NGHIÊN cứu về sự KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH của VI KHUẨN PHÂN lập từ cá kèo (pseudap ocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

PHẠM VĂN PHẾCH

NGHIÊN CỨU VỀ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ KÈO
(Pseudapocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NG ÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2012


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

PHẠM VĂN PHẾCH

NGHIÊN CỨU VỀ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ KÈO
(Pseudapocryptes lanceolatus) BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NG ÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGs.Ts. Đặng Thị Hoàng Oanh

2012

LỜI CẢM TẠ

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc gửi đến
Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý
kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Chị Trương Quỳnh Như đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên trong
suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Anh Lê Thượng Khởi, Chị Nguyễn Hoàng Nhật Uyên đã tận tình giúp đỡ và
đóng góp những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như
hoàn thành luận tốt nghiệp.
Thầy Cô và Các anh chị trong Bộ môn sinh học và bệnh học thủy sản đã giúp
đỡ trong quá trình thực hiện đề tài.
Tập thể lớp Bệnh học thủy sản K34 đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.

i


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá
kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm xác
định tính kháng thuốc của 10 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu cá kèo bị bệnh
thu ở Bạc Liêu và Sóc Trăng. Đề tài được thực hiện gồm hai nội dung: (i) lập
kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn với 12 loại thuốc kháng sinh thương
mại: Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5 µg),
Gentamicin (GM/10µg), Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg),
Ampicillin (AMP/25 µg), Amoxicillin (AML/25 µg), Trimethoprim+

sulfamethoxazole(SXT/1.25/23.75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin
(NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg); (ii) Xác định nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC) của 3 loại kháng sinh Cefalexin, Enrofloxacine và
Trimethoprim+sulfamethoxazole (SXT) với 10 chủng vi khuẩn gây bệnh trên
cá kèo. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy, đa số các chủng vi khuẩn đều nhạy
với kháng sinh thử nghiệm. Cụ thể là florfenicol (100%), ciprofloxacin và
enrofloxacine cùng chiếm 80% nhạy, 20% trung bình. Còn kháng sinh
doxycycline, cefazolin, amoxicillin, tetracycline chiếm 90% nhạy và 10%
kháng. Tiếp theo là ampicillin, trimethoprim+s ulfamethoxazole chiếm 80%
nhạy và 20% kháng. Kế đến là neomycin, norfloxacin cùng chiếm 70% nhạy;
tỷ lệ kháng lần lượt là 30%, 20% và 10% trung bình nhạy đối với norfloxacin.
Trong đó, kháng sinh gentamicin chiếm tỷ lệ kháng cao nhất là 40%, trung
bình nhạy 10% và 50% nhạy. Mặt khác, kết quả còn cho thấy có hiện tượng đa
kháng thuốc với các chủng: B1K2F1 , B3 K1F2 kháng với 2 loại kháng sinh
gentamicin và neomycin. Riêng chủng A2 F7 kháng đồng thời với 6 loại kháng
sinh là gentamicin, doxycycline, cefazolin, ampicillin, amoxicillin và
tetracycline thử nghiệm. Kết quả xác định nồng độ MIC thì có enrofloxacine
cho giá trị MIC thấp hơn hai loại kháng sinh còn lại, dao động từ ≤2ppm đến
128ppm. Kế đến, kháng sinh cefalexin có giá trị MIC dao động từ ≤2ppm đến
>512 ppm. Cuối cùng là kháng sinh trimetho prim+sulfamethoxazole (SXT)
cho kết quả giá trị MIC rất cao từ 8ppm đến >512ppm.

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... i
TÓM TẮT.................................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii

DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... vi
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................ vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................viii
PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................... 1
1.1 Giới thiệu ........................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 2
1.3 Nội dung của đề tài .......................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản
ở Việt Nam và Thế giới ........................................................................................ 3
2.1.1 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong nuôi trồng
thủy sản trên thế giới .......................................................................................... 3
2.1.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong nuôi trồng
thủy sản ở Việt Nam ........................................................................................... 4
2.2 Bệnh vi khuẩn ở nước lợ .................................................................................. 8
2.2.1 Bệnh trên tôm ........................................................................................... 8
a. Bệnh do vi khuẩn Vibrio ......................................................................... 8
b. Bệnh đốm nâu .......................................................................................... 9

iii


c. Bệnh hoại tử do vi khuẩn (Bacterial Necrosis) .................................... 9
d. Bệnh do vi khuẩn dạng sợi ..................................................................... 9
2.2.2 Bệnh trên cá .............................................................................................. 9
a. Bệnh nhóm Vibrio (Vibriosis)................................................................ 9
b. Bệnh do nhóm Pseudomonas ............................................................... 10
c. Bệnh do nhóm Streptococcus ................................................................... 10

2.3 Một số bệnh vi khuẩn trên cá kèo .................................................................... 10

2.3.1 Bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas........................................................ 10

2.3.2 Bệnh trắng da (tuột nhớt) ...................................................................... 11
2.3.3 Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio ............................................................ 11
2.3.4 Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ .......................................................... 11
2.3.5 Bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus ............................................... 11
2.4 Những nghiên cứu về bệnh vi khuẩn trên cá kèo ........................................... 12
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 13
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 13
3.2 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu ................................................................. 13
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 14
3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn ............................................................. 14
3.3.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ ........................................................... 14
3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc
kháng sinh lên vi khuẩn ................................................................................... 16
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 20

iv


4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn trên cá kèo ........ 20
4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh
lên vi khuẩn .......................................................................................................... 24
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................... 29
5.1 Kết luận............................................................................................................ 29
5.2 Đề xuất ............................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 30
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 34

v

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ........................ 15
Bảng 3.2 Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn)
..................................................................................................................................... 17
Bảng 3.3 Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) .. 18
Bảng 4.1 Đường kính vòng tròn vô trùng 10 chủng vi khuẩn thí nghiệm ......... 21
Bảng 4.2 Sự mẫn cảm của 10 chủng vi khuẩn trên cá kèo với kháng sinh ....... 21
Bảng 4.3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh
cefalexin, enrofloxacine và trimethoprim/sufamethoxazole lên 10 chủng vi khuẩn
trên cá kèo .................................................................................................................. 24

vi


DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Kết quả tách ròng vi khuẩn trên cá kèo ................................................. 20
Hình 4.2 Kết quả nhuộm gram vi khuẩn trên cá kèo ............................................ 20
Hình 4.3 Đĩa kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với chủng vi khuẩn trên cá kèo .....
..................................................................................................................................... 22
Hình 4.4 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng A2 F3 với
cefalexin ở nồng độ là 64ppm. ................................................................................ 25
Hình 4.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng A1 F2 với
enrofloxacine ở nồng độ là 4ppm. .......................................................................... 26
Hình 4.6 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng B 3 F2 với
trimethoprim+sulfamethoxazole ở nồng độ là 16ppm. ....................................... 27

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

FDA

Food and Drug Administration

NAHMS

National Animal Health Monitoring System

ESC

Enteric Septicemia of Catfifh

CFIA

Canadian Food Inspection Agency

EU

European Union

NAFIQAVED

Cục Quản lý Chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

TT-BNNPTNT Thông Tư - Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn
TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Trytic Soya Broth

MHA

Muller Hinton Agar

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

N

Neomycin

FFC

Florfenicol

CIP

Ciprofloxacin

GM

Gentamicin

DO

Doxycycline

CZ

Cefazolin

AMP

Ampicillin

AML

Amoxicillin

SXT

Trimethoprim+sulfamethoxazole

TE

Tetracycline

NOR

Norfloxacin

ENR

Enrofloxacine

viii


PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Trong những năm gần đây, thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi
nhọn của Việt Nam nói chung và của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)
nói riêng. Với hệ thống sông ngòi dày đặc, cùng hệ thống kênh rạch chằng chịt
là điều kiện rất thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản. Từ những điều kiện trên mà
ngành nuôi trồng thủy sản phát triển rất mạnh ở các tỉnh như: Cà Mau, Bạc
Liêu, An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Kiên Giang… đã mang lại hiệu quả rất
lớn cho người dân, góp phần giải quyết việc làm cho nhiều lao động, đồng thời
thông qua việc xuất khẩu các mặt hàng thủy sản đã đem lại nhiều ngoại tệ cho
đất nước. Theo Tổng cục thủy sản năm 2011, tổng sản lượng thủy sản của cả
nước ước đạt 5,2 triệu tấn, tăng 4,4% so với kế hoạch và 1,4% so với năm
2010, trong đó sản lượng khai thác ước đạt 2,2 triệu tấn, bằng 90,9% so cùng
kỳ; sản lượng nuôi trồng ước đạt 3 triệu tấn, tăng 7,8% so với kế hoạch năm
và tăng 10,8% so cùng kỳ; diện tích nuôi đạt 1.093 ha, bằng 97,3% kế hoạch
và tăng 2,5% so cùng kỳ. Xuất khẩu thủy sản ước đạt 6 tỷ USD, tăng 19,6% so
với năm 2010.

Ngoài những đối tượng nuôi phổ biến như cá tra, cá basa, tôm sú, cá điêu
hồng…có giá trị kinh tế cao. Thì cũng có một số loài cá có giá trị kinh tế cao
như cá mú, cá chình, cá chẽm, cá măng cũng được quan tâm nhằm đa dạng
hóa loài nuôi. Nuôi cá biển và cá nước lợ là một hướng mới cho ngành thủy
sản đã có bước khởi động ngoạn mục với các loài cá giò, cá mú, cá tráp…với
các hình thức nuôi lồng, bè. Trong đó, cá kèo (Pseudapocryptes lanceolatus)
cũng là đối tượng được nhiều người quan tâm. Trong những năm gần đây nuôi
cá kèo phát triển rộng khắp ở một số tỉnh ven biển ĐBSCL như Cà Mau, Bạc
Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh…nhưng hiệu quả nhất là nuôi xen canh với chân
ruộng sản xuất muối hoặc tôm sú từ quảng canh đến bán công nghiệp (Lê Văn
Lĩnh, 2009).
Trong thời gian gần đây, nghề nuôi cá kèo đang đứng trước những thách thức
lớn về vấn đề dịch bệnh xảy ra. Đã gây nhiều thiệt hại lớn về kinh tế và sản
lượng của người nuôi. Bên cạnh đó, với mức độ thâm canh ngày càng cao,
nuôi với mật độ dày, trình độ kỹ thuật và quản lý hệ thống ao nuôi chưa được
chặt chẽ và triệt để, nguồn nước bị ô nhiễm ngày càng trầm trọng. Do vậy
trong ao nuôi thâm canh bệnh xảy ra là một điều không thể tránh khỏi, trong
1


đó bệnh do vi khuẩn gây ra luôn là mối đe dọa thường xuyên đối với nghề
nuôi cá hiện nay. Khi đó, người nuôi thường tìm đến giải pháp là sử dụng
thuốc và hóa chất để xử lý và đặc biệt nhất là dùng thuốc kháng sinh. Do trên
thị trường có rất nhiều loại kháng sinh và nhu cầu sử dụng ngày càng tăng
nhưng hiệu quả lại không như mong muốn. Một trong những nguyên nhân là
do kiến thức về kháng sinh của người nuôi và người cung cấp còn nhiều hạn
chế. Điều đó dẫn đến việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách, đúng
liều và trong thời gian dài. Và khi dùng kháng sinh trong thời gian dài, với liều
thấp như vậy sẽ làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh,
làm cho công tác trị bệnh trở nên khó khăn, tốn kém hơn. Sự kháng thuốc

kháng sinh gián tiếp trong vi sinh vật có thể được hình thành thông qua các
gen nhiễm sắc thể hoặc thông qua plasmid (Prescott et al., 2000). Theo nghiên
cứu của Samira Sarter et al. (2006), cho thấy có đến 73 chủng vi khuẩn (trong
92 chủng) phân lập từ cá tra khỏe và môi trường có hiện tư ợng đa kháng
thuốc.
Theo Prescott et al. (2000), các gen kháng thuốc từ vi khuẩn có liên quan đến
động vật nuôi sẽ được truyền sang vi khuẩn có liên quan đến người qua chuỗi
thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp và tác động đến khả năng kháng thuốc của
các chủng vi khuẩn ở người. Điều này là mối đe dọa rất lớn đối với việc bảo
vệ sức khỏe của con người trong tương lai. Chính vì thế việc nghiên cứu sự
kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ cá kèo là rất cần thiết. Qua đây, nhằm
cung cấp những thông tin cho việc sử dụng kháng sinh có hiệu quả và góp
phần bảo vệ an toàn sức khỏe cho con người. Từ đó đề tài: “ Nghiên cứu về
sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá kèo
(Pseudapocryptes lanceolatus) bệnh xuất huyết” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ cá kèo
(Pseudapocryptes lanceolatus) bệnh xuất huyết nhằm cung cấp thông tin sử
dụng kháng sinh hiệu quả để phòng và trị bệnh trên cá kèo.
1.3 Nội dung thực hiện
1

Lập kháng sinh đồ của vi khuẩn phân lập từ cá kèo bệnh xuất huyết với
một số loại thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản.

2

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration –
MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn phân lập từ cá kèo bệnh xuất
huyết.

2


PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất dùng trong nuôi
trồng thủy sản ở Việt Nam và Thế giới
2.1.1 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong nuôi trồng
thủy sản trên thế giới
Trong vài nhập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có bước tiến bộ
vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để
gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bệnh bùng phát, ô nhiễm môi trường,
làm cho thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp
khắc phục, trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất nhất là kháng sinh là biện
pháp hữu hiệu. Bên cạnh đó, việc thâm canh hóa trong nông nghiệp cũng đòi
hỏi sử dụng thuốc, hóa chất để trừ sâu, diệt cỏ bảo vệ cây trồng đã rửa trôi vào
môi trường nước làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến nguồn nước cho nuôi trồng
thủy sản. Hiện nay trên thế giới có hơn 450 hợp chất được chế tạo và sử dụng
làm hóa chất bảo vệ thực vật và hầu hết chúng đều rất độc đối với con người
và động vật (Khoa và ctv, 2001. Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005). Ngoài ra,
thuốc hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản bao gồm các loại liên quan đến
vật tư công trình, xử lý đất và nước, tác nhân kháng khuẩn, thuốc trị bệnh,
thuốc trừ sâu, thuốc gây tê và hormon. (Theo Gesamp, 2001. Trích dẫn bởi
Phạm Thị Ngọc Xuân, 2009).
Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) ở các nước có ngành nuôi trồng thủy
sản phát triển mạnh như vùng Châu Á thì lại không có hoặc có chưa đầy đủ
con số thống kê và so sánh lượng thuốc, hóa chất sử dụng trong nông nghiệp
và nuôi trồng thủy sản. Nhưng theo Benbrook (2002) thì lượng thuốc, hóa chất
sử dụng trong nuôi trồng thủy sản hàng năm lên đến 433.000 Lbs (1Lbs =
0,45359237 kg) nhưng cũng chỉ bằng 2-3% lượng thuốc, hóa chất sử dụng

trong canh tác nông nghiệp đều này cũng cho thấy rằng tổng lượng thuốc, hóa
chất sử dụng mà có liên quan đến nuôi trồng thủy sản là rất lớn (Nguyễn
Chính, 2005).
Mặt khác, đối với Trung tâm Thuốc thú y thuộc FDA của Mỹ thì tất cả các
loại thuốc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản phải được sự phê chuẩn bởi tổ
chức này, và hầu hết các loại kháng sinh được dùng cho cá đều có bổ sung
thêm vào công thức thức ăn. Tuy nhiên lượng kháng sinh đó chỉ được cá hấp
3


thụ 75% còn lại thì vào môi trường nước (Goldburg và Triplett, 1997 được
trích dẫn bởi Benbrook, 2002).
Ngoài ra, theo Benbrook (2002) có 5 loại thuốc được phép sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản tại Mỹ, trong đó có 3 loại kháng sinh: oxytetracycline HCL
(Terramycin 10), sulfamerazine, và sự kết hợp giữa sulfadimethozine và
ormetoprim (Romet- 30). Theo thống kê của NAHMS (1997) tổng lượng
kháng sinh sử dụng trị bệnh ESC (Enteric Septicemia of Catfifh) hàng năm
cho cá da trơn khoảng 126.000- 252.000 pound (57.000-115.000 kg); mặc dù
đã sử dụng thuốc đặc hiệu nhưng sản lượng cá vẫn thiệt hại ở mức cao 60%.
Theo báo cáo của cục Thanh tra thực phẩm Canada (CFIA), nước này đưa
Nitrofuran vào chương trình giám sát, kiểm soát dư lượng kháng sinh trong
các sản phẩm thủy sản nuôi, nếu phát hiện trong lô hàng nhập khẩu của nước
có chứa Nitrofuran, các lô hàng này đều sẽ bị từ chối. Ở EU và ở Mỹ các loại
hóa chất, thuốc được sử dụng rộng rãi để làm phụ gia trong thức ăn nuôi cho
gia súc và thủy sản. Trước đây, trong số các loại thuốc, hóa chất thì Nitrofuran
cũng được sử dụng rộng rãi ở đây. Nhưng sau khi có báo cáo về ảnh hưởng
của Nitrofuran tới sức khỏe của con người, hóa chất này bị cấm sử dụng ở EU
vào năm 1995 và ở Mỹ vào năm 2002 ( Yên, 2003. Trích dẫn bởi Nguyễn Thị
Tuyết Trinh, 2004).
Nhận rõ sự nguy hiểm của kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng trực tiếp

đến người tiêu dùng do vậy thị trường bên ngoài đã có nhiều biện pháp nhằm
kiểm soát dư lượng kháng sinh an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản. Cụ thể ở
một số thị trường bên ngoài mà Việt Nam hướng vào như Canada, Trung
Quốc, Hàn Quốc, EU, Mỹ… đã ban hành những văn bản pháp lý làm rào cản
trong việc kiểm soát dư lượng kháng sinh tồn tại trong sản phẩm thủy sản
(Nguyễn Ngọc Hải, 2004).
Bên cạnh đó, còn có những vấn đề nóng bỏng trong lĩnh vực này như Cộng
Hòa Liên Bang Đức đòi hỏi sản phẩm thủy sản xuất khẩu gắt gao trong công
văn số 5073TM/XNK ngày 07/11/2003 hay việc cấm sử dụng formalin trong
nuôi trồng thủy sản ở Nhật Bản (Nguyễn Ngọc Hải, 2004).
2.1.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất trong nuôi trồng
thủy sản ở Việt Nam
Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản nước ta đang trên đà phát triển mạnh mẽ
và bền vững. Sản lượng nuôi trồng thủy sản ngày một tăng nhanh chóng theo
các năm. Cùng với sự phát triển trên, hình thức nuôi cũng dần dần được nâng
4


lên thâm canh hóa. Như một tất yếu của sản xuất, nhiều loại thuốc và hóa chất
đã được sử dụng nhằm nhiều mục đích như xử lý nước và các chất lắng đọng,
tăng cường năng suất sinh học tự nhiên, thành phần trong thức ăn, kích thích
sinh trưởng, quản lý sức khỏe (Phạm Thanh Liêm và ctv., 2008).
Theo Mai Văn Tài (2004) qua kết quả điều tra trong cả nước cho thấy, hiện có
khoảng 1893 loại sản phẩm sử dụng thì chỉ có 1500 sản phẩm được cấp phép.
Trong đó, có ít nhất 373 loại điều tra được với 138 kháng sinh; 14 loại xử lý
đất và nước; 6 loại gây màu nước; 86 loại hóa chất khử trùng và diệt tạp; 47
loại chế phẩm sinh học; 13 loại vitamin; 57 loại thức ăn bổ sung; 10 loại
hormone và thuốc sử dụng trong sản xuất cá giống.
Theo Cục Quản lý Chất lượng, An toàn Vệ sinh và Thú y Thủy sản
(NAFIQAVED, 2004). Cho thấy, sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt

Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm gây thiệt hại lớn
về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam do hàng bị tiêu hủy. Nhà
nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra và thường
xuyên có rà soát, bổ sung các qui định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng
kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm bảo đảm được an toàn vệ sinh thực
phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu, bảo đảm phát triển
nuôi trồng thủy sản bền vững. Tuy nhiên việc chấp hành các quy định của nhà
nước là chưa được triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn lô hàng thủy sản Việt Nam
bị nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc vượt quá giới hạn
đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình
kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực
hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước
môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử dụng như Chloramphenicol,
các chất Nitrofuran, gần đây và ở diện rộng là tồn lưu Green Malachite (Trích
dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005).
Cụ thể, trong khảo sát của Nguyễn Thị Phương Nga (2004) tại ba Tỉnh Sóc
Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau có 983 sản phẩm thương mại thuốc, hóa chất trên
648 sản phẩm thuốc, hóa chất được Bộ Thủy sản cho phép sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản được cung cấp bởi 110 nhà sản xuất, kinh doanh, trong đó các
nhóm: hóa chất (257 sản phẩm), khoáng thiên nhiên (169 sản phẩm), vitaminpremix-lipid (230 sản phẩm) và chế phẩm sinh học (191 sản phẩm), riêng
kháng sinh (136 sản phẩm) được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, trong đó
có 40 loại chỉ chứa một kháng sinh thuộc nhóm hạn chế sử dụng, còn lại là kết
hợp với ít nhất một kháng sinh hoặc thuốc giảm đau, kháng viêm, trị nấm.

5


Theo Phạm Thanh Tuấn (2004) qua điều tra về tình hình sử dụng thuốc , hóa
chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng tháp cũng được ghi nhận có 90 loại
thuốc, hóa chất được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt

tạp, trộn vào thức ăn để phòng bệnh và trị bệnh trực tiếp. Riêng kháng sinh trị
bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều
loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ ràng, riêng chất Malachite
green là chất nằm trong danh mục Bộ Thủy Sản cấm sử dụng nhưng vẫn được
người nuôi sử dụng trong nuôi cá ở đây.
Bên cạnh đó, trong ương cá tra cũng đều dùng thuốc hay hóa chất với nhiều
chủng loại khác nhau. Cụ thể, qua khảo sát tại Cao Lãnh và Hồng Ngự Tỉnh
Đồng Tháp ghi nhận được có tổng cộng gồm 155 loại, với 132 loại thuộc vùng
Hồng Ngự (85,2%) và 66 loại (42,6%) thuộc vùng Cao Lãnh bao gồm 5 nhóm.
Trong đó, cơ cấu các nhóm thuốc không đồng đều, tỷ lệ thuốc kháng sinh
nguyên liệu và thuốc có nguồn gốc kháng sinh chiếm đa số với 23 loại kháng
sinh là nguyên liệu gốc và 27 loại có chứa thành phần phối chế chuyên dùng
như kháng sinh. Kết quả này cho thấy tỷ lệ thuốc kháng sinh chiếm số lượng
lớn (40,65%) trong cơ cấu thuốc. Số hóa chất được dùng là 16 loại (10,3%),
chế phẩm sinh học là 7 loại (4,52%), vitamin và premix có số lượng 4 loại
(3,23%) và nhóm một số chất còn lại với 5 loại (2,58%). Ngoài ra, có nhiều
loại thuốc được dùng có tên gọi không rõ ràng (12% hộ nuôi), 6 loại đã được
quy định giới hạn sử dụng tối đa: ampicillin, tetracillin, oxytetracillin,
amoxicillin, cloxacillin, sulfonamide; 1 loại bị cấm hoàn toàn:
chloramphenicol đều có xuất hiện trong danh mục sử dụng ở vùng Hồng Ngự.
Mức độ đầu tư cho khoảng chi phí thuốc và hóa chất phòng trị bệnh khá cao ,
đa phần các hộ đều không nhớ hết những loại đã sử dụng và số lần phải dùng
để điều trị trong năm, ước lượng chiếm từ 8-31% (Trung bình 15,7%) tổng chi
phí vụ ương (Nguyễn Ngọc Hải, 2004).
Ngoài ra, từ kết quả khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở An Giang và Cần
Thơ, cho thấy có 394 loại thuốc, hóa chất do 75 nhà sản xuất được kinh doanh
trong khu vực. Trong đó có 16% sản phẩm kháng sinh phối trộn từ 3 kháng
sinh trở lên, vi phạm quy định về phối trộn kháng sinh: theo quyết định
07/2005 của Bộ Thủy Sản. Thuốc hóa chất nguyên liệu được bán lẻ công khai
mà không cần toa nhãn cho người sử dụng. Đối với nhóm kháng sinh, các nhà

sản xuất đưa ra những khuyến cáo chưa tưng thủ đúng quy định cũng như thời
gian ngưng sử dụng trước khi thu hoạch. Bên cạnh đó, việc người nuôi chủ
yếu dựa vào kinh nghiệm và tự pha trộn, không nhận thức được tính kết hợp
hay đối kháng của thuốc cũng như hậu quả và những vấn đề liên quan đến sức

6


khỏe con người, vật nuôi và an toàn vệ sinh thực phẩm của việc sử dụng thuốc
(Nguyễn Thị Phương Nga, 2004).
Mặt khác, về tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cho thấy các nhà sản xuất đã
thay đổi cách phối trộn, liều lượng và đặt tên khác cho sản phẩm, cùng 1 sản
phẩm nhưng có nhiều tên khác nhau như cùng sản phẩm với đơn chất là
Colistin nhưng có đến 7 tên khác nhau: Coli 1000, HHN-Coli, Colimeiji,
Vicoli, ST Colizon, ADP Colizon, Coli-tialincomplex. Ngoài ra, nhiều loại
kháng sinh điều trị cho người và gia súc cũng được người dân sử dụng trong
thủy sản. Liều lượng sử dụng rất khó xác định vì là thuốc phối chế (Nguyễn
Chính, 2005).
Theo kết quả khảo sát của Huỳnh Thị Tú và ctv (2004) về tình hình sử dụng
thuốc và hóa chất trong nuôi tôm tại 2 Tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu trong thời
gian từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2004 đã ghi nhận được 74 loại thuốc và hóa
chất. Trong đó có 20 loại thuốc và hóa chất dùng diệt tạp và tẩy trùng; 19 loại
kháng sinh; 10 loại hóa chất dùng xử lý nước; 10 loại men vi sinh; và một số
loại thuốc và hóa chất khác như phân bón, sản phẩm dùng tăng cường hệ miễn
dịch bổ sung vào thức ăn cho tôm (Phạm Thanh Liêm và ctv., 2008).
Việc sử dụng thuốc và hóa chất trong các mô hình nuôi tôm hiện đang còn ở
mức hạn chế. Cụ thể, qua điều tra tại Ngọc Hiển Cà Mau được ghi nhận có
tổng số 46 loại thuốc và hóa chất khảo sát, trong đó có 22 loại sử dụng diệt tạp
và xử lý trước khi nuôi. Đặc biệt có 2 loại bị hạn chế sử dụng là Xanh
Malachite và Thiodan (Nguyễn Thị Tuyết Trinh, 2004).

Theo khảo sát của Chi cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản tỉnh Cà Mau năm 2002
thì hiện có trên 300 loại hóa chất và thuốc được sử dụng trong nuôi trồng thủy
sản, đặc biệt là trong nuôi thương phẩm có thể gây ra những tác động xấu đến
môi trường nước và đến chất lượng tôm (Huỳnh Thị Tú và ctv., 2006).
Mặt khác, theo kết quả điều tra của Phan Trọng Duy (2007) về tình hình sử
dụng thuốc kháng sinh ở khu vực Châu Đốc, Châu Phú (An Giang), Thốt Nốt
(Cần Thơ), cho thấy có tổng số 21 loại kháng sinh thường được người dân sử
dụng, trong đó có các loại được sử dụng nhiều nhất đó là: Flofe nicol (tần suất
xuất hiện 95%), kế đến là Doxycyline (90%), Enrofloxacine (85%),
Amoxcilline (70%). Ngoài ra các chất như Kanamycine, Cefalexcin,
Colistin…cũng thường được người dân sử dụng (Phạm Thanh Liêm và ctv.,
2008).

7


Theo Trần Duy Phương (2009) qua kết quả điều tra những hộ nuôi cá tra trên
vùng nước lợ ở Trà Vinh và Bến Tre về tình hình dịch bệnh trên cá, thì có
100% số hộ được phỏng vấn sử dụng kháng sinh khi có bệnh xảy ra, điều đáng
lưu tâm là việc sử dụng kháng sinh của hầu hết các hộ nuôi là theo hướng dẫn
của người bán hàng thuốc thú y thủy sản ở địa phương, mà người sử dụng
không có hiểu biết nhiều các sản phẩm mà mình sử dụng. Các loại kháng sinh
mà người nuôi nơi đây thường sử dụng là enrofloxacine (70,97%), florfenicol
(61,29%), doxycycline (41,94%), các loại kháng sinh này được dùng để điều
trị bệnh nhiễm khuẩn cho cá bằng cách trộn vào thức ăn.
Nhìn Chung, sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi trồng thủy sản dẫn đến
tình hình sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất cũng gia tăng. Đặc biệt, sự tự
ý sử dụng thuốc kháng sinh cũng như việc ngày càng tăng liều lượng sử dụng
thuốc này vừa tốn kém chi phí cho người nuôi, vừa không mang lại hiệu quả
trong điều trị, lại gây ra một tác hại rất lớn như gây ra sự tồn lưu của thuốc

kháng sinh trong môi trường ao nuôi và xung quanh. Dẫn đến sự tồn lưu trong
cơ thể của động vật thủy sản, ảnh hưởng đến việc tiêu thụ, sức khỏe con
người. Một hậu quả nghiêm trọng khác nữa là sự kháng thuốc của vi khuẩn
gây bệnh, khiến việc điều trị về sau càng khó khăn hơn.
2.2 Bệnh vi khuẩn ở nƣớc lợ
2.2.1 Bệnh trên tôm
a. Bệnh do vi khuẩn Vibrio
Tác nhân gây bệnh thường là các vi khuẩn: Vibrio anguillarium, V.
alginolyticus, V. parahacmolyticus, V. harveyi và những loài khác. Khi nuôi ở
mật độ quá dày, cho ăn quá nhiều và quản lý môi trường ao nuôi không tốt sẽ
làm bệnh xuất hiện. Ở Trung Quốc, theo Xianle và Huang (2003) tỉ lệ chết
thường là 30-50% tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng. Nếu giai đoạn giống bị nhiễm
bệnh thì gây tổn thất nặng hơn hay mất trắng. Do vậy, các trại giống thường sử
dụng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh xảy ra và điều này có thể làm xuất
hiện nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc.
Ngoài ra, tôm nhiễm bệnh thường bơi lội mất phương hướng, các bộ phận như
vỏ, phụ bộ chân, râu và mang bị nhiễm khuẩn có màu đen đỏ hay đỏ nâu, vỏ bị
ăn mòn, cơ có màu trắng đục. Ấu trùng nhiễm bệnh thường có màu đen trên
đỉnh các phụ bộ, tôm bỏ ăn, ruột rỗng. Tôm sẽ chết dần, đôi khi chết 100%
(Từ Thanh Dung và ctv., 2005).

8


b. Bệnh đốm nâu
Nguyên nhân gây ra bệnh này là sự liên kết của nhiều tác nhân: hóa học, dinh
dưỡng, lý học. Vi khuẩn và nấm là tác nhân lây nhiễm thứ hai. Các vi khuẩn
gồm Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp …..Tôm bị bệnh có dấu hiệu
bị hoại tử, sưng viêm, đốm đen trên thân và phụ bộ; tỉ lệ chết không đáng kể
nhưng nó làm giảm giá trị kinh tế của tôm. Đây là bệnh thường xảy ra ở ao

nuôi tôm đặc biệt là hệ thống nuôi tôm công nghiệp mật độ dày (Nguyễn Kim
Cương, 2006).
c. Bệnh hoại tử do vi khuẩn (Bacterial Necrosis)
Bệnh này ảnh hưởng đến ấu trùng của tôm càng xanh giai đoạn 4-5 và gây tỉ lệ
chết 100% trong vòng 48h ở Taihiti. Dấu hiệu bệnh lý của bệnh này là cơ thể
tôm hơi xanh hoặc đổi màu, ruột trắng, ấu trùng yếu và lắng xuống đáy bể, có
những đốm nâu trên anten và phụ bộ (Nguyễn Kim Cương, 2006).
d. Bệnh do vi khuẩn dạng sợi
Bệnh này thường do các vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix sp., Thiprix sp.,
Flexibacter sp., Cytophaga sp., và Flavobacterium sp gây ra. Nhiễm bệnh vào
tất cả các giai đoạn phát triển của tôm. Bệnh này có thể gây chết 80%, hay hơn
thế nữa trong vài ngày đến vài tuần. Ở trứng nhiễm bệnh vi khuẩn bám thành
thảm dày trên vỏ, làm cản trở hô hấp hay sự nở của trứng. Ngoài ra, ở ấu trùng
và tôm bột vi khuẩn phát triển trên bề mặt cơ thể, nhất là trên các lông và phụ
bộ. Ở tôm lớn, vi khuẩn hiện diện trên các lông tơ của chân bụng, chân ngực,
chân đuôi, vẩy râu, phụ bộ miệng và mang. Tôm nhiễm nặng, mang xuất hiện
màu vàng đến xanh. Vi khuẩn dạng sợi gây cản trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây
chậm lớn hay gây chết tôm (Từ Thanh Dung, 2011).
2.2.2 Bệnh trên cá
a. Bệnh nhóm Vibrio (vibriosis)
Tác nhân gây bệnh: Vibriosis là những bệnh do nhóm Vibrio gây ra, các loại
cá nuôi nước mặn thường nhiễm những loài Vibrio sau đây: V. alginolyticus,
V. anguillarum, V. vulnificus. Ngoài ra, Các loài cá nuôi nước mặn như: cá
mú, cá chẽm, cá măng... Khi bệnh bùng nổ, có thể gây chết cá đến 50% hoặc
cao hơn ở cá nhỏ và tỷ lệ này sẽ giảm đối với cá lớn. Tuy nhiên cá mắc bệnh
sẽ bỏ ăn và kém tăng trưởng.

9

Dấu hiệu bệnh lý: cá nhiễm các loài Vibrio thường bỏ ăn hoặc ăn kém, từng
vùng trên lưng cá hoặc toàn bộ biến màu sẫm, xuất huyết điểm trên từng vùng
của cơ thể, hoại tử vây, mắt đục, lồi. Trong những trường hợp cấp tính cá có
thể chết khi chưa có biểu hiện bệnh lý, ngoài trừ bụng trướng to. Cá nhiễm
bệnh một thời gian dài thì mang cá bị bạc màu, xuất hiện những vết thương có
thể ăn sâu vào trong cơ thể. Ngoài ra, ở trại giống thì khi thấy cá trong bể
ương xuất hiện những đốm đỏ thì đó là dấu hiệu của nhiễm Vibrio.
b. Bệnh do nhóm Pseudomonas
Tác nhân gây bệnh: là do Pseudomonas anguilliseptica gây ra. Bệnh xảy ra
thường ở nhiệt độ thấp (dưới 16 0C) vào những tháng mùa đông. Ngoài ra,
bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do Pseudomonas sp gây ra và tác động cá ở
mọi giai đoạn. Tỷ lệ cá chết từ 20-60% (Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc
Du, 2006).
Dấu hiệu bệnh lý: cá có dấu hiệu bụng chướng, có những đốm xuất huyết ở
da và nội quan. Ở cá mú, thân bị lở loét, xuất huyết da, vây và đuôi, mắt lồi và
đục (Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du, 2006).
c. Bệnh do nhóm Streptococcus
Tác nhân gây bệnh: Streptococcus sp., là loại cầu khuẩn gram dương, có
đường kính 0.5-1.0mm, thường dính với nhau thành hình chuỗi. Ngoài ra, còn
là một phức hợp các bệnh tương tự nhau gây ra bởi những loài khác nhau làm
tổn hại thần kinh trung ương thông qua biểu hiện viêm mắt và viêm màng não
(Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du, 2006).
Dấu hiệu bệnh lý: cá có biểu hiện yếu và bơi xoay vòng, mắt lồi và xuất
huyết ở vùng nắp mang, quanh miệng và hậu môn, có những nốt đỏ ở vùng da
(Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du, 2006).
2.3 Một số bệnh vi khuẩn trên cá kèo
2.3.1 Bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas
Tác nhân gây bệnh: Aeromonas spp là một loại vi khuẩn sinh sản trong môi
trường nước , hiện diện trong mô của cá một cách bình thường, nhưng khi cá
bị sốc môi trường hoặc bị tổn thương. Aeromonas spp. sẽ bộc phát gây bệnh

xuất huyết trong với mức tử vong cao. Ngoài ra, cá kèo nuôi mật độ cao bị
mưa dài ngày, độ mặn thấp kéo dài, cá có thể bị bệnh do vi khuẩn Aeromonas
punctala xâm nhập (Nguyễn Chung, 2008).
10


Dấu hiệu bệnh lý: cá kém ăn, nổi lờ đờ trên tầng mặt, da sẫm màu ở vùng
bụng cá mất nhớt khô, nội tạng sung huyết và phù nề, gan thận xuất huyết, gan
tái xanh sưng to và bở. Xuất huyết vây, đuôi, từng mảng trên thân màu đỏ, hậu
môn viêm đỏ, lồi ra ngoài, mắt xuất huyết đục có thể làm mù mắt, có thể thấy
rõ sự mòn ở đuôi và vây (Nguyễn Chung, 2008).
2.3.2 Bệnh trắng da (tuột nhớt)
Tác nhân gây bệnh: vi khuẩn Pseudomonas dermoalba . Bệnh xuất hiện trên
những cá bị xây xát hoặc bị sốc do nhiệt độ, đánh bắt và vận chuyển (Lê
Thuần Nhân, 2006).
Dấu hiệu bệnh lý: cá bệnh thường tách đàn, bơi lội yếu ớt, kém ăn hoặc bỏ
ăn, trên thân có nhiều vệt nhớt trắng đục, bệnh nặng sẽ xuất hiện các vết loét
ăn sâu vào cơ làm hoại tử cơ, có nấm kí sinh quanh cơ nên dễ nhằm với bệnh
nấm thủy mi, vây cá bị rách hoặc đứt (Lê Thuần Nhân, 2006).
2.3.3 Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio
Tác nhân gây bệnh: là do nhóm Vibrio spp gây bệnh cho các loài cá nuôi
nước lợ, là tác nhân cơ hội khi cá bị sốc môi trường thay đổi sẽ gây chết hàng
loạt hay rải rác. Ngoài ra, Vibrio spp. được phân lập từ cá kèo bị bệnh là
V.narahaemotycus, V.angguillarum (Nguyễn Chung, 2008).
Dấu hiệu bệnh lý: cá bỏ ăn toàn thân bị sẫm màu với đặc trưng của bệnh là
sung huyết các vây, có đốm xuất hiện trên cơ thể, đặc biệt xuất huyết lở loét
trên mô da và cơ, phần mô xung quanh hậu môn ửng đỏ và viêm, gan, lá lách
và thận bị sung huyết có kèm theo hoại tử ruột, đặc biệt là trực tràng có thể bị
sưng lên và có dịch nhờn trong suốt (Nguyễn Chung, 2008).
2.3.4 Bệnh do nhóm vi khuẩn hình trụ

Tác nhân gây bệnh: là do nhóm vi khuẩn hình trụ Flexibacter columnaris
gây ra cho cá kèo nuôi ở nồng độ muối thấp vào mùa mưa (Nguyễn Chung,
2008).
Dấu hiệu bệnh lý: cá bị bệnh thường xuất hiện những vết thương dạng như
cái yên ngựa ở giữa cơ thể cá. Vết thương xuất hiện đối xứng hai bên cơ thể có
dạng dĩa màu vàng nhạt và biến màu đen ăn sâu vào da cá (Nguyễn Chung,
2008).
2.3.5 Bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus

11


Tác nhân gây bệnh: chủ yếu là Streptococcus iniae, S. agalactiae…, có dạng
hình cầu gây ra, bệnh xuất hiện gây tổn thất lớn, tỷ lệ chết 50-100% xảy ra khi
môi trường nuôi không thuận lợi ở những tháng có nhiệt độ cao nhưng cũng
xảy ra bất cứ khi nào trong năm. Cá giống và cá trưởng thành đều dễ mắc bệnh
này, nhất là cá kèo dưới 4 tháng tuổi (Nguyễn Chung, 2008).
Dấu hiệu bệnh lý: cá bơi không định hướng xoay vòng tròn, thân sẫm màu,
bơi trên tầng mặt, mắt lồi, xuất huyết ở mắt và gốc vây , hậu môn và một số
nơi trên cơ thể. Xoang bụng chướng có dịch đặc, túi mật sưng sẫm, lá lách
sưng, xuất huyết, gan tái, thận sưng viêm. Khi bệnh ghép với nấm làm cho
bệnh nặng thêm (Nguyễn Chung, 2008).
2.4 Những nghiên cứu về bệnh vi khuẩn trên cá kèo
Cá kèo mới được nuôi phổ biến trong vài năm gần đây nên có rất ít nghiên cứu
về bệnh trên đối tượng này. Theo Đào Minh Hải (2006) khảo sát mầm bệnh
trên cá kèo ở Sóc Trăng đã phân lập vi khuẩn trên 26 mẫu cá bệnh từ 4 cơ
quan (gan, thận, tỳ tạng và cơ), thu được 8 chủng vi khuẩn. Trong đó, đã định
danh ra được 3 nhóm vi khuẩn gồm: 5 chủng thuộc nhóm Streptococcus, 2
chủng thuộc nhóm Vibrio và 1 chủng thuộc nhóm Aeromonas. Dấu hiệu bệnh
lý như bụng phình to, xuất huyết toàn thân nhưng tập trung nhiều ở phần bụng,

vi lưng và vi ngực có vết loét ăn vào cơ, xuất huyết ở các vi, xương nắp mang
và vòm miệng. Ngoài ra, nghiên cứu cho rằng nhóm Streptococcus có khả
năng là tác nhân chính gây bệnh lở loét và xuất huyết trên cá kèo, còn hai
nhóm Aeromonas và Vibrio chỉ là tác nhân cơ hội. Kết quả khảo sát mầm bệnh
trên cá kèo nuôi ở Bạc Liêu của Lê Thuần Nhân (2006), qua 4 đợt phân tích
mẫu có tổng cộng 11 mẫu cá bệnh và đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn. Tất
cả 12 chủng này đều được định danh theo Bergey (1974) được phân làm 4
nhóm gồm có 4 chủng thuộc giống Vibrio, 3 chủng thuộc giống Aeromonas, 3
chủng thuộc giống Pseudomonas, 2 chủng Streptococcus. Với các dấu hiệu
bệnh lý như cá bơi lờ đờ, dạt vào bờ, bỏ ăn màu sắc nhợt nhạt, tuột nhớt, da
ửng đỏ xuất huyết li ti, bụng phình to, gan sưng, ruột to chứa hơi, phân màu
trắng dính ở hậu môn. Những nghiên cứu trên có thể là tiền đề cho các nghiên
cứu sau này nhằm xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá kèo để có
phương pháp phòng trị hữu hiệu và nhằm giảm thiệt hại cho người nuôi.

12


PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 5 năm 2012.

-

Địa điểm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh học và Bệnh
Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Vật liệu và đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
Cá kèo thương phẩm có dấu hiệu bệnh nuôi ở vùng nước lợ trên địa bàn hai
Tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng.
Dụng cụ
-

Đĩa Petri, ống nghiệm, giá ống nghiệm, que trãi thủy tinh, pipet 5ml và
1ml, cốc đốt ( 100ml và 250ml), chai nấu môi trường (250ml và 500ml).

-

Giấy nhôm, giấy lọc, viết chì, viết lông dầu, khay nhựa, khăn giấy, thước
đo, máy ảnh, sổ ghi chép.

-

Đèn cồn, ống quẹt, que cấy, pel.

-

Bình xịt cồn, ống falcol 50ml tiệt trùng, cuvette 3ml, hộp đầu
col,micropipette 1ml, ống eppdorf.

Thiết bị
Máy trộn mẫu (vortex), máy ly tâm, máy so màu quang phổ, tủ ấm, tủ cấy, tủ
sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh.
Môi trƣờng
Tryptic soy agar (TSA), Trytic soya broth (TSB), Muller hinton agar (MHA).
Hóa chất

-

NaCl, H2SO4 và BaCl2 .

13


-

Ethanol, Crystal violet, ammonium oxalate, iodine, alcohol, acetone,
safranin, nước cất.

Thuốc kháng sinh
-

Các loại kháng sinh dùng để lập kháng đồ gồm có: Neomycin (N/30µg),
Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5 µg), Gentamicin
(GM/10µg), Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin
(AMP/25µg), Amoxicillin (AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole
(SXT/1.25/23.75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg),
Enrofloxacine (ENR/5 µg). (Nguồn từ công ty Bio-rad và Oxoid).

-

Kháng sinh dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là Cefalexin,
Enrofloxacine và Trimethoprim+Sulfamethoxazole (SXT).

Nguồn vi khuẩn
Gồm 10 chủng vi khuẩn phân lập từ cá kèo nuôi ở Bạc Liêu và Sóc Trăng.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn
Vi khuẩn được lấy từ tủ -80 0C, rã đông. Sau đó được phục hồi trên môi trường
TSA có bổ sung 1,5% NaCl và ủ 24 giờ ở 30 0C. Quan sát hình dạng, màu sắc
khuẩn lạc, nếu khuẩn lạc đã rời rạc và đồng nhất thì tiến hành nhuộm gram vi
khuẩn để kiểm tra tính thuần. Kết quả nhuộm gram đã thuần thì tiến hành kiểm
tra kháng sinh đồ cũng như xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC.
3.3.2 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002)
Lập kháng sinh đồ của vi khuẩn với 12 loại kháng sinh là Neomycin (N/30µg),
Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10 µg),
Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg),
Amoxicillin (AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75
µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine
(ENR/5 µg).
Phƣơng pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số
3 (9x10 8 cfu/ml)
-

Vi khuẩn sau khi được phục hồi và đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng
sinh đồ.

14


-

Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống
nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều
và so sánh độ đục với ống McFarland số 3 (9,7ml 1% H2SO4 và 0,3ml 1%
BaCl2). Nếu độ đục thấp hơn ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn
lạc vào, ngược lại độ đục cao hơn thì cho nước muối sinh lý vào cho đến

khi độ đục ngang bằng với ống chuẩn McFarland . Khi đó mật độ vi khuẩn
trong ống nghiệm khoảng 9 x 10 8 cfu/ ml.

Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp trên thì tiến hành cho
dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch bằng cách dùng pipet tiệt trùng hút
lần lượt 0.1ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA có bổ sung
1,5% NaCl . Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khô. Sau đó để
yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri
sao cho khoảng cách giữa hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24mm và
khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10-15mm. Mỗi
đĩa thạch dán tối đa 6 đĩa kháng sinh. Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc
kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 30 ºC. Đọc kết quả s au 24 – 48 giờ.
Bảng 3.1 Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ
Kháng sinh
(Công ty Biorad & Oxoid)

Chuẩn đường kính vòng vô trùng
Kháng

Trung bình

Nhạy

Neomycin (N/30µg)

≤12

13 – 16

≥17

Florfenicol (FFC/30 µg)

≤16

17 – 19

≥20

Ciprofloxacin (CIP/5µg)

≤15

16 – 20

≥21

Gentamicin (GM/10µg)

≤12

13 – 14

≥15

Doxycycline (DO/30µg)

≤12

13 – 15

≥16

Cefazolin (CZ/30 µg)

≤14

15 – 17

≥18

Ampicillin (AMP/25µg)

≤13

14 – 17

≥18

Amoxicillin (AML/25µg)

≤13

14 – 17

≥18

Trimethoprim+Sulfamethoxazole

≤10

11 – 15

≥16

Tetracycline (TE/30 µg)

≤14

15 – 18

≥19

Norfloxacin (NOR/5µg)

≤12

13 – 16

≥17

Enrofloxacine (ENR/5 µg)

≤16

17 – 22

≥23

(SXT/1.25/23.75 µg)

(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)

15