thư và gen bình thường có thể tồn tại song hành, trong đó
gen sinh ung thư là gen trội [8].
1.2.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc
 Tổn thương gen truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào

4

Những gen này truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào thông qua
receptor tyrosin kinase kích hoạt phosphoryn hóa làm cho tế bào tăng sinh.
Do đột biến, gen này trở thành gen ung thư làm thay đổi hình thể protein dẫn
đến thay đổi chức năng của chúng. Một số gen hoạt động theo con đường này
là BCR-ABL, c-Kit, FLT3. Gen này có vai trò trong sự tiến triển thành LXMc
chứ không có vai trò trong biến đổi ác tính tiên phát [6].
 Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép
Các gen Ig lymphocyte B và gen receptor lymphocyte T: khi các tế bào
T và B chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của
ADN lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với các protein lạ (các
Ig và các receptor tế bào T). Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ở
các proto - oncogene thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [8].
 Tổn thương gen liên quan đến quá trình tế bào chết theo chương trình
Nhiều loại tế bào được lập trình trước bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi
chết sau đó qua một thời gian sống nhất định. Khi các gen này bị tổn thương,
tế bào tiếp tục được sinh ra nhưng không già và chết đi như bình thường đã
lập trình trước, nên sẽ ứ đọng lại và gây mất cân bằng. Hai gen tổng hợp
protein tyrosin kinase và protein P53 tác động theo cơ chế này [6], [8].
 Hoạt hóa oncogene ở bệnh máu ác tính
Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa các oncogene hoặc sự
bất hoạt các anti-oncogene với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nếu chỉ có sự
hoạt hóa của một oncogene thì chưa đủ điều kiện dẫn tới chuyển dạng ác tính.
Cần có sự phối hợp của nhiều oncogen hoặc sự biến đổi anti-oncogene mới
làm các tế bào bình thường chuyển thành ác tính. Cơ chế chuyển dạng ác tính
gồm 4 dạng chính sau [9]:
 Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST:

5

Chuyển một đoạn của NST này tới NST khác tạo nên sự sắp xếp mới,
tạo ra gen lai mới, phiên mã một protein mới có hoạt tính tăng sinh tế bào.
 Đột biến điểm:
Là những bất thường do thay đổi thành phần hoặc số lượng các nucleotid
trên ADN gồm các dạng thêm bớt, thay thế hay đảo vị trí của một vài cặp
nucleotid trên gen [10], [11].
 Nhân gen:
Có nhiều nghiên cứu cho thấy thừa NST số 8 sẽ thừa gen MYC và gây LXMc.
 Virus ARN, ADN gây ung thư
Khác với virus gây bệnh nhiễm trùng khi vào tế bào sẽ nhân lên nhiều
lần và phá vỡ tế bào tiếp tục chu kỳ mới, các virus gây ung thư tìm cách gắn
bộ gen vào vị trí các oncogene làm cho các gen này hoạt động dẫn đến kích
thích tế bào tăng sinh và gây bệnh ác tính [11].
 Bất hoạt gen ức chế khối u
Trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát hiện tượng tăng sinh
tế bào, đó là gen ức chế khối u. Khi những gen này bị mất hay bất hoạt, dẫn
tới không kiểm soát, không kiềm chế được sự phân bào, gây ra khối u. Gen ức
chế khối u hoạt động theo cơ chế điều khiển ngược. Khi tế bào phân chia quá
mức sẽ tạo cơ chế feedback, chính các yếu tố phiên mã sẽ kích thích gen ức
chế khối u để tạo ra một yếu tố ức chế lại yếu tố phiên mã. Trong trường hợp
gen ức chế khối u bị mất vai trò, yếu tố phiên mã sẽ tự tác động làm tế bào
phân chia quá mức và gây bệnh ác tính [12].
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc
1.3.1. Phương pháp hình thái học

6

Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bản tủy
xương, dựa vào hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào blast, ngoài ra ta có
thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác tính.
1.3.2. Phương pháp hóa học tế bào
Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc
trưng cho từng dòng tế bào đã được vận dụng để hình thành các phương pháp
nhuộm hóa học tế bào, các phương pháp phổ biến hiện nay đang sử dụng cho
xếp loại LXMc như: nhuộm Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen, Periodic
Acid - Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế bằng
NaF, Esterase đặc hiệu [13], [14].
Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào hạt dòng tủy và
mono có chứa men MPO có tác dụng oxy hóa các cơ chất như gốc phenol,
một số acid thơm và acid amin. Các tế bào hạt dòng tủy cho phản ứng dương
tính, dòng mono có thể dương tính ở mức độ thấp riêng dòng lympho thì hoàn
toàn âm tính.
Phương pháp nhuộm Sudan đen sử dụng Sudan đen là chất tan trong
lipid nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào. Kết quả nhuộm Sudan đen
dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức
độ khác nhau còn dòng lympho thường âm tính. Trên cùng một tế bào thì mức
độ dương tính của Sudan đen thường mạnh hơn MPO nhưng thường có sự
song hành kết quả giữa hai phương pháp này [13].
Phương pháp nhuộm PAS là sử dụng Periodic Acid - Schiff để nhuộm
glycogen, các tế bào máu có sự phân bố glycogen khác nhau trong bào tương.
Nhuộm PAS cho kết quả thường âm tính với các tế bào dòng bạch cầu hạt và
mono nhưng lại dương tính mạnh với dòng lympho [14].
Nhuộm Esterase không đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán LXMc
dòng mono vì các tế bào thuộc dòng mono cho phản ứng dương tính mạnh và bị

7

ức chế bởi NaF [14]. Phương pháp nhuộm Esterase đặc hiệu để phân biệt tế bào
dòng mono và dòng bạch cầu hạt, dòng bạch cầu hạt sẽ cho phản ứng dương
tính. Nhuộm Esterase đặc hiệu và không đặc hiệu đều âm tính với dòng lympho.
1.3.3. Phương pháp miễn dịch học
Đây là phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện những
dấu ấn trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương. Dấu ấn miễn dịch tế bào thay
đổi tùy theo lứa tuổi và dòng tế bào. Hiện nay, có hai phương pháp đang sử
dụng rộng rãi là phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang và phân
loại miễn dịch bằng máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry). Các tế bào
LXMc thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các CD13, CD14, CD33,
CD34, CD117. Các tế bào thuộc dòng lympho dương tính với CD3, CD7,
CD10, CD19, CD20 [15], [16].
1.3.4. Phương pháp di truyền tế bào
Nghiên cứu bệnh sinh LXMc nhận thấy có liên quan đến tổn thương di
truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào non
gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh LXMc, biểu hiện
tổn thương di truyền trong LXMc rất đa dạng bao gồm cả những bất thường
về số lượng đến những bất thường về cấu trúc phân tử. Những bất thường
NST và gen đặc trưng rất có ý nghĩa trong chẩn đoán thể bệnh, lựa chọn điều
trị và tiên lượng. Một số bất thường NST và gen hay gặp trong bệnh LXMc
dòng tủy là t(15;17), t(8;21), t(9;22), inv(16), del(7), đột biến gen NPM1,
FLT3, CEBPA. Trong LXMc dòng lympho hay những bất thường NST và
gen là NST Philadelphia, đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4 [17], [18].
1.3.5. Xếp loại LXMc
 Xếp loại LXMc theo FAB 1986 có bổ sung
Xếp loại LXMc theo FAB năm 1986 được dựa vào hình thái học tế bào,
hóa học tế bào và dấu ấn miễn dịch.

8

LXMc được chia làm 2 nhóm bệnh là LXMc dòng tủy và LXMc
dòng lympho. LXMc dòng lympho có 3 thể: L1, L2, L3; dòng tủy có 8 thể
từ M0 đến M7.
Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung
Thể Đặc điểm hình thái, hóa học tế bào

Dấu ấn miễn dịch

Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào
M0 có nhân không thuộc dòng hồng cầu,

CD34+

không có thể Auer, < 3% MPO+
Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào
M1 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, hiếm

HLA-DR, CD13,
CD33, CD15, CD11±

thể Auer, > 3% MPO+
Tế bào non chưa biệt hóa < 90% các tế bào
M2 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, nhiều
thể Auer
M3

LXMc tiền tủy bào, tế bào blast > 30%
Dưới nhóm : M3v
LXMc dòng tủy – mono

M4 Dưới nhóm: M4eo tăng tế nào non bất
thường dòng bạch cầu ưa acid
LXMc dòng mono, các tế bào thuộc dòng

M5

mono chiếm > 80% các tế bào trong tủy

HLA-DR, CD13,
CD33, CD15, CD11±
CD33, CD13, CD15,
CD11
HLA-DR, CD34±,
CD33, CD15±, CD14,
CD64, CD11
HLA-DR, CD34±,
CD33, CD15±, CD14,
CD64, CD11

≥ 50% là các tiền thân hồng cầu, blast dòng
M6 tủy ≥ 30% các tế bào có nhân không thuộc

Glycophorin A

dòng hồng cầu
M7

≥ 30% tế bào tiền thân dòng mẫu tiểu cầu

* Xếp loại LXMc theo WHO 2008

HLA-DR, CD61,
CD42, CD34±, CD33±


9

Năm 2001, WHO đã đưa ra bảng xếp loại mới cho LXMc dòng tủy dựa
trên đặc điểm tế bào di truyền, miễn dịch và bất thường di truyền ở mức độ
NST và gen. Năm 2008 được cập nhật bổ sung.
WHO đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc với tỷ lệ blast ≥ 20% tế bào
có nhân trong tủy.
Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008
1. LXMc dòng tủy có những bất thường vật chất di truyền tái diễn:
 LXMc dòng tủy với t(8;21)(q22;q22): gen AML1/ETO
 LXMc dòng tủy với inv(16)(p13.1;q22): gen CBFβ/MYH11
 LXMc tiền tủy bào với t(15;17)(q22;q12): gen PML/RARα
 LXMc dòng tủy với t(9;11)(q22;q23): gen MLLT3/MLL
 LXMc dòng tủy với t(6;9)(q23;q34): gen DEK/NUP214
 LXMc dòng tủy inv(3)(q21;q26.2): gen RPN1/EVI1.
 LXMc dòng tủy (dòng mẫu tiểu cầu) với t(1;22)(p13;q13): gen
RBM15 - MKL1
 LXMc dòng tủy có biến đổi gen NPM1
 LXMc dòng tủy có biến đổi gen CEBPA
2. LXMc dòng tủy có có liên quan đến hội chứng rối loạn sinh tủy (MDS
hoặc MPD/MDS)

3. LXMc dòng tủy có liên quan đến điều trị
4. LXMc dòng tủy không xếp loại (tương đồng xếp loại FAB):
 LXMc dòng tủy có sự biệt hóa tối thiểu.
 LXMc dòng tủy không có sự trưởng thành.
 LXMc dòng tủy có sự trưởng thành.
 LXMc dòng tủy - mono
 LXMc dòng mono/nguyên bào mono
 LXMc dòng tủy dòng hồng cầu
 LXMc dòng tủy mẫu tiểu cầu


10

 LXMc dòng bạch cầu hạt ưa base
 Tăng tế bào tủy cấp kèm theo xơ tủy
5. Sarcoma tủy
6. Tăng sinh dòng tủy có liên quan đến hội chứng Down
7. Tân sản tế bào tua non dạng tương bào
1.4. CÁC ĐỘT BIẾN GEN TRONG LXMc DÒNG TỦY
Bất thường về cấu trúc và/hoặc số lượng NST có thể phát hiện được ở 60
đến 80% bệnh nhân LXMc dòng tủy. Những bất thường hay gặp nhất đó là
trisomy 8, monosomy 7, monosomy 21, trisomy 21, mất một NST X hoặc
NST Y. Trên thực tế thì bất kỳ một NST nào cũng có thể bị ảnh hưởng. Ở
những bệnh nhân bị LXMc dòng tủy thứ phát sau điều trị hóa chất hay tia xạ,
bất thường di truyền hay gặp nhất là mất một phần hoặc toàn bộ NST số 5. Đã
từ lâu, những biến đổi NST được sử dụng để xếp loại LXMc dòng tủy và đã
từng được coi là một trong các yếu tố quan trọng để phân nhóm nguy cơ, tiên
lượng khả năng đáp ứng với hóa trị liệu, đánh giá nguy cơ tái phát và thời
gian sống thêm của bệnh nhân [17], [18].
Bên cạnh các biến đổi nhiễm sắc thể, một số đột biến gen cũng tham gia

vào các yếu tố tiên lượng quan trọng của LXMc dòng tủy, hay gặp nhất là các
gen sau: NPM1, FLT3, CEBPA, MLL, NRAS [19].
1.4.1. Đột biến gen NPM1 (Nucleophosmin 1)
Gen NPM1 nằm trên NST số 5q35.1 bao gồm 12 exon mã hóa 259 acid
amin. Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự
năm 2005 [2], [3].


11

Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST
NPM1 có rất nhiều vai trò như tham gia vào quá trình phân bào, tháo
xoắn ADN, dịch mã kết hợp với riboxom tham gia tổng hợp protein và sửa
chữa ADN. Ở các tế bào bình thường, NPM1 là một phosphoprotein trong
nhân tế bào và hoạt động như một yếu tố điều hòa chu trình tế bào và con
đường ức chế khối u (ARF)/TP53.
Đột biến gen NPM1 hay gặp nhất là ở exon 12 (thêm 4 nucleotid TCTG)
là đột biến NPM1-mutA. Kết quả là protein đột biến NPM1 không tồn tại
trong nhân tế bào nữa mà xuất hiện ở trong bào tương tế bào. Có thể phát hiện
được protein NPM1 trong bào tương bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch.
Đột biến gen NPM1 là một biến đổi về vật chất di truyền hay gặp nhất ở
LXMc dòng tủy. Đột biến này gặp khoảng 50% ở bệnh nhân LXMc dòng tuỷ
có kiểu hình NST bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi 2-8% [3].
Đột biến gen NPM1 thường phối hợp với một số đột biến gen khác: 40%
các bệnh nhân có NPM1 thường có phối hợp đột biến gen FLT3 (cả ITD và
TKD), có tới 60% kèm theo đột biến gen FLT3-ITD; có thể đi kèm với một số
bất thường NST hay gặp là +4, -Y, del(9q) và một số ít t(8,21), inv(16), t(15,17),
11q23/MLL; rất hiếm xuất hiện cùng đột biến gen CEBPA. Một số các nghiên
cứu lớn với những bằng chứng rõ ràng đã chỉ ra rằng nhóm bệnh nhân có đột
biến gen NPM1 có tiên lượng tốt hơn hẳn nếu không có đột biến gen FLT3-ITD

đi cùng. Thời gian sống của bệnh nhân khi có đột biến gen NPM1 60% trong khi
tỷ lệ này là 20 đến 30% bệnh nhân có đột biến gen FLT3 [2], [3].


12

Đột biến gen NPM1 tồn tại khá bền vững từ khi bệnh nhân được chẩn
đoán cho đến khi tái phát, dường như đây là một yếu tố chính trong quá trình
sản sinh các tế bào LXMc. Tính bền vững và tỷ lệ gặp cao trong LXMc dòng
tủy nên người ta nghĩ đến việc sử dụng đột biến này như một marker sinh học
phân tử để theo dõi và đánh giá bệnh tồn dư tối thiểu trong tương lai [3]
1.4.2. Đột biến gen FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3)
Gen FLT3 nằm trên NST 13q12 và có 24 exon. Nó mã hóa cho một
receptor có hoạt tính tyrosin kinase gắn trên màng tế bào, có vai trò rất quan
trọng đối với sự tăng sinh, biệt hóa và sống sót của các tế bào gốc tạo máu.

Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST
Đột biến gen FLT3 gặp với tỷ lệ khá cao khoảng 30% ở bệnh nhân
LXMc dòng tủy có kiểu hình NST bình thường. Hai kiểu đột biến của gen
FLT3 hay gặp phổ biến là đột biến lặp đoạn liên tục (ITD - Internal Tandem
Duplication) và đột biến vùng tyrosin kinase (TKD - Tyrosin Kinase
Domain). Trong đó kiểu đột biến FLT3-ITD gặp với tỷ lệ cao 20-25%, đoạn
lặp có kích thước thay đổi từ 3 cho đến 400 nucleotide và kết quả làm tăng
thêm chiều dài của protein được mã hóa. Đột biến FLT3-ITD dẫn đến sự hoạt
hóa tyrosine kinase và hệ thống truyền tín hiệu PI3K/AKT, Ras/MAPK và
JAK2/STAT. Đột biến FLT3-TKD xảy ra ở codon 835-836 của vùng tyrosine
kinase thứ hai, gặp khoảng 5-10% ở bệnh nhân LXMc dòng tủy [2], [4].
Tỷ lệ gặp đột biến gen FLT3 thay đổi giữa các dưới nhóm của LXMc
dòng tủy, tỷ lệ gặp cao nhất ở nhóm có kiểu hình NST bình thường và nhóm
LXMc tiền tủy bào có chuyển đoạn t(15;17). Hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra

13

rằng bệnh nhân LXMc dòng tủy có đột biến gen FLT3-ITD có tiên lượng xấu
ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao và thời gian
sống chung ngắn hơn nhóm không có FLT3-ITD. Trong khi đó, ảnh hưởng
của đột biến gen FLT3-TDK lên điều trị và tiên lượng còn gây nhiều tranh cãi
và cần thêm nhiều nghiên cứu lớn khác để đánh giá tác động của đột biến này
trên LXMc dòng tủy. Khác với đột biến NPM1, đột biến gen FLT3 có thể
thay đổi giữa thời điểm chẩn đoán và tái phát, với khoảng 9% bệnh nhân sẽ
mất đột biến FLT3-ITD. Thêm nữa chiều dài của gen FLT3-ITD cũng có sự
thay đổi giữa các thời điểm chẩn đoán và tái phát, chính vì thế mà người ta
không thể sử dụng đột biến FLT3-ITD làm một marker trong theo dõi bệnh
tồn dư tối thiểu ở những bệnh nhân này [4], [20]
1.4.3. Một số đột biến gen khác
 Đột biến gen CEBPA (CCAAT/Enhancer Binding Protein, Alpha)
Gen CEBPA nằm trên NST số 19q13.11. Gen CEBPA là một yếu tố
phiên mã có tác dụng điều hòa những gen tham gia quá trình biệt hóa dòng
tủy, đặc biệt là dòng bạch cầu hạt và tế bào tiền thân dòng tủy. Có hai loại đột
biến gen CEBPA trong LXMc dòng tủy. Một loại ảnh hưởng đến vùng Nterminal, một loại ảnh hưởng đến vùng C-terminal. Đột biến gen CEBPA xuất
hiện ở 9% bệnh nhân LXMc dòng tủy nói chung và 70% trường hợp có kiểu
hình NST bình thường. Về hình thái học tế bào thì LXMc dòng tủy thể M1 và
M2 là hay gặp đột biến này nhất. Một số nghiên cứu cho rằng đột biến gen
CEBPA có tiên lượng tốt, nó tương tự như thể có đột biến gen NPM1 không
phối hợp với FLT3-ITD [19], [21]. Tuy nhiên vẫn chưa xác định được rõ là
tiên lượng của những bệnh nhân có đột biến gen CEBPA như thế nào nếu có
phối hợp đột biến gen FLT3.
 Đột biến gen MLL (Mixed-Lineage Leukemia)