Xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGÔ QUỲNH DIỆP

X¸c ®Þnh ®ét biÕn gen KRAS, BRAF,
NRAS
trong bÖnh ung th ®¹i trùc trµng
Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số

: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN VÂN KHÁNH


HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. BS. Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa
kỹ thuật Y học, Phó Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường
Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã tận tình dìu dắt, trực tiếp hướng dẫn và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn này.
GS. TS. BS. Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein,

Trưởng bộ môn Hóa Sinh, Phó Hiệu trưởng Trường Đại Học Y Hà Nội, đã tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và tham gia nghiên cứu tại Trung tâm.
PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, nguyên Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y
Hà Nội, PGS. TS. Phạm Thiện Ngọc, nguyên Trưởng Bộ môn Hóa sinh,
TS.BS. Trần Huy Thịnh Phó Trưởng Bộ môn Hóa sinh và các Thầy, Cô Bộ
môn Hóa sinh đã luôn giúp đỡ, tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt quá trình
học tập và làm luận văn này.
Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong những năm học tại trường.
Tôi cũng xin cảm ơn đến cử nhân Trần Quốc Đạt, cử nhân Trịnh Thị
Thanh Hương cùng toàn thể các Thầy Cô, các Anh, các Chị và các bạn học
viên trong Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã
tạo mọi điều kiện và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trung
tâm.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và cơ quan tôi đã luôn
chia sẻ và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2015
Ngô Quỳnh Diệp


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Ngô Quỳnh Diệp, học viên cao học khóa XXII Trường đại học Y
Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng
dẫn của Cô TS.BS Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2015

Ngô Quỳnh Diệp


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP
BRAF
CT
CEA
CA 19-9
DNA
ddNTP
dNTP
EGFR
FDA
GAP
GDP
GTP
KRAS
LPĐTTĐ
MAPK
MEK
MRI
mRNA
NST
PCR
PI3K
PET-CT
TMN

UTĐTT
15-PGDH

: Adenosine triphosphate
: Gen thuộc họ v-Raf murine sarcoma viral oncogene, mã hóa
cho protein serine/threonine – protein kinase B-raf
: Chụp cắt lớp vi tính hóa (computerised tomography)
: Kháng nguyên ung thư phôi
(Carcinoembryonic antigen)
: Carbohydrate antigen 19-9
: Acid deoxynucleic
: Dideoxynucleotid
: Deoxynucleotid
: Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô
(Epidermal Growth Factor Receptor)
: Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food Drug
Administration)
: Guanosine activated protein (protein hoạt hóa GTPase)
: Guanosine diphosphate
: Guanosine triphosphate
: Gen thuộc họ v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene
: Liệu pháp điều trị trúng đích
: Mitogen-activated protein kinase
: protein thuộc nhóm serine/threonine-selective protein kinase
: Chụp cộng hưởng từ (magnetic resonance imaging)
: RNA thông tin (messenger RNA)
: Nhiễm sắc thể
: Phản ứng khuếch đại chuỗi (polymerase chain reaction)
: Phosphatidyl inositol 3-kinase
: Chụp cắt lớp phát xạ positron (positron emission tomography)

: T: tumor – khối u; M: metatase-di căn; N-lymph node: hạch
lympho)
: Ung thư đại trực tràng
: 15-prostaglandindehydrogenase


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................5
MỤC LỤC........................................................................................................6
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................10
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................11
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1......................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................3
1.1. Tổng quan về ung thư đại trực tràng...........................................................................3
1.1.1. Dịch tễ..................................................................................................................3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh..................................................................................................4
1.1.3. Chẩn đoán.............................................................................................................6
1.1.4. Điều trị UTĐTT..................................................................................................11
1.1.5. Tiên lượng bệnh [49]..........................................................................................14
1.2. Vai trò của gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng................14
1.2.1. Con đường tín hiệu nội bào liên quan đến protein RAS/RAF...........................14
1.2.2. Các loại đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng16
1.2.3. Vai trò của đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong liệu pháp điều trị trúng
đích bệnh UTĐTT...........................................................................................20
1.3. Các kỹ thuật xác định đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS.......................................22
1.3.1. Kỹ thuật PCR.....................................................................................................22
1.3.2. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................23
1.3.3. Kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)................27

1.3.4. Kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification Refractory Mutation
System)...........................................................................................................28

CHƯƠNG 2....................................................................................................30
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................30


2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................30
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn...........................................................................................30
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ..............................................................................................30
2.2. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................30
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu............................................................................................30
2.2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu....................................................................30
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất trong nghiên cứu...................................................32
2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị........................................................................................32
2.3.2. Hóa chất dùng trong nghiên cứu........................................................................32
2.4. Các quy trình kỹ thuật...............................................................................................33
2.4.1. Thu thập mẫu......................................................................................................33
2.4.2. Tách chiết DNA.................................................................................................34
Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết..........................35
2.4.3. Khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3 gen
NRAS bằng phương pháp PCR......................................................................36
2.4.4. Giải trình tự gen đoạn exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3
gen NRAS.......................................................................................................39

Thành phần....................................................................................................40
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.........................................................................................44
2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.............................................................................44

CHƯƠNG 3....................................................................................................45

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..........................................................................45
3.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư.............................................................45
3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng cặp mồi gen nội chuẩn GAPDH............................47
3.3. Kết quả khuếch đại exon 2 gen KRAS, exon 15 gen BRAF và exon 2, exon 3 gen
NRAS.....................................................................................................................47
3.4. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen........................................49
3.4.1. Kết quả giải trình tự gen KRAS.........................................................................49
3.4.2. Kết quả giải trình tự gen BRAF.........................................................................52
3.4.3. Kết quả giải trình tự gen NRAS.........................................................................53
3.5. Kết quả xác định tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF và NRAS..................................54


CHƯƠNG 4....................................................................................................56
BÀN LUẬN....................................................................................................56
4.1. Bàn luận về kỹ thuật xác định đột biến.....................................................................57
4.2. Bàn luận về tỷ lệ đột biến gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh UTĐTT..............61
Đột biến gen BRAF trong bệnh UTĐTT: Hiện nay có hơn 30 loại đột biến BRAF
được công bố, trong đó chiếm tới 90% là kiểu đột biến V600E, xảy ra trên
codon 600 chuyển acid amin Valine thành Glutamate [12]. Nghiên cứu này
bằng kỹ thuật giải trình tự gen đã phát hiện được 03 trường hợp mang đột
biến gen BRAF chiếm tỷ lệ 6%, và tất cả đều là kiểu đột biến V600E xảy ra
trên codon 600 exon 15 của gen BRAF. Kết quả của nghiên cứu này là phù
hợp với một số nghiên cứu khác khi thấy đột biến gen BRAF chủ yếu là kiểu
Val600Glu (V600E). Như trong nghiên cứu của Jolien và cs sử dụng kỹ thuật
giải trình tự gen xét nghiệm cho 519 bệnh nhân UTĐTT, phát hiện 45 trường
hợp mang đột biến BRAF chiếm tỷ lệ 8,7%, và 90% là kiểu đột biến điểm
Val600Glu (V600E) [61].................................................................................63
Đột biến gen NRAS trong bệnh UTĐTT: Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật giải trình
tự gen xét nghiệm 50 bệnh nhân UTĐTT thể biểu mô tuyến thấy có 01 bệnh
nhân mang đột biến gen NRAS kiểu Gly12Val (G12V), đột biến chuyển acid

amin Glycine thành Valine tại codon 12, chiếm tỷ lệ 2%. Nghiên cứu này của
chúng tôi có kết quả phù hợp với một số nghiên cứu khác về tỷ lệ thấp đột
biến gen NRAS trong bệnh UTĐTT. Nghiên cứu của Vaughn và cs năm 2011
đã chỉ ra 21 trường hợp mang đột biến NRAS trong tổng số 513 bệnh nhân
UTĐTT được lựa chọn để tiến hành xét nghiệm, chiếm tỷ lệ 4,09% [62].
Nghiên cứu của Natsumi và cs năm 2010 cũng thấy đột biến gen NRAS ở
bệnh nhân UTĐTT khá hiếm, phát hiện 5 trường hợp mang đột biến NRAS
trong tổng số 225 bệnh nhân. Nhưng nghiên cứu này phát hiện được nhiều
dạng đột biến gen NRAS hơn, bao gồm Gly12Asp, Gly12Ser, Gly12Val trên
codon 12; Glu61Lys (Q61K) trên codon 61, không phát hiện được đột biến
nào trên codon 13 [63]. Sự khác biệt này có thể do cỡ mẫu, chủng tộc và lối
sống.................................................................................................................63

KẾT LUẬN....................................................................................................64


DANH MỤC CÁC BẢNG
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................5
MỤC LỤC........................................................................................................6
Bảng 1.1. Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010........................................11
Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết..........................35

Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................36
Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................36
khuếch đại exon 2 gen KRAS.......................................................................36
Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................37
khuếch đại exon 15 gen BRAF.....................................................................37
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................38
khuếch đại exon 2 gen NRAS.......................................................................38

Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................39
khuếch đại exon 3 gen NRAS.......................................................................39
Thành phần....................................................................................................40
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA được tách chiết từ
mẫu mô ung thư.............................................................................................46
Bảng 3.2. Tỷ lệ các dạng đột biến gen KRAS (n=15).................................55
Bảng 3.3. Kết quả giải trình tự 3 gen KRAS, BRAF và NRAS.................55
Bảng 4.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen KRAS theo một số nghiên cứu......62


DANH MỤC HÌNH
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................5
MỤC LỤC........................................................................................................6
Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do UTĐTT trên thế giới...........................3
Hình 1.2. Đột biến gen hoạt hóa và áp chế các con đường tin hiệu trong
sự phát sinh và phát triển ung thư đại trực tràng .......................................6
Hình 1.3. Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR. 16
Hình 1.4. Vị trí gen KRAS trên NST số 12..................................................17
Hình 1.5. Vị trí gen BRAF trên NST số 7....................................................17
Hình 1.6. Vị trí gen NRAS trên NST số 1....................................................18
Hình 1.7. Tỷ lệ các dạng đột biến KRAS, NRAS, BRAF...........................19
trong UTĐTT theo nghiên cứu của Douliard và cs (năm 2013) [50]........19
Hình 1.8. Vai trò của đột biến gen RAS trong việc hoạt hóa gây ung thư
các con đường truyền tín hiệu nội bào .......................................................22
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP.............................................24
Hình 1.10. Minh họa phương pháp giải trình tự gen.................................24
Hình 1.11. Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP..................26
Hình 1.12. Giải trình tự bằng máy tự động.................................................27
Hình 1.13. Các bước tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP [43].........................28

Phương pháp quang phổ: kiểm tra độ tinh khiết của DNA tách chiết..........................35

Thành phần....................................................................................................40
Hình 3.1. Minh họa đo OD của mẫu DNA tách chiết.................................45
bằng máy Nanodrop 1000 của bệnh nhân mã số C12................................45
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi GAPDH..............47
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 2 gen KRAS (A),
exon 15 gen BRAF (B), exon 2 gen NRAS (C) và exon 3 gen NRAS (D)


trên gel agarose 1,5%. MK: thang chuẩn 100bp; (-): chứng âm; (+):
chứng dương Giếng 1 -7: sản phẩm khuyếch đại gen từ mẫu DNA bệnh
nhân................................................................................................................48
Hình 3.4. Hình ảnh đột biến G12A exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải
trình tự gen (bệnh nhân mã số C27)............................................................49
Hình 3.5. Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12C exon 2 gen KRAS
bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C11)............................50
Hình 3.6. Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12D exon 2 gen KRAS
bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C41)............................50
Hình 3.7. Hình ảnh đột biến G12S exon 2 gen KRAS bằng kỹ thuật giải
trình tự gen (bệnh nhân mã số C39)............................................................51
Hình 3.8. Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G12V exon 2 gen KRAS
bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C33)............................51
Hình 3.9. Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến G13D exon 2 gen KRAS
bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C16)............................52
Hình 3.10. Hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến V600E exon 15 gen
BRAF bằng kỹ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số C01)................52
Hình 3.11. Kết quả xác định đột biến G12V exon 2 gen NRAS bằng kỹ
thuật giải trình tự gen (bệnh nhân mã số mã số C17)................................53

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là ung thư hay gặp ở các nước phát
triển, tỷ lệ mắc đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi. Ở khu vực Đông Nam Á,
hàng năm có hơn 300.000 bệnh nhân UTĐTT mới mắc với gần 200.000 trường
hợp tử vong . Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy UTĐTT đứng hàng thứ năm
sau ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư vú ở nữ giới và ung thư vòm, với tỷ lệ
mắc khoảng 7,5/100.000 dân/năm, tỷ lệ nam/nữ là 1,4/1 .
Hiện nay, sự phát triển của ngành nội soi kết hợp sinh thiết để xét
nghiệm mô bệnh học đã giúp cho bệnh UTĐTT được phát hiện sớm hơn, từ
đó giúp bệnh có tiên lượng tốt hơn .
Ở Việt Nam, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu UTĐTT, về tỷ lệ
mắc bệnh, nguyên nhân, một số phương pháp chẩn đoán và điều trị mà chưa
đi sâu nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư hay sự tương tác điều hòa gen và
protein trong khối u [1],. Các nước có nền y học hiện đại đã áp dụng các kỹ
thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân ung thư và
đem lại những kết quả nổi bật. Khoa học đã xác định được sự ảnh hưởng của
các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào cũng như sự tương tác gen đối với
quá trình sinh trưởng, biệt hóa và chết theo chương trình của tế bào. Mỗi một
biến đổi gen có thể làm thay đổi hoạt động sống của tế bào, biến một tế bào
lành thành một tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào . Bên cạnh đó, các biến đổi
gen cũng làm các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc kháng lại các tác nhân ngoại
bào như các thuốc điều trị ung thư. Đây là cơ sở để các nhà khoa học nghiên
cứu và ứng dụng các loại thuốc mới, tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào
nhằm ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư, gọi là liệu pháp điều trị
trúng đích . Phương pháp này có rất nhiều ưu điểm như liều điều trị thấp, ít
độc hại, hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng bệnh nhân và thời
gian sống của bệnh nhân tốt hơn so với các phương pháp truyền thống như

hóa trị, xạ trị.


2

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy mức độ đáp ứng với thuốc điều
trị trúng đích ở bệnh nhân UTĐTT phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số
gen như KRAS, BRAF, NRAS ,. Trong bệnh UTĐTT, đột biến gen KRAS
chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 35% - 45%, đột biến BRAF chiếm khoảng 10% 15% còn đột biến NRAS chiếm khoảng 3% - 6% ,. Tại Việt Nam, đã có một
số nghiên cứu tiến hành xác định đột biến gen KRAS, BRAF tuy nhiên chưa
có nghiên cứu nào tiến hành xác định đột biến cả 3 gen KRAS, BRAF và
NRAS trên bệnh nhân UTĐTT. Hiện nay, số lượng bệnh nhân mắc UTĐTT
ngày càng tăng, trên thị trường đã có một số dược phẩm điều trị đích được lưu
hành, việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cũng như theo dõi hiệu quả của
liệu pháp điều trị đích phải dựa trên việc xác định tình trạng các gen KRAS,
BRAF và NRAS.
Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu ‘‘Xác định đột biến gen
KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng’’ được thực hiện với
hai mục tiêu sau:
1.

Áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen xác định những đột biến gen KRAS,
BRAF, NRAS có ý nghĩa quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị
đích ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

2.

Xác định tỉ lệ các dạng đột biến trên của các gen KRAS, BRAF, NRAS ở
nhóm nghiên cứu.

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ung thư đại trực tràng
1.1.1. Dịch tễ
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những ung thư phổ biến
nhất, mỗi năm trên toàn thế giới có gần một triệu ca mới mắc bệnh, chiếm từ
9-10% các loại ung thư. Tại Mỹ, UTĐTT là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng thứ
hai (sau ung thư phổi) trong các loại ung thư và đứng thứ ba về mặt tần suất
xuất hiện ở cả hai giới nam và nữ ,[19]. Tỷ lệ mắc bệnh này cao nhất tại châu
Âu, Mỹ, Úc và New Zealand, thấp nhất được ghi nhận tại Ấn Độ, Nam Mỹ và
các tiểu vương quốc Ả Rập. Ở các nước Đông Nam Á, tỷ lệ mắc UTĐTT
ngày càng tăng cao. Tại Singapore, tỷ lệ mắc bệnh hiện nay đã tăng gấp đôi so
với những năm 1980 . Tại Việt Nam, theo Nguyễn Văn Hiếu (2007), tỷ lệ mắc
UTĐTT là 7,5/100.000 dân, đứng thứ năm sau ung thư phế quản, ung thư dạ
dày, ung thư gan và ung thư vú ở nữ giới .

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do UTĐTT trên thế giới


4

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh
1.1.2.1. Yếu tố nguy cơ
Nguyên nhân chính xác của bệnh hiện nay vẫn chưa rõ, nhưng một số
yếu tố làm tăng nguy cơ của bệnh đã được xác định gồm:
- Tuổi tác: bệnh thường gặp ở những người trên 50 tuổi. Một số trường
hợp có thể gặp ở những người trẻ hơn, thậm chí là thanh niên.

- Lối sống: hút thuốc lá, có chế độ ăn nhiều thịt đỏ, nhiều mỡ, ít chất xơ
sẽ có nguy cơ cao bị UTĐTT.
- Polyp đại trực tràng : Các polyp mọc trên thành bên trong của đại
tràng hoặc trực tràng và thường gặp ở người trên 50 tuổi. Hầu hết các polyp là
lành tính nhưng một số có thể trở thành ung thư.
- Tiền sử cá nhân và gia đình: theo một số nghiên cứu, phụ nữ có tiền
sử ung thư buồng trứng, tử cung hay ung thư vú sẽ có tỷ lệ phát triển UTĐTT
cao hơn. Khoảng 20% những người UTĐTT có ít nhất một người thân trong
gia đình cũng bị UTĐTT.
1.1.2.2. Tính nhạy cảm di truyền
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng xấp xỉ 20% - 25% các trường
hợp UTĐTT có liên quan đến di truyền . Nhiều biến đổi cấu trúc và chức năng
gen gây rối loạn một số con đường tín hiệu tế bào đã được chứng minh một cách
rõ ràng và có liên quan trực tiếp đến sự phát sinh, phát triển UTĐTT (hình 1.2).
Trong giai đoạn sớm, sự gia tăng hoạt động của prostaglandin đóng vai trò rất
quan trọng trong sự hình thành khối u . Tác động này có thể được tăng cường
bởi tình trạng viêm mạn tính tại chỗ hoặc sự biểu hiện quá mức của COX2. Đây
là enzym xúc tác sự tổng hợp prostaglandin E2, một chất có liên quan chặt chẽ
tới UTĐTT. Hoạt động của prostaglandin E2 có thể gia tăng tương ứng với sự


5

giảm sút của 15-PGDH (15-prostaglandindehydrogenase) . Khoảng 2/3 trường
hợp UTĐTT có sự gia tăng của COX2 đồng thời khoảng 80% trường hợp có sự
giảm sút hàm lượng 15-PGDH tại các tế bào ung thư .
Nhiều nghiên cứu cho thấy sự rối loạn con đường tín hiệu Wnt được coi
là yếu tố bắt nguồn cho việc phát sinh ung thư. Đột biến thường gặp nhất
trong UTĐTT là bất hoạt gen mã hóa protein APC . Khi đó, thông tin qua con
đường tín hiệu Wnt được tăng cường, dẫn đến sự gia tăng hoạt động quá mức

của các tế bào ung thư. Các tín hiệu được khởi đầu khi oncoprotein β-catenin
bám vào phối tử của nó trong nhân, hoạt hóa các yếu tố điều hòa gen làm gia
tăng hoạt động phân bào. Lượng β- catenin trong tế bào được kiểm soát bởi
phức hợp chứa protein APC thông qua phản ứng ly giải protein, hơn nữa,
phức hợp này còn ức chế sự tồn tại của β-catenin trong nhân tế bào.
Sự bất hoạt của con đường tín hiệu p53 do đột biến trên gen kháng ung
thư TP53 được coi là yếu tố quan trọng thứ hai trong sự phát triển UTĐTT.
Đột biến này xảy ra với tần suất khoảng 35-55% trong tổng số người bệnh
ung thư. Sự bất hoạt p53 là yếu tố quan trọng thúc đẩy khối u từ chuyển từ
giai đoạn khởi đầu sang giai đoạn tiến triển ung thư .
Ngoài ra đột biến làm bất hoạt con đường tín hiệu TGF-β cũng đóng
vai trò quan trọng trong sự phát triển ung thư. Khoảng 1/3 trường hợp
UTĐTT chứa đột biến gây bất hoạt thụ thể TGF-β2. Thông thường, các đột
biến làm mất hoạt tính kinase của TGF-β2 hoặc làm bất hoạt các phân tử tiếp
theo trong con đường tín hiệu TGF-β như SMAD4 hay SMAD2/3 và thúc đẩy
khối u từ dạng biệt hóa cao thành ung thư .
Một con đường tín hiệu liên quan đến bệnh sinh UTĐTT đang được
quan tâm trong thời gian gần đây là con đường tín hiệu tyrosine kinase khởi
nguồn từ phân tử thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR. Nếu các gen trong


6

con đường tín hiệu RAS/RAF xuôi dòng EGFR bao gồm KRAS, BRAF,
NRAS bị đột biến sẽ dẫn đến sự rối loạn chức năng của các protein liên quan,
thông qua đó khởi động quá trình hình thành ung thư. Ngoài ra, đột biến gen
mã hóa các protein trong trục PI3K/AKT xuôi dòng EGFR xảy ra ở khoảng
1/3 trường hợp UTĐTT. Trục tín hiệu này được kiểm soát bởi PTEN. Mặc dù
ít gặp nhưng đột biến PTEN cũng được tìm thấy trên những người bệnh
UTĐTT ,.

Hình 1.2. Đột biến gen hoạt hóa và áp chế các con đường tin hiệu trong sự
phát sinh và phát triển ung thư đại trực tràng .
1.1.3. Chẩn đoán


7

1.1.3.1. Lâm sàng
Ung thư đại tràng: Giai đoạn sớm có triệu chứng thường nghèo nàn,
thông thường được phát hiện được khi soi kiểm tra đại tràng. Ở giai đoạn tiếp
theo, các triệu chứng thường gặp là : đau bụng, táo bón, thay đổi thói quen đi
ngoài, đi ngoài ra máu, khối u ổ bụng; kèm theo những biểu hiện toàn thân
như thiếu máu, sụt cân .
Ung thư trực tràng: Triệu chứng hay gặp nhất là đi ngoài ra máu (60%)
và rối loạn đi ngoài (43%). Thăm trực tràng có thể sờ thấy khối u, mức độ
xâm lấn và tình trạng của cơ thắt bị ảnh hưởng [1].
1.1.3.2. Cận lâm sàng
* Nội soi đại trực tràng kèm sinh thiết:
Là phương pháp cận lâm sàng chẩn đoán chính xác nhất và có thể tiến
hành ở nhiều cơ sở y tế chuyên khoa để xác định UTĐTT. Nội soi đại trực
tràng có thể xác định chính xác vị trí khối u, tiến hành sinh thiết để xét
nghiệm tế bào và thực hiện các thủ thuật can thiệp như cắt bỏ polyp. Những
tiến bộ trong kỹ thuật nội soi hiện nay cho phép khám, phát hiện sớm những
trường hợp UTĐTT dù khối u còn rất nhỏ .
* Giải phẫu bệnh:
Hình ảnh đại thể là một trong 4 dạng:
- Ung thư thể sùi hay dạng polyp: Tổn thương có thể rộng, lồi ra ngoài
và thường có hình nhú nhiều nhung mao.
- Ung thư thể loét sùi: có hình ảnh loét trên khối sùi.

- Ung thư thể thâm nhiễm: Nhiễm cứng và dày vách đại tràng mà
không có loét trên niêm mạc.
- Ung thư thể hỗn hợp.


8

Mô bệnh học UTĐTT gồm 5 loại: ung thư biểu mô tuyến, u thần kinh nội tiết, u hắc tố đại, sarcoma (cơ trơn, mạch máu, mỡ, sợi) và lymphoma.
Trong đó, thể ung thư biểu mô tuyến chiếm hơn 95% ung thư đại trực tràng.
Thể ung thư biểu mô tuyến của ống hậu môn chiếm 1-2%, còn lại là sarcom
cơ trơn, u hắc tố hoặc u lympho ác tính .
* Chụp X quang đại tràng có thụt Barium:
Hình ảnh khối u là khối nhô vào lòng đại tràng với đường bờ không
đều, lòng đại tràng bị hẹp. Phương pháp này thường chỉ phát hiện thấy những
khối u đã có kích thước lớn. Kỹ thuật chụp đối quang kép có thể phát hiện
khối u ở giai đoạn sớm .
* Chụp cắt lớp vi tính hóa (CT) hoặc chụp cộng hưởng từ (MRI):
Hai kỹ thuật này giúp đánh giá mức độ xâm lấn và tình trạng di căn của
khối ung thư. Với những người bệnh không chấp nhận soi đại trực tràng hoặc
những người bệnh có khối u trực tràng lấp kín đường vào thì CT và MRI rất
hữu ích cho chẩn đoán và tiên lượng phẫu thuật .
* Siêu âm nội soi:
Siêu âm kết hợp nội soi giúp đánh giá mức độ xâm lấn của ung thư qua
thành đại trực tràng và đánh giá di căn hạch vùng .
* Siêu âm bụng:
Siêu âm bụng có thể phát hiện được khối u một cách gián tiếp qua hình
ảnh thành đại tràng dầy lên. Kỹ thuật này còn được chỉ định để phát hiện di
căn của ung thư đến các tạng khác như gan, tuỵ....
* Chụp cắt lớp bức xạ positron (PET): Năm 1961, James Robertson
và cộng sự lần đầu tiên sử dụng kỹ thuật PET tại phòng thí nhiệm

Brookhaven. Hiện nay, PET sử dụng 18F-FDG (2-fluoro-2-deoxy-D-glucose)


9

được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng để chẩn đoán, xác định giai đoạn bệnh,
phát hiện di căn, chẩn đoán tái phát, theo dõi đáp ứng điều trị và lập kế hoạch
xạ trị .
* Xét nghiệm các dấu ấn ung thư
- CEA (Carcinoembryonic antigen): kháng nguyên ung thư phôi
CEA là một glycoprotein có liên quan đến sự kết dính tế bào. Việc sản
xuất CEA hình thành trong quá trình phát triển của thai nhi, và dừng lại trước
khi trẻ chào đời. Xét nghiệm định lượng CEA không được sử dụng độc lập để
chẩn đoán xác định UTĐTT vì nó còn tăng cao trong nhiều bệnh khác mà chỉ
được dùng để theo dõi ung thư tái phát hoặc di căn sau khi phẫu thuật loại bỏ
khối u.
- CA 19-9 (Carbohydrate antigen 19-9)
CA 19-9 là một kháng nguyên ung thư được phát hiện ở người bệnh
UTĐTT vào năm 1981 [50]. Theo Takada và cộng sự (1993), CA19-9 còn
được tìm thấy trong ung thư tụy, ung thư dạ dày, ung thư bàng quang .
* Xét nghiệm tìm máu trong phân (FOBT- Fecal Occult Blood Tests):
Xét nghiệm này nhằm phát hiện hồng cầu trong phân và được sử dụng
để khám sàng lọc UTĐTT. Tuy nhiên, xét nghiệm này cũng được sử dụng để
chẩn đoán một số bệnh lý khác của đường tiêu hóa có gây chảy máu.
1.1.3.3. Chẩn đoán giai đoạn
Phân độ TNM theo AJCC (2010) :
- T (Tumor): u nguyên phát
Tis: ung thư biểu mô tại chỗ, chưa phá vỡ màng đáy, khu trú ở niêm mạc.
T1: khối u xâm lấn tới lớp dưới niêm mạc.
T2: khối u xâm lấn tới lớp cơ.

10

T3: khối u xâm lấn qua lớp cơ nhưng chưa qua lớp thanh mạc.
T4a: khối u xâm lấn vào các phúc mac tạng.
T4b: Khối u xâm lấn hay di căn đến các cơ quan, cấu trúc khác.
- Hạch N (Node):
No: không có di căn hạch khu vực.
N1: di căn 1-3 hạch khu vực.
N1a: di căn một hạch khu vực.
N1b: di căn 2-3 hạch bạch huyết khu vực.
N1c: Khối u mới xâm lấn lớp dưới thanh mạc, mạc treo, hoặc các mô
quanh đại trực tràng nhưng chưa có di căn hạch khu vực.
N2: di căn 4 hạch khu vực trở lên.
N2a: di căn 4 – 6 hạch khu vực.
N2b: di căn từ 7 hạch khu vực trở lên.
- Di căn M (Metastasis):
Mo: chưa di căn.
M1: di căn xa.
M1a: di căn chỉ giới hạn ở một cơ quan khác.
M1b: di căn nhiều hơn một cơ quan, phúc mạc.


11

Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010 :
Bảng 1.1. Phân giai đoạn bệnh theo AJCC 2010
Astler

Giai đoạn

T

N

M

Duke

0

Tis

N0

M0

A

A

T1

N0

M0

A

B1

T2

N0

M0

A

B1

IIA

T3

N0

M0

B

B2

IIB

T4a

N0

M0

B

B2

IIC

T4b

N0

M0

B

B3

IIIA

T1-T2

N1

M0

C

C1

IIIB

T3-T4

N1

M0

C

C2

IIIC

Any T

N2

M0

C

C2

IV

Any T

Any N

M1

I

Coller

D

* Phân giai đoạn bệnh theo Dukes
Dukes A: khối u còn giới hạn ở lớp niêm mạc hoặc chạm tới lớp cơ
thành đại tràng.
Dukes B: khối u vượt qua lớp niêm mạc vào tới lớp cơ nhưng chưa di
căn hạch.
Dukes C: ung thư đã lan đến ít nhất một hạch bạch huyết khu vực.
Dukes D:ung thư đã lan đến một cơ quan khác trong cơ thể.

1.1.4. Điều trị UTĐTT
1.1.4.1. Lựa chọn biện pháp điều trị UTĐTT
* Giai đoạn 0:


12

Cắt bỏ polyp ung thư qua nội soi đại trực tràng hoặc phẫu thuật cắt bỏ
khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư.
* Giai đoạn I:
Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư.
* Giai đoạn II:
Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư, loại bỏ
hạch khu vực có thể kèm theo hóa trị liệu hoặc điều trị ức chế EGFR.

* Giai đoạn III:
Phẫu thuật cắt bỏ khu vực đại trực tràng có tổn thương ung thư, loại bỏ
hạch kèm theo hóa trị liệu, xạ trị hoặc điều trị ức chế EGFR.
* Giai đoạn IV và ung thư tái phát:
Phẫu thuật cắt đại trực tràng, các cơ quan khác có di căn ung thư kèm
theo hóa trị, xạ trị hoặc thuốc ức chế EGFR.
1.1.4.2. Các phương pháp điều trị UTĐTT
* Cắt polyp qua nội soi:
Phương pháp này sử dụng những dụng cụ cắt polyp thông qua máy nội
soi đại trực tràng, nhằm loại bỏ những polyp ung thư hóa được phát hiện sớm,
chưa phát triển xâm lấn và không có di căn.
* Phẫu thuật:
Phẫu thuật cắt bỏ khối u là phương pháp điều trị triệt căn, rất có hiệu
quả với những người bệnh UTĐTT phát hiện sớm. Phẫu thuật cắt đại tràng
cùng với các mạch máu nuôi dưỡng tương ứng, có thể nạo vét hạch kèm theo.
Có thể nối hai đầu đại trực tràng ngay hoặc làm hậu môn nhân tạo đại tràng .
* Hóa trị:
Là phương pháp sử dụng hóa chất để tiêu diệt các tế bào ung thư. Hóa
chất trị UTĐTT thường được đặt ra sau khi phẫu thuật nếu ung thư đã lan đến
các hạch bạch huyết nhằm mục đích ngăn ngừa tái phát ung thư. Tuy nhiên,


13

hóa chất cũng làm các tế bào lành bị tổn thương nên phương pháp này luôn có
những tác dụng không mong muốn như giảm miễn dịch, viêm niêm mạc, rụng
tóc, suy tủy… Mỗi truyền hóa chất thường chỉ có một lượng nhỏ tế bào ung
thư bị tiêu diệt nên điều trị phải lặp lại các liều hóa chất theo chu kỳ để làm
nhỏ dần khối u. Người bệnh phải điều trị kéo dài, chịu ảnh hưởng rất lớn về
sức khỏe do độc tính của thuốc. Các hóa chất thường được sử dụng trong

UTĐTT như Fluororyrimydines và Leucovorin, Oxaliplatin .
* Xạ trị:
Xạ trị là phương pháp sử dụng năng lượng phóng xạ ion hoá để diệt tế
bào ung thư và làm teo nhỏ khối u. Tia xạ làm tổn thương và hủy hoại các tế
bào ung thư bằng cách làm tổn thương vật chất di truyền của chúng, khiến
chúng không thể phát triển và phân chia. Mặc dù xạ trị làm tổn thương cả tế
bào ung thư và tế bào lành, hầu hết các tế bào lành có thể hồi phục và hoạt
động bình thường. Vai trò của xạ trị trong điều trị UTTT rất quan trọng vì nó
giúp giảm tỷ lệ tái phát và tăng tỷ lệ sống còn. Xạ trị giúp kiểm soát khối u
đối với những người bệnh không thể thực hiện phẫu thuật hoặc khối ung thư
tiến triển gây ra các biến chứng. Xạ trị có thể tiến hành từ bên ngoài hay bên
trong cơ thể .
* Liệu pháp ức chế EGFR:
Trong những năm gần đây, thành công của chuyên ngành sinh học phân
tử đối với bệnh ung thư đã mở ra những phương pháp điều trị mang lại nhiều
hy vọng cho người bệnh ung thư nói chung và UTĐTT nói riêng.
Sự phát hiện ra thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR và các con
đường tín hiệu tế bào liên quan với EGFR đã giúp cho các nhà khoa học làm
sáng tỏ các cơ chế phát sinh và phát triển của một số loại tế bào ung thư, từ đó
thúc đẩy quá trình tìm ra các loại thuốc chống ung thư mới. Cetuximab
(Erbitux) và Panitumumab (Vectibix) đã được Cơ quan quản lý dược phẩm và


14

thực phẩm Mỹ (FDA) chấp nhận để điều trị cho người bệnh UTĐTT vào năm
2009 [51].
1.1.5. Tiên lượng bệnh [49]
Tại châu Âu tỷ lệ sống sót sau năm năm đối với UTĐTT là ít hơn 60%.
Ở các nước phát triển, khoảng 1/3 số người mắc UTĐTT tử vong vì bệnh.Tỷ

lệ sống sót đối với UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn sớm cao gấp năm lần
so với UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn muộn. Theo thống kê của Hiệp hội
Ung thư Mỹ năm 2006, hơn 20% số người mắc UTĐTT đến can thiệp y tế khi
bệnh đã ở giai đoạn IV, và hơn khoảng 25% trong nhóm này đã có di căn gan.
Tỷ lệ sống từ 1 năm cho đến 5 năm tùy thuộc vào giai đoạn phát hiện
bệnh. Những người có khối u ở giai đoạn Tis, N0 , M0 có tỷ lệ sống sót sau
năm năm là 100%, trong khi những người có ung thư xâm lấn giai đoạn T1
(bên trong lớp dưới niêm mạc) và T2 ( trong lớp cơ) có tỷ lệ sống sót sau năm
năm trung bình là 90%. Những người có ung thư xâm lấn hơn nhưng chưa có
hạch T3-4, N0, M0 thì tỷ lệ sống sót trung bình sau 5 năm là xấp xỉ 70%.
Những bệnh nhân đã có hạch, N1-3, M0 tỷ lệ sống sau 5 năm trung bình là
40%, trong khi những người đã có di căn xa M1 thì tỷ lệ này chỉ khoảng 5%.
1.2. Vai trò của gen KRAS, BRAF, NRAS trong bệnh ung thư đại trực tràng
1.2.1. Con đường tín hiệu nội bào liên quan đến protein RAS/RAF
Ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô, trong đó có tế bào biểu mô đại trực
tràng, quá trình tăng sinh, tăng trưởng bình thường của tế bào được kiểm soát
chặt chẽ bởi con đường tín hiệu tysokine kinase nội bào mà khởi nguồn từ
phân tử EGFR trên màng tế bào. Yếu tố phát triển biểu mô EGF (epidermal
growth factor) có ái lực cao với thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) trên
bề mặt tế bào. Yếu tố này có khả năng kích hoạt hoạt tính tyrosine kinase nội
bào của thụ thể. Tiếp theo các tyrosine kinase sẽ khởi động dòng thác tín hiệu
để tác động lên nhiều quá trình hóa sinh trong tế bào như: tăng nồng độ Ca +