Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GSI (Luận văn thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG
BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG
BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1

Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. BÙI VĂN THẮNG

Hà Nội - 2017


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
- Đây là công trình nghiên cứu của tôi và cùng cộng tác với các cộng sự
khác;
- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả;
- Phần kết quả còn lại của luận văn chưa được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017
Học viên

Nguyễn Thị Huyền


ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng, Viện trưởng
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống
Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển
gen” là người thầy đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí và các điều kiện cần

thiết khác để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ tế bào và toàn thể các cán bộ thuộc Bộ môn đã tạo những điều kiện
thuận lợi để tôi được học tập, thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn.
Trong quá trình làm luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của
toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm
nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận
văn này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017
Học viên

Nguyễn Thị Huyền


iii

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi
DANH MỤC CÁC BÀNG.................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .......... x
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4

1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng ..................... 4
1.2. Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn ............................................... 7
1.3. Gen GS1 và kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây trồng ................ 10
1.4. Vector chuyển gen GS1 vào cây bạch đàn Urô ........................................... 15
1.5. Các phương pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và
đồng ruộng........................................................................................................... 18
1.5.1. Đánh giá chọn lọc cây chuyển gen in vitro và in vivo .............................. 18
1.5.2. Phân tích cây chuyển bằng kỹ thuật sinh học phân tử................................ 19
1.5.3. Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển ........................................... 23
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 25
2.2.1. Phân tích, xác định các dòng cây chuyển gen ........................................... 25
2.2.2. Đánh giá sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen ở giai đoạn nhà lưới 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 25
2.3.1. Phương pháp sàng lọc các thể nhận gen GS1 in vitro .............................. 26


iv

2.3.2. Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin của các dòng cây bạch đàn Urô
chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới ....................................................................... 27
2.3.3. Phương pháp tách DNA tổng số (lượng nhỏ) từ thực vật ......................... 27
2.3.4. Phương pháp tách chiết ADN tổng số (lượng lớn) từ thực vật ................. 28
2.3.5. Phương pháp định tính và định lượng DNA tổng số .................................. 29
2.3.6. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ........................................................ 30
2.3.7. Phương pháp tách chiết mRNA ................................................................. 30
2.3.8. Phương pháp tổng hợp cDNA ................................................................... 31
2.3.9. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen
bằng PCR............................................................................................................. 33

2.3.10. Phương pháp Southern blot ..................................................................... 35
2.3.11. Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) .............................. 36
2.3.12. Phương pháp nhân giống vô tính các dòng bạch đàn Urô ........................ 37
2.3.13. Đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn chuyển gen GS1 .............. 38
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 39
3.1. Kết quả sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trên môi trường kháng
sinh chọn lọc in vitro ........................................................................................... 39
3.2. Kết quả sàng lọc các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 in vivo ............. 42
3.3. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kỹ thuật
PCR ..................................................................................................................... 45
3.4. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật lai
Southern............................................................................................................... 48
3.5. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật
RT-PCR ............................................................................................................... 49
3.6. Kết quả đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển trong các dòng bạch đàn
Urô chuyển gen GS1 ........................................................................................... 51
3.7. Kết quả đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 55
3.7.1. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1
trồng trong nhà lưới ............................................................................................. 55


v

3.7.2. Đánh giá sinh khối tươi của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và
đối chứng giai đoạn vườn ươm ........................................................................... 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa đầy đủ

Chữ viết tắt
A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-Benzylaminopurine

cDNA

Complementary DNA

CS.

Cộng sự

DNA

Axic deoxiribonucleic

E.

Eucalyptus
Food and Agriculture Organization of the United

FAO

Nations

GS

Glutamin synthetase

IBA

Indol Butyric Acid

Kan

Kanamycin

MS

Murashige & Skoog

NAA

Napthalene Acetic Acid

MT

Môi trường

NN&PTNT

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

RNA

Riboucleic acid

RT-PCR

Reverse transcription Polymerase Chain Reaction

WT

Wild type (hoang dại)


vii

DANH MỤC CÁC BÀNG
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1
trên môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro ................................................................ 26
Bảng 2.2. Cặp mồi kiểm tra gen nptII, 35S-P, NOS-T trong cây chuyển gen ..............33
Bảng 2.3. Cặp mồi kiểm tra gen GS1 trong cây chuyển gen ........................................34
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen ..................................34
Bảng 2.5. Cặp mồi kiểm tra gen GS1 từ mRNA trong cây chuyển gen .......................37
Bảng 3.1. Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô .............................. 40
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của kanamycin đến tỉ lệ cháy lá ở bạch đàn Urô không chuyển
gen .................................................................................................................................43
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin của các dòng bạch đàn
Urô chuyển gen GS1 ở nhà lưới ....................................................................................44
Bảng 3.4. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng Bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và

đối chứng .......................................................................................................................56
Bảng 3.5. Sinh khối tươi của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng
(wt).................................................................................................................................59


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vai trò của GS trong quá trình đồng hóa và tái sử dụng nitơ
(Stéphanie và cs, 2009). ...................................................................................... 14
Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-GS1................................. 17
Hình 1.3. Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen pBI121GS1. ..................................................................................................................... 18
Hình 3.1. Chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tái sinh trên môi trường chứa
kanamycin 150 mg/l , 200 mg/l và ra rễ trên môi trường ra rễ chọn lọc chứa 75
mg/l kanamycin ................................................................................................... 41
Hình 3.2. Các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới và đánh giá
tính kháng kháng sinh. ........................................................................................ 45
Hình 3.3. DNA tổng số tách chiết từ các dòng bạch đàn Urô giả định chuyển
gen GS1 ............................................................................................................... 46
Hình 3.4. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng bạch đàn Urô chuyển
gen. ...................................................................................................................... 46
Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô
chuyển gen........................................................................................................... 47
Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter và NOS-T từ các dòng bạch
đàn Urô chuyển gen GS1. ................................................................................... 48
Hình 3.7. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn Urô chuyển gen GS1......... 49
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR các dòng cây bạch đàn Urô chuyển
gen GS1 bằng mồi GS1-F/R và Act-F/R. ........................................................... 50
Hình 3.9. Các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở chu kì nhân giống thứ 5. 51
Hình 3.10. DNA tổng số các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tách chiết ở

chu kì 5 trên gel agarose 0,8%. ........................................................................... 52
Hình 3.11. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 + NOS -T từ các dòng bạch đàn
Urô chuyển gen GS1............................................................................................ 53


ix

Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô
chuyển gen GS1. .................................................................................................. 54
Hình 3.13. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter và NOS-T từ các dòng
bạch đàn Urô chuyển gen GS1 nhân giống vô tính ở CK5. ................................ 55
Hình 3.14. Tăng trưởng về chiều cao cây của các dòng bạch đàn chuyển gen
GS1 và đối chứng (wt) ở giai đoạn 3 tháng tuổi ở nhà lưới................................ 57
Hình 3.15. Kiểu hình của dòng cây chuyển gen GS1 và đối chứng không chuyển
gen giai đoạn 3 tháng tuổi. .................................................................................. 58
Hình 3.16. Sinh khối của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng
không chuyển gen (wt). ....................................................................................... 60


x

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Thị Huyền, Chu Hoàng
Hà, Tạo cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 mã hóa glutamin synthetaza tăng
cường hiệu quả sử dụng nitơ, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
17(2017), 130-135.


1

MỞ ĐẦU
Bạch đàn là loài cây được trồng rừng với diện tích lớn và phổ biến nhất
trên thế giới, ước tính khoảng 20 triệu ha (GIT Forestry, 2008). Gỗ Bạch đàn
đang được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho các nhà máy sản xuất
giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản
xuất bột giấy. Ngoài ra, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng để sản xuất ván dăm,
ván sợi xuất khẩu, làm đồ mộc, cột chống, lá của một số loài được sử dụng để
tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Do đó, cây Bạch đàn được xếp
vào danh mục giống cây trồng lâm nghiệp chính của Việt Nam (Thông tư số
44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT).
Với giá trị to lớn của cây bạch đàn trong trồng rừng sản xuất, việc ứng
dụng kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây bạch đàn chuyển gen sinh trưởng
nhanh đang rất được quan tâm. Để cải thiện giống cây trồng lâm nghiệp sinh
trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen, có hai hướng chính là chuyển các gen
liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng dạng hoạt động và các
gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho, v.v, trong đó
chuyển gen liên quan đến quá trình đồng hóa nitơ được đánh giá là có triển vọng
nhất. Bởi vì, nitơ là một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan
trọng nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nitơ có thể được
đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và
nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp. Gen GS1 mã hóa cho glutamine
synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hoá glutamic acid
thành glutamine, dùng amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Enzyme
GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ
(Dubois và cs, 1996; Cren và Hirel, 1999; Stéphanie và cs, 2009). Tăng cường
hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là nhu cầu thiết
yếu cho cây sinh trưởng; gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện
đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh

2

(Stéphanie và cs, 2009). Đã có một số nghiên cứu về chuyển gen GS1 vào cây
trồng, cây dương lai chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn nhiều so với cây
không chuyển gen ở giai đoạn cây con và trồng rừng (Gallardo và cs, 1999;
Zhong và cs, 2004); cây thuốc lá chuyển gen GS1 cho thấy mức độ phiên mã và
tổng hợp glutamine synthetase tăng cao, cây sinh trưởng nhanh hơn so với cây
đối chứng (Fuentes và cs, 2001; Nguyễn Thị Hồng Gấm và cs, 2016).
Trong khuôn khổ thực hiện đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống
Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển
gen” do Trường Đại học Lâm nghiệp chủ trì, gen GS1 đã được phân lập và thiết kế
cấu trúc vector chuyển gen thực vật, gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter cơ
định 35S và đoạn kết thúc NOS-terminator; gen chọn lọc là nptII đã được chuyển
vào bạch đàn Urô; bước đầu đã tạo được một số dòng bạch đàn Urô tái sinh từ thể
nhận gen trên môi trường chọn lọc. Với mục tiêu sàng lọc được các dòng bạch đàn
Urô chuyển gen GS1 và bước đầu đánh giá sinh trưởng của các dòng chuyển gen ở
giai đoạn vườn ươm, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích và đánh giá sinh
trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GS1” phục
vụ cho việc chọn lọc dòng bạch đàn Urô chuyển gen có sức sinh trưởng nhanh
triển vọng làm giống.
Mục tiêu của đề tài
- Xác định được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 thông qua sàng lọc
kháng sinh và phân tích sự có mặt của gen, số bản copy, mức độ biểu hiện phiên
mã bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
- Đánh giá được sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai
đoạn nhà lưới/vườn ươm.
Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Phân tích, đánh giá và chọn tạo được dòng bạch đàn Urô
chuyển gen GS1 liên quan đến quá trình đồng hóa và tái sự dụng nitơ giúp cây

3

sinh trưởng nhanh sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học trong việc tạo giống cây lâm
nghiệp chuyển gen sinh trưởng nhanh.
- Ý nghĩa thực tiễn: Phân tích, đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển qua các
thế hệ nhân giống sinh dưỡng in vitro và đánh giá được sự sinh trưởng của các
dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm sẽ làm cơ
sở cho việc chọn tạo dòng bạch đàn Urô chuyển gen sinh trưởng nhanh có triển
vọng làm giống.


4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng
Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ
Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm (Dicotyledone).
Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp
Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có
tới 900 loài, phân loài và các biến chủng bạch đàn lai trên toàn thế giới (Boland
và cs, 2006). Theo Eldridge và cs (1993) chi bạch đàn được chia làm 8 chi phụ.
Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng vào trồng rừng đại
trà, như: Loài E. camaldulensis, E. urophylla, E. tereticornis, E. grandis… Bạch
đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2 loài bạch đàn phân bố ngoài Australia là
loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake. Cho đến nay, bạch đàn đã
được gây trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các quốc gia vùng
nhiệt đới, ôn đới, như: Brazil, Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam,... (Nguyễn Hoàng
Nghĩa, 2000).
Bạch đàn là loài cây thân gỗ lâu năm, cây trồng 5 - 6 năm tuổi thường có

chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9 – 10 cm. Cây bạch đàn có cơ chế
tự bảo vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất được gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển
nhanh nhờ chồi bất định và búp phụ, do đó cây có khả năng thích nghi cao với
nhiều loại lập địa và khí hậu. Bạch đàn có thể sinh trưởng phát triển ở vùng khí
hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới (Grupo Empresarial ENCE, 2009). Bạch đàn
là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều
dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất. Do đó, bạch đàn được
trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và rừng trồng bạch đàn chiếm 0,5% diện tích
rừng trên toàn thế giới (Grupo Empresarial ENCE, 2009).
Gỗ bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công
nghiệp sản xuất giấy vì gỗ bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích
hợp cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản


5

xuất từ gỗ bạch đàn. Bên cạnh đó, gỗ bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản
phẩm thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột
chống,… Ngoài ra, lá của một số loài bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh
dầu, tanin và chế biến dược phẩm.
Trên thế giới, bạch đàn đang là một trong các loài cây trồng rừng có triển
vọng nhất đối với các ngành Lâm nghiệp, công nghiệp sản xuất gỗ và bột giấy (Wu
et al. 2006, Clarke et al. 2009, Ishiguri et al. 2013, Hung et al. 2015, Wessels et al.
2016), với diện tích trồng ngày càng được mở rộng. Bên cạnh vùng sinh thái tự
nhiên, rừng trồng bạch đàn được mở rộng từ 0,7 triệu ha năm 1955 lên hơn 20 triệu
ha năm 2009 và có mặt ở hơn 100 quốc gia trên thế giới (Iglesias và cs, 2008; Shi
và cs, 2012). Trong đó, phân bố ở châu Á 40,78%, châu Mỹ 36,41%, châu Phi
11,65%, châu Âu 6,31% và châu Đại Dương 4,85% (Global, 2009). Brazil là nước
có diện tích rừng trồng bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2012 ước tính có khoảng
6,5 triệu hecta chủ yếu phục vụ cho sản xuất giấy và bột giấy (Anuário Estatístico

Da Abraf, 2012). Ở Việt Nam, cây bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng
từ trước năm 1945, song việc gây trồng bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt
đầu từ năm 1960. Trong một thời gian ngắn, cây bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ
và trở thành một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước
ta hiện nay.
Ở Việt Nam, bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng,
có mặt tại 6/9 vùng sinh thái chính trong cả nước. Tuy nhiên, thực tế trồng rừng
ở Việt Nam cho thấy, hầu hết các vùng được quy hoạch để trồng rừng là các
vùng đất trống bạc màu và đồi trọc nghèo dinh dưỡng vì vậy mà năng suất cây
trồng giảm mạnh do cây sinh trưởng chậm, kéo dài luân kỳ khai thác. Do đó,
hiện nay việc nghiên cứu cải thiện giống cây lâm nghiệp với đặc tính sinh
trưởng nhanh trên các nền đất bạc màu rất được chú trọng. Việc nghiên cứu
chọn tạo được giống bạch đàn sinh trưởng nhanh trên các vùng đất nghèo dinh


6

dưỡng sẽ quyết định đến việc nâng cao được năng suất rừng trồng bạch đàn,
mang lại giá trị kinh tế ổn định và bền vững cho người dân trồng rừng.
Giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)
Bạch đàn Urô (E. urophylla) có nguyên sản ở Indonesia (tập trung ở một
số đảo là Flores, Adona, Pantar và Timor), phân bố từ 7030 - 100 vĩ Nam và 1220
- 1270 kinh Đông trên các dốc núi và trong các thung lũng, trên các loại đất
bazan, diệp thạch và phiến thạch, đôi khi mọc ở núi đá vôi. Bạch đàn Urô phân
bố ở độ cao 300 - 2960m so với mặt nước biển, nơi có nhiệt độ trung bình hàng
năm từ 24-280C. Nơi nguyên sản, bạch đàn Urô có thể cao 25 - 45m, dưới điều
kiện thuận lợi có thể đạt đến chiều cao 55m và đường kính trên 2m ( Eldridge và
cs, 1993).
Lần đầu tiên bạch đàn Urô có mặt ở Việt Nam trong chương trình khảo
nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm

Bắc Bộ. Các vườn giống cây trồng bằng hạt (Seedling Seed Orchard - SSO) của
loài hiện đã được xây dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Nội. Theo thông
tin từ Xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng trung tâm Bắc Bộ và Đồng bằng sông
Hồng thì hạt giống bạch đàn Urô thu tại rừng giống chuyển hoá xã Trạm Thản,
Phù Ninh, Phú Thọ là nguồn cung cấp hạt giống chính cho việc trồng rừng bạch
đàn ở các tỉnh Bắc Bộ và đáp ứng một phần nguyên liệu cho nhà máy giấy Bãi
Bằng.
Cho đến nay, ở Việt Nam, loài bạch đàn Urô đã có 3 xuất xứ (Lembata
cho vùng Bắc Trung Bộ, Lewotobi và Egon cho các tỉnh miền Bắc và Tây
Nguyên) và 6 dòng vô tính được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật: PN2,
PN14, PN10, PN46, PN47, PN3d (Lê Đình Khả và cs, 2006). Đồng thời, bạch
đàn Urô là một trong các loài cây rừng nằm trong danh mục các loài cây chủ lực
cho trồng rừng sản xuất và danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng theo
các vùng sinh thái Lâm nghiệp theo quyết định số 4861/QĐ-BNN-TCLN của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 17/11/2014.


7

Bạch đàn Urô được đánh giá là loài có dáng thân rất đẹp, chất lượng gỗ
tốt. Tại nơi nguyên sản, gỗ bạch đàn này được sử dụng với rất nhiều mục đích
như: Gỗ xây dựng, làm đồ dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ,... Tuy nhiên, bạch
đàn Urô được xem như là nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên
thế giới và Việt Nam.
1.2. Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống Bạch đàn
mới có năng suất cao, chất lượng gỗ tốt, chống chịu được sâu hại, nấm bệnh và
các điều kiện bất lợi của môi trường (hạn, mặn, lạnh) đang được thực hiện tại
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như tại Việt Nam.
Sử dụng công nghệ gen để tạo các giống bạch đàn chuyển gen với các tính

trạng quý là hướng đã và đang được nhiều nhà khoa học đánh giá cao, nhiều
quốc gia đầu tư, quan tâm nghiên cứu mạnh trong những năm gần đây, đặc biệt
là các nước như Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Brazil. Lần đầu tiên vào năm 1991 đã
công bố chuyển thành công gen cat và uidA vào loài bạch đàn E. Gunni nhờ
dung hợp tế bào trần (Teulieres và cs, 1991), từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới
trên đối tượng các loài bạch đàn cho nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Yu và cs (2013) khi chuyển gen codA vào đỉnh chồi bạch đàn Eucalyptus
globulus thu được kết quả: Ở tất cả các dòng chuyển gen đều ghi nhận hàm
lượng glycinebetaine tích lũy cao, đặc biệt là ở lá non. Đặc biệt, dòng 107-1 có
khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn các dòng chuyển gen còn lại và là
dòng bạch đàn chuyển gen chịu mặn tiềm năng.
Báo cáo kết quả đánh giá khả năng chịu mặn và an toàn sinh học môi
trường của 36 dòng bạch đàn (Eucaluptus camaldulensis) chuyển gen mangrin
chỉ ra rằng 7/36 dòng có khả năng chịu mặn cao hơn đáng kể so với các dòng
đối chứng không chuyển gen và quan trọng hơn hết báo cáo không ghi nhận một
tác động đáng kể nào đến an toàn sinh học môi trường (Yu và cs, 2013).


8

Kết quả trồng khảo nghiệm trong thời gian 4 năm nhằm đánh giá, so sánh
tác động môi trường của 3 dòng bạch đàn (Eucalyptus globulus Labill.) chuyển
gen codA (gen choline oxydase) có nguồn gốc từ vi khuẩn Arthrobacter
globiformis và 3 dòng bạch đàn không chuyển gen làm đối chứng của nhóm tác
giả Oguchi và cộng sự (2014) cho thấy: Không có sự khác biệt đáng kể giữa các
dòng bạch đàn chuyển gen và không chuyển gen trên các biến số quan sát bao
gồm: sản xuất sinh khối, hệ vi sinh vật đất liền kề và thảm thực vật bằng cách
giám sát các thông số tăng trưởng, thay đổi theo mùa ở các vi khuẩn đất và hoạt
động allelopathic của lá.
Năm 2016, nhóm tác giả Ouyang và cộng sự công bố công trình về ảnh

hưởng của gen aiiA cảm ứng tính kháng bệnh cho dòng bạch đàn lai (Eucalyptus
urophylla × Eucalyptus grandis) cho thấy: N-acyl-homoserine lactones (AHLs) là
những chất chuyển hóa của hầu hết vi khuẩn gram âm và là phân tử tín hiệu quan
trọng trong hệ thống cảm ứng của vi khuẩn. Ở nồng độ ngưỡng, AHLs có thể kích
hoạt sự biểu hiện của gen gây bệnh và gây ra bệnh ở thực vật. Vì vậy, làm giảm
nồng độ AHLs là điểm cốt lõi trong kiểm soát bệnh ở thực vật. AHL- lactonase
được mã hóa bởi aiiA, có phổ biến trong nhóm Bacillus sp., và có thể thủy phân
AHLs. Trong nghiên cứu này, gen aiiA nhân lên từ Bacillus subtilis bằng PCR.
Vector biểu hiện ở thực vật Pcam-PPP3-aiiA chứa gen aiiA được xây dựng, trong
đó aiiA được điều khiển bởi promoter PPP3 cảm ứng gây bệnh ở thực vật.
Plasmid tái tổ hợp được chuyển vào Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis
bằng Agrobaterium tumefaciens. Kết quả PCR và lai Southern khẳng định aiiA đã
được gắn thành công vào hệ gen của Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis.
RT –PCR cho thấy aiiA biểu hiện giống như sau khi tiêm Ralstonia solanacearum
12h. Hiệu quả phiên mã của aiiA tăng tương ứng 43,88 -30,65 và 18,95 lần sau
khi tiêm Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora và Cylindrocladium
quinqueseptatum, được xác định nhờ phản ứng RT-real time - PCR. Chuyển gen
vào Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis biểu hiện sự tổng hợp protein gen
aiiA tăng cường đáng kể khả năng kháng bệnh so với cây không chuyển gen bằng
cách trì hoãn sự bắt đầu héo và làm giảm chỉ số bệnh.


9

Công bố của Keadtidumrongkul và cộng sự (2017) cho biết: Các Module
gắn carbohydrate vào thành tế bào (Cell-wall-targeted Carbohydrate Binding
Modules – CBMs) có thể làm thay đổi tính chất của thành tế bào và điều chỉnh
tăng trưởng và phát triển trong thực vật. Gen CBM2a được xác định có khả năng
liên kết cellulose tinh thể. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả chuyển gen
CBM2a vào Arabidopsis, thuốc lá và bạch đàn (Eucaluptus camaldulensis) dưới

sự điều khiển của hai loại promoter CaMV35S và AtEXP4pro (promoter đặc
hiệu mô mạch có nguồn gốc từ Arabidopsis expansin4). Ở thuốc lá cho thấy, cây
chuyển gen CBM2a dưới sự điều khiển của CaMV35S hay AtEXP4 không có sự
khác biệt trong sinh trưởng so với cây đối chứng. Tuy nhiên, ở Arabidopsis và
bạch đàn lại thu nhận được cây chuyển gen CBM2a dưới sự điều khiển của
AtEXP4 có sự gia tăng về chiều cao cây, chiều dài rễ, mở rộng diện tích, chiều
dài sợi vùng xylem và các tế bào mạch so với cây đối chứng không chuyển gen.
Những kết quả này có thể được sử dụng là dữ liệu áp dụng trong cải tiến sinh
khối ở một số loài thực vật.
Có thể thấy rằng các nghiên cứu chuyển gen trên cây Bạch đàn rất đa
dạng và thu được kết quả đáng ghi nhận. Tuy nhiên, Bạch đàn là cây lâm nghiệp
trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh trưởng và chất lượng gỗ là những tính trạng
được quan tâm hàng đầu, nhằm nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích
rừng trồng. Theo báo cáo của FAO (2004) các nghiên cứu về cải tạo giống cây
lâm nghiệp có liên quan đến tăng tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt
chiếm 63%. Cho đến nay, có nhiều hướng nghiên cứu theo định hướng tạo giống
cây lâm nghiệp chuyển gen có khả năng sinh trưởng nhanh như: chuyển gen làm
giảm hàm lượng lignin; chuyển gen gây ức chế ra hoa; chuyển gen tăng cường
sử dụng các nguyên tố khoáng; chuyển gen tăng sự phân chia tế bào; chuyển gen
tăng tổng hợp chất điều tiết sinh trưởng gibberellin (GA) dạng hoạt động và
chuyển gen tăng khả năng đồng hóa và sử dụng hiệu quả nitơ. Trong các hướng
nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu tăng khả năng sử dụng hiệu quả nitơ là
hướng đi tương đối mới và chưa có nhiều công trình công bố trên đối tượng
bạch đàn.


10

1.3. Gen GS1 và kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây trồng
Nitơ là một trong những nguyên tố phổ biến nhất trong tự nhiên. Các dạng

nitơ chủ yếu trên Trái Đất là nitơ liên kết của thạch quyển và nitơ phân tử của
không khí. Nitơ phân tử (N2) trong khí quyển chiếm tới 75,6% khối lượng không
khí. Dự trữ nitơ trong khí quyển có tới 4.1015 tấn. Cột không khí trên 12m mặt
đắt chứa 8 tấn nitơ. Tuy nhiên, cây không thể hút được nitơ phân tử như vậy.
Cây chỉ hút được nitơ ở dạng liên kết nhờ hoạt động của các vi sinh vật cố định
nitơ. Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý
đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và ảnh hưởng trực tiếp đến
năng suất mùa vụ. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai
trò quyết định trong quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng và hoạt động
sinh lý của cây.
Nitơ là thành phần chủ yếu của protein một trong bốn hợp chất quan trọng
nhất của sự sống, protein tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể, xúc tác
cho mọi phản ứng từ đơn giản như phản ứng hydrat hoá đến phức tạp như tổng
hợp DNA, sinh tổng hợp protein, vận chuyển chất dinh dưỡng, tham gia vào các
cấu trúc đặc thù để kiến tạo và bảo vệ cơ thể, là thành phần quan trọng của màng
sinh chất của tế bào cũng như các bào quan bên trong. Nitơ có trong thành phần
của acid nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức năng duy trì và truyền thông tin di
truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp
protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào... Nitơ là thành phần quan
trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định hoạt động quang
hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên trái đất.
Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin. Đây là
những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và
của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng
trong trao đổi năng lượng của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của
phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây có


11

liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy mầm, tính hướng
quang. Vì vậy, trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển cây rất nhạy cảm với
nitơ. Trong điều kiện thiếu nitơ: cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng
hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và
tích lũy, giảm năng suất. Tùy theo mức độ thiếu đạm (hay thiếu nitơ) mà năng suất
giảm nhiều hay ít. Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung
phân đạm là cây sinh trưởng và phát triển bình thường.
Do đó, nitơ là một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò rất
quan trọng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu
trúc cơ bản nên các phân tử như nucleic acid và protein trong tế bào. Trong cây,
nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ
từ môi trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình
trao đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động
nitơ trong một vài protein. Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) đóng vai trò
trung tâm, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá glutamic acid thành glutamine (tiền
thân của glutamate và của tất cả các hợp chất nitơ cần thiết cho sự phát triển của
cây) phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac (NH4+) như một cơ chất (Miflin và Lea,
1980).
Có hai dạng chính là glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy
trong tế bào chất của lá và các tổ chức không quang hợp và glutamine synthetase
ở lục lạp (GS2) chỉ có trong lục lạp của các mô tham gia vào quá trình quang
hợp và plastid của rễ, trong đó GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc
đồng hóa và tái sử dụng nitơ thông qua các quá trình trao đổi chất khác như quá
trình sinh tổng hợp phenylpropanoid, quá trình phân giải protein, chlorophyl
(Dubois và cs, 1996; Cren và Hirel, 1999; Stéphanie và cs, 2009).
GS1 là một octamer protein/enzyme bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có
khối lượng phân tử 38 – 41 kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số
loài, như thuốc lá, cà chua, thông,... GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn

12

vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành
phân tử GS1 được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước khác nhau (Becker và
cs, 1992; Cantón và cs, 1999; Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm
phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo
thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác
nhau này sẽ liên quan đến hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng.
Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng các polypeptid
của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã tiến hành
và xác nhận được vai trò quan trọng của các axit amin chìa khoá trong tính chất
xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999).
Mặc dù thông thường chỉ có một gen mã hoá cho GS1 nhưng các nghiên
cứu trên một phổ rộng các loài đã cho thấy rằng GS1 được mã hoá bởi một họ
gen, có thể từ 03 đến 06 gen. Trong đậu Hà lan có 03 gen GS1 biểu hiện trong lá
và trong các tế bào Libe (phloem). Hai trong các gen đó là GS3A và GS3B có
trình tự tương đồng cao ở cả vùng mã hoá (99%) và vùng không mã hoá (96%),
polypeptid của chúng chỉ khác nhau ở 03 acid amin (Walker và cs, 1995). Năm
gen của GS1 được tách từ lá ngô bởi Li và cs (1993). Ba trong các gen này là
GS1-2, GS1-3, GS1-4 biểu hiện mạnh trong lá trưởng thành, trong mầm hạt và
trong thân ngô, hai gen còn lại GS1-5, GS1-1 biểu hiện trong mầm hạt, trong thân
nhưng không thấy biểu hiện trong lá. Những phân tích về hệ thống phát sinh gen
GS được nghiên cứu bởi Biesiadka và Legocki (1997).
Các nghiên về rễ và các nốt rễ (Ireland and Lea, 1999) đã chỉ ra rằng GS1
biểu hiện trong lá và tiếp sau đó là sự tổng hợp các polypeptid tương ứng. Trong
nhiều thực vật C3, GS1 được mã hoá bởi một gen, sự biểu hiện chủ yếu ở rễ và
biểu hiện càng mạnh mẽ trong lá già (Brugière và cs, 2000). Trong thực vật C4,
sự biểu hiện của gen GS1 xuất hiện chủ yếu ở rễ và chồi rồi giữ ở mức độ cao
trong cả hai cơ quan này trong suốt quá trình phát triển của thực vật (Li và cs,

13

1993). Tìm thấy một hoặc hai gen trong họ đa gen của GS1 trong mô vân lá của
trong thực vật C3, C4, cây họ lúa và cây ngoài họ lúa (Dubois và cs, 1996).
Trong phloem, protein GS đóng vai trò vận chuyển và tập hợp nitơ trong
cây (Sakurai và cs, 1996). Cũng có giả thuyết cho rằng có thể tồn tại một
enzyme khác có hoạt tính của enzyme GS1 trong phloem khác với enzyme GS1
trong lá và nốt sần. Để làm sáng tỏ giả thuyết này người ta phân tích cây thuốc
lá chuyển gen gây bất hoạt enzyme GS1 trong phloem và xác định vai trò của
enzyme GS1 trong quá trình tổng hợp amino acid prolin, là amino acid chỉ thị
trong điều kiện khô hạn.
Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ
vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho
thấy, nếu gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc
nghèo nguồn nitơ vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stéphanie và cs, 2009).
Kết quả nghiên cứu cây dương chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới cho thấy
hoạt động của glutamin synthase được cải thiện đáng kể ở lá non và cùng với đó
là sự tăng trưởng chiều cao vượt trội hơn so với cây đối chứng không chuyển
gen được ghi nhận. So với các cây không chuyển gen, cây chuyển gen thể hiện
số lượng lớn hơn các mầm lá và lá, cũng như cùng với đó là sự gia tăng diện tích
lá (Fu và cs, 2003). Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1
dưới sự điều khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x
P.alba 7171), kết quả cho thấy cây chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn so với
cây đối chứng là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các khảo
nghiệm cây chuyển gen trên đồng ruộng thể hiện những đánh giá quan trọng về
vai trò sinh học của các gen đích và rất cần thiết để xác minh khả năng sử dụng
gen đích đó cho mục đích thương mại. Một nghiên cứu thực nghiệm kéo dài
trong 3 năm trên 8 dòng cây dương chuyển gen GS1 và các cây đối chứng không
chuyển gen tại tỉnh Granada của Tây Ban Nha thu được kết quả cho thấy biểu

hiện của gen chuyển ổn định trong suốt thời gian nghiên cứu. Hơn nữa, các dòng
cây dương chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện enzyme glutamine synthetase