Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng ( Luận án tiến sĩ)

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - 2014


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
Mã số: 62.42.30.05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc

2. PGS. TS. Cao Đăng Nguyên

HUẾ - 2014


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp
đỡ và hướng dẫn tận tình.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí
nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học,
Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau
đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học
Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất
để chúng tôi hoàn thành luận án.
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi
hoàn thành luận án.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình
đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này.
Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014
Tác giả
Võ Châu Tuấn


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả

trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tác giả
Võ Châu Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ................................................. 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................ 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ................................................................... 5
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ............................................... 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật ..................................................... 6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus .................................................................................. 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào ................................................................ 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ............... 10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................ 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................ 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC
VẬT NUÔI CẤY IN VITRO................................................................................... 19

1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật ......................................... 19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................ 19
1.2.2.1. Nhóm terpene .................................................................................. 20
1.2.2.2. Nhóm phenol ................................................................................... 20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen............................................................ 20


1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật.............................................................................................................................. 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................ 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN .............................................................. 28
1.3.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 28
1.3.3. Công dụng ............................................................................................. 30
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền ....................................................................... 30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học .................................................................... 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen ................ 35
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 37
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 38
2.3.1. Nuôi cấy callus ...................................................................................... 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................... 39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ............................. 39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men .................................. 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng của tế bào ........................................ 40
2.3.4. Định lƣợng tinh dầu ............................................................................. 41
2.3.5. Định lƣợng curcumin ........................................................................... 41
2.3.6. Định lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc ................................ 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 42

2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu .................................. 43
2.3.9. Xử lý thống kê ....................................................................................... 43
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................ 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC .............. 47
3.2.1. Ảnh hƣởng của cỡ mẫu nuôi cấy ......................................................... 47


3.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc .................................................................... 49
3.2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST ................................................................. 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA .......................................................................... 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D ...................................................................... 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ........................................................... 52
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose ................................................................... 54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose ................................................................... 56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN ..................... 59
3.3.1. Khảo sát sinh trƣởng của tế bào ......................................................... 59
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................ 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy ................................................................................... 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí ......................................................... 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ......................................................... 65
3.4.1. Hàm lƣợng tinh dầu ............................................................................. 65
3.4.2. Hàm lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc tổng số ................... 67
3.4.3. Hàm lƣợng curcumin ........................................................................... 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ... 77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 80

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
.................................................................................................................................. 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 83
PHỤ LỤC


BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
BAP

:

6-benzylaminopurine

BA

:

6-benzyladenine

CIB

:

centrifugal impeller bioreator

cs

:

cộng sự

DMSO

:

dimethyl sulfoxide

ĐC

:

đối chứng

ĐHST

:

điều hòa sinh trưởng

HPLC

:

high performance liquid chromatography
(sắc ký hiệu năng cao áp)

IAA

:

indoleacetic acid

IBA

:

indolebutyric acid

Kin

:

kinetin

L

:

lít

L-DOPA

:

L-3,4 -dihydrooxyphenylamine

LPS

:

lipopolysaccharide

MS

:

Murashige và Skoog (1962)

NAA

:

naphthaleneacetic acid

Nxb

:

nhà xuất bản

TNF-α

:

tumor necrosis factor-alpha

2,4-D

:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

TT
1
2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát
sinh hình thái của callus
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L

Trang
44

46

48

50

51

52

53

54

56

57

62

63

64


14

15

16

Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi
cấy trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L

66

67

69

Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene
17

trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự

74

nhiên
18

Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen

78


DANH MỤC CÁC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

1

Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro

37

2

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm

38

3
4
5

Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước
Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy
Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy
trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose

45

47
55

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình
6

tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và

58

1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút
7
8

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml
đặt trên máy lắc
Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L

59
60

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men
9

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu

60

100 g

10

Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào
nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L

61

Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men
11

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu

65

200 g
12

Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml)

71


13

14

Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi
ngoài tự nhiên
Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến

18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít

72

73

Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự
15

nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2

76

đến 18 ngày
16

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen

77


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược
phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc
các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như

là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây
(thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết
đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với
môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177].
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển
từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất
thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23].
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng
thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn
dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính
toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề
đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất
nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi
của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường
canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp
ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc
các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một
con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược
phẩm [106].


2

Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm
1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức
có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất
chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể
cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp
các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các
hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi

các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi
thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất
về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật
ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các
chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương
đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài
tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất
nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn
như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus
roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea
doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi
Panax… [163].
Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn
gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á,
Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa
các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó
còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82].
Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u;
một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và
ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông
máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức


3

chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng
bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có
tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó,
polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt

(sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có
hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là
loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số
nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào
điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt
khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29].
Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng
lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào
chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả
năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để
sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và
hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù
trong hệ lên men 10 L.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có
tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp
chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu


4

ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh
học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy

huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối,
cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị
cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in
vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống
các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn
định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên
men 10 L.
- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu,
curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy.
Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các
hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển
hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào
cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức
chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao
hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.


5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ
quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro

[93]. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người
Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực
vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào
thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi
cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút. Mặc dù không thành công trong nuôi
cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia
tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự
nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu
rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất
ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong
những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã
đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã
được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường
Linsmaier và Skoog [85].
Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong
nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy
lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của
các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy
nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164].
Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược


6

phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164].
Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả
năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177].
Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ
cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như

berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177].
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật
Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền
của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành
lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào
độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12].
1.1.2.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy
các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn
là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính
xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên
khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối
ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng
trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh
trưởng [93].
Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng
soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên
được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại


7

trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque
và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của
chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số
dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây

Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy
chuyển [42].
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các
khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay
hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết
lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền
phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những
nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với nuôi
cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó
các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35].
Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến
callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong quá trình nuôi cấy, các tế
bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi
trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các
tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy
nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ
lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có
thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc
dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi
trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các
tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền
phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá
hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù


Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full