KỸ THUẬT PHÂN TỬ LPA (LINEPROBE ASSAY) TRONG CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HUẾ
BỘ MÔN LAO
---o0o---

KỸ THUẬT PHÂN TỬ LPA
(LINE-PROBE ASSAY)
TRONG CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG
RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
TRƯƠNG MINH TUẤN- Y5N

HUẾ, 04/2018

1|Page


2|Page


LỜI CẢM ƠN

3|Page


Qua hai tuần học tập và rèn luyện lâm sàng tại khoa bênh phổi, Bệnh viện
Trung Ương Huế, dưới sự chỉ bảo và giảng dạy tận tình của quý thầy cô đã đem
lại cho em nhiều kiến thức về lý thuyết cả thực hành trong suốt thời gian học tập ở
đây. Hai tuần là là một khoảng thời gian quá ngắn, quá ít để có thể thu nhận được
những kiến thức quý báu từ thầy cô và các bác sĩ ở đây. Tuy nhiên khoảng thời
gian đó cũng đã cho em biết bao kỷ niệm: những lần phát biểu để kiếm từng 0.1

0.2, những tiếng cười trong từng bài giảng, những lần cùng làm việc nhóm với
nhau, cùng trải qua những giờ lâm sàng với nhau, và cùng lo sợ làm sao để vượt
qua kì thi “dễ rớt mà khó đậu” của bộ môn ... nhưng chính điều đó đã làm cho
chúng em quý trọng những giờ lâm sàng này, nó giúp em biết mình còn thiếu sót
rất nhiều, tạo động lực để trau dồi thêm trong tương lai.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Hùng, cô Nguyễn Thị Bình Nguyên Bộ môn Lao trường Đại Học Y Dược Huế, cùng toàn thể các bác sĩ, cán bộ, nhân
viên đang làm việc tại khoa lao, bệnh viện Trung Ương Huế đã rất nhiệt tình chỉ
bảo, giảng dạy, truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm rất bổ ích cũng như tạo
điều kiện tốt nhất cho chúng em học tập, để chúng em trau dồi thêm kiến thức và
trang bị thêm nhiều kỹ năng lâm sàng thiết yếu. Hình ảnh của thầy Hùng – người
thầy luôn tận tụy hết mình vì sự nghiệp giảng dạy, những bài giảng thú vị, những
câu nói thân quen, những bài học quý giá của thầy; và hình ảnh cô Nguyên với nụ
cười tỏa nắng, luôn thân thiện, nhiệt tình giúp đỡ chúng em. Đó sẽ là những kỷ
niệm mà em có lẽ sẽ không bao giờ quên và là hành trang theo em trong suốt cuộc
đời này.
Cuối cùng, chúng em xin chúc quý thầy cô và các bác sĩ, cán bộ, nhân viên
sức khỏe, để tiếp bước cho sự nghiệp truyền đạt những kiến thức cho các thế hệ
học sinh tiếp theo và vững bước trên con đường cứu người. Chúc thầy luôn khỏe,
chúc cô luôn trẻ và chúc bộ môn sớm tìm được người kế tục, một người đủ tài và
tâm như thầy cô để có thể tiếp tục sự nghiệp trồng người này.

Em xin chân thành cảm ơn!

4|Page


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lao là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, hiện nay tỉ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong
của lao còn khá cao và hơn nữa vấn đề lao kháng thuốc đang trong tình trạng báo
động gây nhiều khó khăn trong việc điều trị và các chương trình chống lao ở các

nước đang phát triển. Theo báo cáo toàn cầu về bệnh lao và kiểm soát bệnh lao
năm 2014 của Tổ chức Y tế thế giới, hiện có 1/3 dân số thế giới đã nhiễm lao. Bệnh
lao là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 trong các bệnh nhiễm trùng. Tình
hình dịch tễ lao kháng thuốc đang có diễn biến phức tạp và xảy ra ở hầu hết các
quốc gia.
Ước tính năm 2013, trên toàn thế giới có 12 triệu người hiện mắc lao, 9 triệu
người mới mắc lao, 13% dân số mắc lao có đồng nhiễm HIV, 1 triệu rưỡi người tử
vong do lao, trong đó 0,36 triệu người tử vong có đồng nhiễm HIV, 65.000 người
mắc lao đa kháng thuốc.
Tỷ lệ lao đa kháng thuốc: 3,5% trong số bệnh nhân mới và 29,5% trong số
bệnh nhân đã từng điều trị lao. Ước tính có 480.000 người mắc lao đa kháng thuốc
(MDR-TB), trong đó có khoảng 9% là lao siêu kháng (XDR-TB). Tỷ lệ điều trị
thành công đa kháng trên toàn cầu mới đạt 48%. Chính vì thế việc phát hiện những
trường hợp lao đa kháng, siêu kháng thuốc là cực kỳ quan trọng để có thể lựa chọn
phác đồ điều trị thích hợp, qua đó có thể giảm sự tiến triển bệnh, tỷ lệ tử vong cũng
như lan tràn của chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.

5|Page


Lao đa kháng thuốc là chủng vi khuẩn lao kháng với ít nhật 2 thuốc chống
lao hạng 1 là rifampicin (RIF) and isoniazid (INH), điều này làm cho việc điều trị
kém hiệu quả, tốn kém, và có thể dẫn đến thất bại điều trị hoặc tái phát. Để có thể
kiểm soát hiệu quả MDR-TB, thì pahcs đồ điều trị cần phải tùy theo sự nhạy cảm
của chủng vi khuẩn lao với thuốc ở từng bệnh nhân riêng biệt. WHO khuyến cáo
tiêu chuẩn vàng của điều trị lao kháng thuốc là cần làm kháng sinh đồ đánh giá sự
nhạy cảm vi khuẩn lao với thuốc thường quy, tuy nhiên thời gian để có kết quả khá
chậm (từ 25 ngày cho đến hơn 2 tháng). Nếu như vậy thì quá trình điều trị cho
bệnh nhân sẽ bị trì hoãn từ đó làm tăng nguy cơ thất bại điều trị và kiểm soát sự lây
lan chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.

6|Page


Chính vì thế cần có một xét nghiệm đơn giản, cho kết quả nhanh chóng, hiệu
quả để có thể giúp khắc phục nhưng điều này. Dựa trên những bằng chứng và
khuyến cáo của các chuyên gia năm 2008, WHO đã chấp thuận việc sử dụng kỹ
thuật phân tử LPA (line-probe assays) trong việc chẩn đoán nhanh chủng MDR-TB
ở những bệnh nhân có nguy cơ. Đây là những xét nghiệm có thể cho kết quả nhanh
chóng sau 8 giờ với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Điều này sẽ giúp các bác sĩ lâm
sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, cũng như hữu ích trong việc kiểm soát tình
trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng.

7|Page


2. GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT LPA VÀ CÁC BẰNG CHỨNG
Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lao đã được công nhận
rộng rãi giúp chẩn đoán nhanh chóng với độ nhạy độ đặc hiệu cao, đặc biệt có thể
thực hiện trực tiếp trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng như đàm. Trong sự tiến bộ
không ngừng đó, thì kỹ thuật LPA cho thấy những triển vọng và hiệu quả cũng như
lợi ích to lớn.
Hiện nay, có 2 kỹ thuật LPA đã được thương mại hóa và ứng dụng rộng rãi
là: the INNO-LiPA® Rif. TB kit (Innogenetics NV, Gent, Belgium) (Figure 1) and
the GenoType® MTBDRplus assay (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)
(Figure 2). Sau khi các kỹ thuật này được giới thiệu thì các nghiên cứu đã được thực
hiện để đánh giá mức hiệu quả cũng như độ chính xác trong chẩn đoán của chúng.

8|Page

Kết quả từ các nghiên cứu hệ thống đối với việc sử dụng kỹ thuật LPA trong chẩn đoán lao kháng thuốc
Trọng tâm
nghiên cứu

Phát hiện nhanh
kháng Rifampicin

Phát hiện nhanh
kháng Rifampicin và
Isoniazid

Test
đánh giá

INNO-LiPA®
Rif. TB

GenoType®
MTBDR và
GenoType®
MTBDRplus

Số nghiên
cứu phân
tích-tổng
hợp

Cỡ mẫu

15

3349

14 (Rifampicin)
15 (Isoniazid)

1738

Số nghiên
cứu làm xét
nghiệm trực
tiếp trên
bệnh phẩm
lâm sàng

Kết quả và kết luận

4

12 trên 14 nghiên cứu áp dụng LiPA trên bệnh
phẩm đã cô lập vi khuẩn lao cho kết quả với độ nhạy
của xét nghiệm trên 95%, độ đặc hiệu là 100%.
4 nghiên cứu làm xét nghiệm trực tiếp trên bệnh
phẩm lâm sàng có độ đặc hiệu là 100%, độ nhạy từ 80100%
Nhìn chung kỹ thuật LiPA cho kết quả với độ
chính xác rất cao trên bệnh phẩm đã cô lập VK; đối với
các nghiên cứu xét nghiệm trực tiếp trên bệnh phẩm
lâm sàng cần nhiều bằng chứng hơn

9 (Rifampicin)
10 (Isoniazid)

Ref

Kháng Rifampicin: độ nhạy (98.1%; 95% CI: 95.9–
99.1), độ đặc hiệu (98.7%; 95% CI 97.3–99.4). Tỷ lệ phát
hiện kháng Rifampicin cao và cố định qua tất cả các
nhóm nghiên cứu, các kỹ thuật khác nhau và loại mẫu
bệnh phẩm khác nhau.
Kháng Isoniazid: độ nhạy thấp hơn (84.3%; 95%
CI: 76.6–89.8), độ đặc hiệu (99.5%; 95% CI: 97.5–99.9)
vẫn ở mức cao
Nhìn chung, kỹ thuật GenoType MDTBR có độ
chính xác tuyệt vời trong chẩn đoán kháng Rifampicin,
ngay cả khi dùng trên bệnh phẩm lâm sàng; trong khi
đối với Isoniazid thì độ nhạy thấp hơn và thay đổi, còn
độ đặc hiệu vẫn rất cao

9|Page

[8]

[7]


10 | P a g e


3. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật Genotype MTBDRplus dựa trên công nghệ LPA (Line Probe
Assay) bao gồm kỹ thuật PCR và gắn kết các đoạn gene sau khi được nhân lên vào
màng lai (STRIP) đã gắn sẵn các mẫu dò chuyên biệt (oligonucleotide probes).
Mẫu dò cho phép xác định vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis complex) có
thể liên kết đặc hiệu với các đoạn gene được nhân lên từ các loài thuộc nhóm này.
Phát hiện các gene rpoB (mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase) đột
biến mã hóa cho khả năng kháng Rifampicin, gene Kat G (gene mã hóa cho
enzyme catalase – peroxidase) đột biến đột biến mã hóa cho khả năng kháng
Isoniazid ở mức độ cao trên và gene inhA (mã hóa cho một NADH enoyl ACP
reductase) đột biến mã hóa cho khả năng kháng Isoniazid ở mức độ thấp của các
chủng M. tuberculosis.

11 | P a g e


12 | P a g e


4. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Kết quả
Không hợp lệ (invalid)

Phân tích kết quả và hướng xử trí tiếp theo
Có thể do thực hiện kỹ thuật không đúng, cần làm lại xét
nghiệm

Không có VK lao. Tuy nhiên, kết quả này không có thể
loại trừ chẩn đoán lao, tuy độ nhạy của MTBDRplus cao
nhưng kết quả có thể âm tính nếu tải lượng vi khuẩn

Không phát hiện VK lao
thấp, nên kết quả này có thể là âm tính giả. Nếu bệnh
(MTB)
cảnh lâm sàng gợi ý cao đến lao, thì cần lặp lại xét
nghiệm. Để chắc chắn chẩn đoán loại trừ cần kết quả
nuôi cấy.
Chẩn đoán lao nhạy cảm thuốc
Phát hiện VK lao + không
Điều trị phác đồ ngắn ngày với 6 tháng, theo khuyến cáo
kháng RIF và INH *
của RNTCP/WHO
Chỉ kháng với RIF/INH kháng đơn thuốc (monoresistant MTB) - không phải là MDR-TB. Tuy nhiên
những bệnh nhân này vẫn có tiên lượng hiệu quả điều trị
Phát hiện VK lao + chỉ
kém hơn và nguy cơ khuếch đại chủng kháng thuốc so
kháng RIF hoặc INH *
với nhóm nhạy cảm. Vì vậy cần nuôi cấy và làm KSĐ để
lựa chọn thuốc phù hợp
Có tính gợi ý cao đến MDR-TB, nhưng cần phân tích
trong bối cảnh các nguy cơ của kháng thuốc.
Nếu bệnh nhân đã có tiền sử điều trị lao hoặc đã thất bại
điều trị với các thuốc kháng lao hạng 1 thì nguy cơ
Phát hiện VK lao + kháng MDR-TB là cao. Ở bệnh nhân như vậy, một kết quả
RIF và INH *
kháng rifampin (RIF) là đủ để bắt đầu phác đồ cho lao đa
kháng thuốc. Đồng thời cần nuôi cấy mẫu trong môi
trường lỏng và làm kháng sinh đồ (KSĐ). Sau khi có kết
quả KSĐ sau 2-3 tuần, dựa trên kết quả thì có thể thay
đổi các thuốc trong phác đồ cho phù hợp.

13 | P a g e


5. MỘT SỐ KHUYẾN CÁO CỦA WHO

- Khuyến cáo áp dụng LPA là phải làm xét nghiệm trên tiêu bản AFB đàm (+)
(trực tiếp) hoặc nuôi cấy phân lập được vi khuẩn lao (gián tiếp) từ bệnh phẩm
cả ở phổi và ngoài phổi.
- LPA không được khuyến cáo cho xét nghiệm trực tiếp trên tiêu bản AFB đàm (-)
- LPA được áp dụng để phát hiện vi khuẩn lao và chẩn đoán lao đa kháng thuốc.
Tuy nhiên do độ nhạy của xét nghiệm này đối với phát hiện kháng với
Rifampicin và Isoniazid là khác nhau (độ nhạy Isoniazid khoảng 85%) cho nên
nhìn chung độ chính xác của nó trong chẩn đoán lao đa kháng thuốc bị giảm
bớt.
- Kháng sinh đồ vẫn cần thiết để chẩn đoán và kiểm soát sự xuất hiện của kháng
thuốc đối với các thuốc kháng lao khác.
- Kháng sinh đồ với Isoniazid vầm được dùng để đánh giá bệnh nhân khi LPA cho
kết quả không kháng với Isoniazid. Điều này đặc biệt quan trọng cho những
cộng đồng có tỷ lệ kháng Isoniazid cao.
- Những khuyến cáo này vẫn được áp dụng cho việc sử dụng LPA ở trẻ em.

14 | P a g e


6. ƯU - NHƯỢC ĐIỂM

LINE PROBE ASSAY (LPA) trong phát hiện lao kháng thuốc hạng 1
Ưu điểm

- Phát hiện lao kháng RIF & INH

cùng lúc, trên cùng 1 mẫu bệnh
phẩm
- Thời gian cho kết quả nhanh chóng
khoảng 8h

Nhược điểm
- Không dùng để theo dõi kết quả
điều trị được
- Không thể dùng để chỉ định thuốc
kháng lao hạng 2 cho bệnh nhân
MDR-TB
- Vẫn cần kết quả nuôi cấy và
kháng sinh đồ

- Có thể xét nghiệm nhiều mẫu cùng
lúc (lên đến 48 mẫu)

- Phụ thuộc kết quả tiêu bản: Chỉ
được làm ở tiêu bản AFB (+) hoặc
tiêu bản AFB (-) có nuôi cấy (+)
- Đặc hiệu cho VK lao, phát hiện phức
hợp DNA vi khuẩn. Giúp chẩn đoán - Cần yêu cầu phòng thí nghiệm kỹ
phân biệt VK lao với các Mycobacteria
thuật cao và trình độ kỹ thuật viên
khác
- Phát hiện kháng INH với độ nhạy
thấp hơn kỹ thuật nuôi cấy
(khoảng 85%)
- Kết quả dương tính giả với kháng
RIF/INH

15 | P a g e


16 | P a g e


Theo một nghiên cứu phân tích tổng hợp năm 2008, thì kỹ thuật Genotype
MTBDRplus có độ nhạy 98.1% với RIF và 84.3% với INH. Điều này cho thấy xét
nghiệm này vẫn có thể cho kết quả âm tính nếu tải lượng vi khuẩn thấp. Nên nếu
bệnh cảnh lâm sàng hướng đến lao nhiều thì cần làm thêm các xét nghiệm khác để
chắc chắn.
Vì vậy, kết quả xét nghiệm luôn cần phân tích kết hợp trong từng bối cảnh
lâm sàng cụ thể. Một kết quả kháng với RIF và INH thì cần đánh giá thêm nguy cơ
kháng thuốc của bệnh nhân, tỷ lệ kháng thuốc trong cộng đồng. Ở 1 bệnh nhân
không có nguy cơ thì đây có thể là dương tính giả và cần phân tích cẩn thận. Cũng
giống như vậy, nếu bệnh nhân thuộc đối tượng nguy cơ cao khang thuốc hay thất
bại điều trị mà kết quả âm tính thì cũng cần đánh giá lại và xác định băng kháng
sinh đồ.

7. KẾT LUẬN
Kỹ thuật Genotype MTBDRplus dựa trên công nghệ LPA là một kỹ
thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao cho kết quả nhanh chóng trong
chẩn đoán lao kháng Rifampicin và Isoniazid. Cũng dựa trên công
nghệ này các kỹ thuật tiên tiến hơn đã được ra đời như SL-LPA
(second-line line probe assays) giúp phát hiện các chủng vi khuẩn
kháng thuốc kháng lao hạng 2. Đó là những thành tựu to lớn đóng
góp có thể lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân, qua đó có thể
giảm sự tiến triển bệnh, tỷ lệ tử vong, cũng như kiểm soát sự lan tràn của chủng vi
khuẩn lao kháng thuốc đang hoành hành trên toàn cầu, và cùng giúp sức để đem lại

một thế giới tốt đẹp hơn không còn bệnh lao.

17 | P a g e


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ausie Nkhi. Tuberculosis diagnosis and management. (2017)
2. Daphne I Ling, Alice A Zwerling and Madhukar Pai. Rapid diagnosis
of drug- resistant TB using line probe assays: from evidence to policy.
(2008)
3. Elina Maharjan, Narayan Dutt Pant, Sanjeev Neupane, Jyoti Amatya
and Bhawana Shrestha Use of Genotype MTBDRplus Assay for
Diagnosis of Multidrug-Resistant Tuberculosis in Nepal. (2017)
4. IPAQT. Technical FAQs on Hain Genotype MTBDRplus Line Probe
Assay
5. Heidi Albert, FIND. The Hain test: new reports from South Africa and
Tanzania
6. Khairunisa Suleiman. An ACTIVIST’S guide to Tuberculosis
Diagnostic Tools. (2017)
7. Ling DI, Zwerling A, Pai M. GenoType MTBDR assays for the
diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysis. (2008)
8. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M. A commercial line probe assay
for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium
tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. (2005)
9. World Health Organization. Global Tuberculosis report. (2014)
10. World Health Organization. Molecular Line probe assay for the
dectection of resistance to Isoniazid and Rifampicin.

18 | P a g e