TẠO DÒNG BIỂU HIỆN GEN ORF6 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG BIỂU HIỆN GEN ORF6 CỦA VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VÕ TẤN HÙNG

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TẠO DÒNG BIỂU HIỆN GEN ORF6 CỦA VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

VÕ TẤN HÙNG

KS. VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình
dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn là PGS.TS. Nguyễn
Ngọc Hải và KS. Võ Khánh Hưng đã tạo cơ hội cho tôi được làm đề tài này, hướng
dẫn, giúp đỡ, động viên tôi, tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Thảo ở Trung tâm Công nghệ
Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực
hiện đề tài này.
Cảm ơn các anh chị, quý thầy cô ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi
trường đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện.

Xin cám ơn tất cả các bạn sinh viên lớp DH08SH đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ
vui buồn cùng tôi trong khoảng thời gian vừa qua.
Cuối cùng, con luôn ghi nhớ công lao sinh thành và dưỡng dục của bố mẹ, cảm
ơn bố mẹ và hai em đã luôn yêu thương, ủng hộ, tạo điều kiện cho con được học tập
tốt; động viên, giúp đỡ con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống cũng như trong
suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Võ Tấn Hùng

i


TÓM TẮT
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, do virus PRRS gây ra, là một trong
những bệnh gây thiệt hại về kinh tế nhiều nhất ở các nước phát triển ngành chăn nuôi
lợn, trong đó có Việt Nam. Nhiều nghiên cứu cho thấy protein M được mã hóa bởi gen
ORF6 là protein có tính kháng nguyên cao và là protein cấu trúc bảo tồn nhất giữa các
chủng virus PRRS châu Âu và Bắc Mỹ. Việc biểu hiện protein M nhằm hướng đến
việc phát triển kít ELISA chẩn đoán virus PRRS hay phát triển vaccine tiểu đơn vị là
rất cần thiết. Do đó, mục đích chính của nghiên cứu này nhằm tạo dòng gen ORF6 vào
vector biểu hiện.
Trong nghiên cứu này, đầu tiên vùng trình tự chứa gen ORF6 từ virus PRRS thực
địa (Bình Dương) được thu nhận bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi ORF6-F1 và
ORF6-R1. Sau đó, vùng trình tự chứa gen ORF6 được tạo dòng vào vector pGEM-T
Easy trong tế bào E. coli DH5α (E. coli DH5α-pGEM-ORF6). Tiếp theo, gen ORF6
được thu nhận từ vector tái tổ hợp pGEM-ORF6 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ORF6F2 và ORF6-R2. Cuối cùng, gen ORF6 được tạo dòng vào vector biểu hiện pGEX-4T1
trong tế bào E. coli BL21 (E. coli BL21-pGEX-ORF6).
Kết quả cho thấy vùng trình tự chứa gen ORF6 có kích thước 780 bp đã được
chèn thành công vào vector pGEM-T Easy trong tế bào E. coli DH5α. Gen ORF6 có
kích thước 525 bp được thu nhận và chèn thành công vào vector biểu hiện pGEX-4T1
trong tế bào E. coli BL21. Dòng E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 sẵn

sàng cho việc cảm ứng biểu hiện protein M bằng IPTG, nhằm phục vụ cho các nghiên
cứu tiếp theo.

ii


SUMMARY
Thesis “Molecular cloning of ORF6 gene of Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus (PRRSV)”
Porcine reproductive and respiratory syndrome, caused by PRRS virus, has been
considered one of the most causing economic loss diseases in many swine-producing
countries, including Vietnam. Many studies suggested that M protein (matrix protein)
encoded by ORF6 gene has highly antigenicity and is the most conserved structural
protein between North American and European isolates. The expression of M protein
for developing a diagnostic ELISA kit or subunit vaccine is essential. Therefore, the
major purpose of this study is to clone ORF6 gene into expression vector.
In this study, the sequence including ORF6 gene from field PRRS virus (Binh
Duong province) was obtained by RT-PCR with primer pair ORF6-F1 and ORF6-R1.
After that, the sequence including ORF6 gene was cloned into pGEM-T Easy vector in
E. coli DH5α (E. coli DH5α-pGEM-ORF6). Next, ORF6 gene was amplified from
pGEM-ORF6 recombinant vector by PCR with primer pair ORF6-F2 and ORF6-R2.
Finally, ORF6 gene was cloned into pGEX-4T1 expression vector in E. coli BL21
(E. coli BL21-pGEX-ORF6).
The results indicated that the sequence including ORF6 gene (780 bp) was
successfully inserted into pGEM-T Easy vector in E. coli DH5α. ORF6 gene (525 bp)
was successfully obtained and inserted into pGEX-4T1 expression vector in E. coli
BL21. The E. coli BL21 strain carrying pGEX-ORF6 recombinant vector is ready for
expression of M protein by IPTG induction, to serve for further studies.
Keywords: PRRS, ORF6, cloning, E. coli

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng ....................................................................................................... ix
Danh sách các hình ..........................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................2
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ............................................................2
2.1.1. Phân bố của bệnh ...................................................................................................2
2.1.2. Virus gây bệnh .......................................................................................................2
2.1.3. Đường lây truyền của PRRS .................................................................................4
2.1.4. Triệu chứng lâm sàng ............................................................................................4
2.1.5. Bệnh tích của PRRS ..............................................................................................5
2.1.6. Các phương pháp chẩn đoán PRRS .......................................................................5
2.1.7. Điều trị và phòng bệnh ..........................................................................................6
2.2. Các nghiên cứu liên quan đến protein M của virus PRRS .......................................6
2.2.1. Nghiên cứu nước ngoài .........................................................................................6
2.2.2. Nghiên cứu trong nước ..........................................................................................9
2.3. Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai ................................................................................9
2.3.1. Khái quát tạo dòng.................................................................................................9

2.3.2. Vật liệu dùng trong tạo dòng ...............................................................................10
2.3.3. Kỹ thuật dùng trong tạo dòng ..............................................................................11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................14
iv


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................14
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................14
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................14
3.2.2. Hóa chất và môi trường .......................................................................................14
3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................14
3.2.2.2. Môi trường ........................................................................................................15
3.2.3. Vật liệu sinh học ..................................................................................................15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.1. Tạo dòng vùng chứa gen ORF6 vào vector pGEM-T Easy ................................17
3.3.1.1. Ly trích RNA virus PRRS ................................................................................17
3.3.1.2. Khuếch đại vùng chứa gen ORF6 bằng RT-PCR.............................................17
3.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR..................................................................................18
3.3.1.4. Nối sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy .................................................19
3.3.1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α ...................................................19
3.3.1.6. Chọn lọc dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp .......................................20
3.3.2. Tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu hiện pGEX-4T1........................................22
3.3.2.1. Thu nhận gen ORF6 từ vector pGEM-ORF6 bằng PCR..................................22
3.3.2.2. Cắt gen ORF6 bằng enzyme BamHI và EcoRI ................................................23
3.3.2.3. Ly trích vector pGEX-4T1 ...............................................................................24
3.3.2.4. Mở vòng vector pGEX-4T1 bằng enzyme BamHI và EcoRI...........................25
3.3.2.5. Nối gen ORF6 vào vector pGEX-4T1 ..............................................................25
3.3.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli BL21 ....................................................26
3.3.2.7. Chọn lọc dòng E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp ........................................26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28

4.1. Kết quả ....................................................................................................................28
4.1.1. Tạo dòng vùng chứa gen ORF6 vào vector pGEM-T Easy ................................28
4.1.1.1. Thu nhận vùng chứa gen ORF6........................................................................28
4.1.1.2. Tạo vector pGEM-T Easy tái tổ hợp và biến nạp vào E. coli DH5α ...............29
4.1.1.3. Chọn lọc dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp .......................................29
4.1.2. Tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu hiện pGEX-4T1........................................32
4.1.2.1. Thu nhận và cắt gen ORF6 với enzyme giới hạn .............................................32
4.1.2.2. Ly trích và mở vòng vector pGEX-4T1 ...........................................................32
v


4.1.2.3. Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào E. coli BL21 .........................................33
4.1.2.4. Chọn lọc dòng E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp ........................................34
4.2. Thảo luận ................................................................................................................37
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................40
5.1. Kết luận...................................................................................................................40
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................41
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ampr

Gen kháng ampicillin

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

bp

Base pair

BSA

Bovine Serum Albumin

cDNA

Complementary DNA

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

FAO

Food and Agriculture Organization

GST

Glutathione S-transferase

IFA

Indirect immunofluorescence assay

IPMA

Immunoperoxidase Monolayer Assay

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactoside

kb

Kilobase pair

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

MCS

Multiple cloning site

mRNA

Messenger ribonucleic acid

MSD

Mystery swine disease

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical density

OIE

World Organisation for Animal Health
vii


ORF

Open reading frame

PAM

Porcine alveolar macrophages

PCR

Polymerase chain reaction

PEARS

Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome

PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus

RE

Restriction Enzyme

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse Transcription PCR

SIRS

Swine infertility and respiratory syndrome

SOC

Super Optimal broth with Catabolite repression

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris-borate-EDTA

UV

Ultraviolet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Trình tự mồi khuếch đại vùng chứa gen ORF6 .............................................18
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng chứa gen ORF6 ...............18
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng chứa gen ORF6 ..........18
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối gen vào vector pGEM-T Easy .............................19
Bảng 3.5 Thành phần PCR khuẩn lạc kiểm tra E. coli DH5α-pGEM-ORF6 ...............20
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt PCR khuẩn lạc kiểm tra E. coli DH5α-pGEM-ORF6 ..........21
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng cắt pGEM-ORF6 với enzyme EcoRI.........................21
Bảng 3.8 Trình tự mồi khuếch đại gen ORF6 ...............................................................23

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng PCR thu nhận gen ORF6 ...........................................23
Bảng 3.10 Chu trình nhiệt phản ứng PCR thu nhận gen ORF6 ....................................23
Bảng 3.11 Thành phần phản ứng cắt gen ORF6 với BamHI và EcoRI ........................24
Bảng 3.12 Thành phần phản ứng cắt pGEX-4T1 với BamHI và EcoRI .......................25
Bảng 3.13 Thành phần phản ứng nối gen ORF6 vào pGEX-4T1 .................................25
Bảng 3.14 Thành phần PCR khuẩn lạc kiểm tra E. coli BL21-pGEX-ORF6...............26
Bảng 3.15 Chu trình nhiệt PCR khuẩn lạc kiểm tra E. coli BL21-pGEX-ORF6 .........27
Bảng 3.16 Trình tự mồi giải trình tự trên pGEX-ORF6 ...............................................27

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình thái và cấu trúc virus PRRS ....................................................................3
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen virus PRRS ............................................................................3
Hình 2.3 Virus PRRS xâm nhiễm các đại thực bào ........................................................4
Hình 2.4 Một số triệu chứng lâm sàng của PRRS ..........................................................4
Hình 2.5 Các bước tạo dòng gen ....................................................................................9
Hình 3.1 Vector tạo dòng pGEM-T Easy và những đặc điểm chính ............................16
Hình 3.2 Vector biểu hiện pGEX-4T1 và những đặc điểm chính ................................16
Hình 3.3 Quy trình tạo dòng vùng chứa gen ORF6 vào pGEM-T Easy. .....................17
Hình 3.4 Quy trình tạo dòng gen ORF6 vào vector pGEX-4T1...................................22
Hình 4.1 Kết quả RT-PCR thu nhận vùng chứa gen ORF6..........................................28
Hình 4.2 Kết quả biến nạp vector pGEM-ORF6 vào E. coli DH5α .............................29
Hình 4.3 PCR khuẩn lạc kiểm tra dòng E. coli DH5α mang pGEM-ORF6 .................30
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra vector pGEM-ORF6 bằng enzyme EcoRI .........................30
Hình 4.5 Kết quả phân tích trình tự vùng chứa gen ORF6 trên NCBI .........................31
Hình 4.6 Kết quả PCR thu nhận gen ORF6 từ pGEM-ORF6 ......................................32
Hình 4.7 E. coli BL21 mang pGEX-4T1 trên môi trường LB-ampicillin 100 µg/ml. .33
Hình 4.8 Mở vòng vector pGEX-4T1 ...........................................................................33

Hình 4.9 Kết quả biến nạp pGEX-ORF6 vào E. coli BL21 .........................................33
Hình 4.10 PCR khuẩn lạc kiểm tra dòng E. coli BL21 mang pGEX-ORF6. ...............34
Hình 4.11 Kết quả phân tích gen ORF6 chèn vào pGEX-4T1 trên NCBI. ..................35
Hình 4.12 Kết quả giải trình tự sau khi BLAST trên vector pGEX-4T1......................36
Hình 4.13 Kết quả phân tích trình tự amino acid mã hóa bởi gen ORF6 .....................36

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi ở Việt Nam nói chung và ngành chăn nuôi lợn nói riêng đã và
đang đóng góp giá trị khá lớn trong nền kinh tế nước ta. Hiện nay, các nhà chăn nuôi
phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là trong việc kiểm soát và ngăn chặn các
mầm bệnh. Trong đó, một trong những bệnh gây thiệt hại về kinh tế nhiều nhất ở lợn
hiện nay là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome - PRRS). Bệnh do virus PRRS gây ra, tỷ lệ nhiễm bệnh cao,
xảy ra ở mọi lứa tuổi, gây nhiều khó khăn trong công tác chẩn đoán và phòng ngừa.
Nghiên cứu về bộ gen của virus PRRS cho thấy có 9 khung đọc mở (open reading
frame - ORF) mã hóa cho các thành phần khác nhau của virus. Trong đó, vùng ORF6
mã hóa cho protein M (matrix protein) của virus có kích thước khoảng 19 kDa. Nhiều
nghiên cứu cho thấy protein M là protein cấu trúc bảo tồn nhất giữa các chủng virus
PRRS châu Âu và Bắc Mỹ. Nó có tính kháng nguyên cao và có thể tạo ra đáp ứng
kháng thể phát hiện được sau 10 ngày xâm nhiễm (Qian và ctv, 2003). Do đó, protein
này có tiềm năng sử dụng như kháng nguyên cho các xét nghiệm miễn dịch như
ELISA và có thể được phát triển để tạo ra vaccine tiểu đơn vị.
Đáp ứng những nhu cầu trên, nghiên cứu: “Tạo dòng biểu hiện gen ORF6 của
virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV)” được thực hiện, bước
đầu tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu hiện, phục vụ cho việc biểu hiện protein M và
các nghiên cứu tiếp theo như phát triển bộ kít chẩn đoán ELISA cũng như vaccine tiểu

đơn vị, góp phần vào công tác chẩn đoán và ngăn ngừa căn bệnh nguy hiểm này.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo dòng gen ORF6 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
(PRRSV) vào vector biểu hiện nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
1.3. Nội dung thực hiện
-

Tạo dòng vùng chứa gen ORF6 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô
hấp ở lợn vào vector pGEM-T Easy trong tế bào E. coli DH5α.

-

Thu nhận gen ORF6 và tạo dòng vào vector biểu hiện pGEX-4T1 trong tế bào
E. coli BL21.
1


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome), còn gọi là bệnh tai xanh là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây
lan nhanh, làm ốm và chết nhiều lợn nhiễm bệnh. Bệnh được xếp vào nhóm B trong
danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới. Cho đến nay, lợn là động
vật duy nhất mắc hội chứng này (OIE, 2004).
2.1.1. Phân bố của bệnh
Bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 và tại châu Âu vào năm
1990 (Keffaber, 1989; Wensvoort và ctv, 1991). Sau đó bệnh lây lan rộng trên toàn thế
giới và được biết đến với nhiều tên gọi khác như bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery swine
disease - MSD), bệnh tai xanh (Blue ear disease), hội chứng hô hấp và vô sinh của lợn
(Swine infertility and respiratory syndrome - SIRS), hội chứng hô hấp và sảy thai ở

lợn (Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome - PEARS) (Wensvoort và
ctv, 1991; Paton và ctv, 1991; Benfield và ctv, 1992).
Tuy được phát hiện lần đầu tiên tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu dịch tễ học cho
rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada. Bệnh xuất hiện ở châu Âu vào năm
1990 và hiện đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục này. Các kiểm tra huyết thanh
học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines,
Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê... Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997
trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về
bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh
dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nước khác, tỷ lệ
đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 60 - 75%, Mỹ là
36% (Cục Thú y, 2007).
2.1.2. Virus gây bệnh
Bệnh do virus thuộc giống Arterivirus, họ Arteviridae, bộ Nidovirales gây ra.
Hiện tại đã xác định được hai dòng kháng nguyên chính của virus: dòng châu Âu (đại
diện là virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (đại diện là virus VR-2332). Các nghiên cứu

2


phân tử cho thấy giữa virus PRRS dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ chỉ tương đồng 60%
về nguyên liệu di truyền (Plagemann, 2003).
Virus PRRS có cấu trúc vỏ bọc dạng chuỗi đơn RNA. Bộ gen của virus có kích
thước khoảng 15 kb, bao gồm 8 khung đọc mở (ORF) mã hóa cho các thành phần khác
nhau của virus. ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein replicase và polymerase.
ORF2, 3, 4 lần lượt mã hóa cho các glycoprotein GP2, GP3 và GP4. Các ORF5, 6, 7
lần lượt mã hóa cho ba protein cấu trúc chính của virion: envelope glycoprotein GP5
(E) kích thước 25 kDa, matrix protein (M) kích thước 19 kDa và nucleocapsid protein
(N) kích thước 15 kDa (Meulenberg và ctv, 1995; Dea và ctv, 2000).

Hình 2.1 Hình thái và cấu trúc virus PRRS.
(www.porcilis-prrs.com)
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy vùng ORF2 được phân thành ORF2a và
ORF2b. Trong đó, ORF2b mã hóa cho protein nhỏ nhất của hạt virus với tên gọi là
GP2b (Snijder và ctv, 1999; Wu và ctv, 2001).

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen virus PRRS.
( www.porcilis-prrs.com)
3


Virus PRRS có thể xâm nhập và nhân lên trong các đại thực bào (các tế bào có
tác dụng bắt và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh). Khi hình thành các virion, virus phá
hủy các đại thực bào làm suy yếu sức đề kháng của cơ thể (Cục Thú y, 2007).

Đại thực bào bị nhiễm PRRSV

Đại thực bào bình thường

Hình 2.3 Virus PRRS xâm nhiễm các đại thực bào (www.thepigsite.com).
2.1.3. Đường lây truyền của PRRS
Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính của bệnh. Virus có
trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch (trong giai đoạn nhiễm trùng máu), phân, nước tiểu
và phát tán ra môi trường. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai từ
giai đoạn giữa thai kỳ trở đi và cũng được bài thải qua nước bọt và sữa. Lợn trưởng
thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai bài
thải virus tới 1 - 2 tháng. Virus có thể phát tán thông qua các hình thức: vận chuyển
lợn mang trùng, theo gió (có thể đi xa tới 3 km), bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi và
dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo (Cục Thú y, 2007).
2.1.4. Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể khác nhau tùy từng loại lợn.

Lợn nái tím bầm vành tai

Lợn có biểu hiện khó thở

Hình 2.4 Một số triệu chứng lâm sàng của PRRS (www.rovetco.com).
4


Lợn nái giai đoạn cạn sữa: sốt 40 - 42oC, biếng ăn, sảy thai vào giai đoạn cuối, tai
chuyển màu xanh nhạt, tím nhạt ở thể cấp tính, quá cấp tính, đẻ non, động dục không
bình thường, ho và viêm phổi nặng khiến lợn thường ngồi thở.
Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: sốt cao, biếng ăn, lười uống nước, mất sữa,
viêm vú, đẻ sớm, phần da mỏng biến màu (màu hồng), lờ đờ hoặc hôn mê, thai chết
lưu hoặc lợn con chết ngay sau khi sinh; lợn con mới sinh thường rất yếu, tai màu xanh
nhạt; ở thể cấp tính: đẻ non.
Lợn con: sốt cao (trên 40oC), gầy yếu, viêm phổi, mắt có dử màu nâu, phần da
mỏng như da bụng, gần mang tai thường có màu hồng, đôi khi da có vết phồng rộp,
tiêu chảy nhiều, ủ rũ, run rẩy.
Lợn nhỡ, lợn thịt: sốt cao (trên 40oC), biếng ăn, ủ rũ, ho; những phần da mỏng
như phần da gần tai, phần da bụng lúc đầu màu hồng nhạt, dần dần chuyển thành màu
hồng thẫm, tím nhạt.
Lợn đực giống: sốt, bỏ ăn, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính
dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém (Cục Thú y, 2008).
2.1.5. Bệnh tích của PRRS
Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám chắc, đặc trên các
thùy phổi. Thùy bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và đặc chắc (nhục hóa). Trên mặt cắt
ngang của thùy bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hóa mủ ở mặt
dưới thùy đỉnh. Về tổ chức phôi thai học, thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng

thâm nhiễm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp
hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm
của tế bào phế nang loại II (Pneumocyte) làm cho phế nang nhăn lại, thường bắt gặp
đại thực bào bị phân hủy trong phế nang (Cục Thú y, 2007).
2.1.6. Các phương pháp chẩn đoán PRRS
Việc chẩn đoán có thể dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả trên.
Trong phòng thí nghiệm, virus PRRS có thể phát hiện bằng phương pháp phân lập
virus, sử dụng các đại thực bào phế nang của heo (Porcine alveolar macrophages PAM) hay các tế bào MARC-145. Virus có thể phân lập được từ các mô như huyết
thanh, các dịch tiết từ heo còi cọc, phổi, hạch hạnh nhân, hạch bạch huyết và lách của
heo bệnh. Virus được nhận diện và phân loại bằng nhuộm màu miễn dịch với kháng
huyết thanh đặc hiệu (OIE, 2010). Các kỹ thuật bổ trợ như hóa mô miễn dịch và lai
5


in situ trong các mô đã được cố định và phản ứng RT-PCR đã được phát triển để xác
nhận bệnh nhiễm PRRS tại phòng thí nghiệm (Halbur và ctv, 1994; Larochelle và ctv,
1997; Wasilk và ctv, 2004).
Các xét nghiệm huyết thanh học có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể
trong huyết thanh đối với virus PRRS với độ nhạy và độ đặc hiệu tốt, nhất là dựa trên
cơ sở đàn. Có thể dùng xét nghiệm tế bào một lớp với peroxidase miễn dịch
(Immunoperoxidase monolayer assay - IPMA) để phát hiện kháng thể 1 - 2 tuần sau
khi nhiễm; phản ứng khán g thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect immunofluorescence
assay - IFA) kiểm tra k háng thể IgM trong 5 - 28 ngày và kháng thể IgG trong 7 - 14
ngày sau khi nhiễm ; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi
tiếp xúc (Yoon và ctv, 1992; Houben và ctv, 1995; Denac và ctv, 1997; OIE, 2010).
2.1.7. Điều trị và phòng bệnh
Hiện nay, vẫn chưa có thuốc đặc trị để điều trị bệnh này. Các vaccine có thể giúp
ngăn ngừa các dạng triệu chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của PRRS. Hiện nay, trên
thị trường chủ yếu có hai loại vaccine là vaccine sống giảm độc lực và vaccine bất
hoạt (Meng và ctv, 2000). Ngoài ra, có thể sử dụng một số thuốc tăng cường sức đề

kháng, điều trị triệu chứng và chủ yếu ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát. Bên cạnh đó,
cần áp dụng các phương pháp phòng tránh chung đối với mọi loại bệnh truyền nhiễm,
đặc biệt là bệnh do virus như đảm bảo vệ sinh chuồng trại, nhiệt độ chuồng nuôi, thực
hiện luân chuyển chuồng và tiêu độc định kỳ, đảm bảo dinh dưỡng. Làm theo hướng
dẫn của cán bộ thú y trong trường hợp nghi đàn có lợn nhiễm bệnh hay khi dịch đã xảy ra
(Cục Thú y, 2008).
2.2. Các nghiên cứu liên quan đến protein M của virus PRRS
2.2.1. Nghiên cứu nước ngoài
Kể từ khi xuất hiện lần đầu tiên tại Mỹ vào năm 1987, PRRS đã lây lan khá
nhanh và trở thành một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế nhiều nhất đối với hầu
hết các nước phát triển ngành chăn nuôi lợn (Meulenberg, 2000). Trước tình hình đó,
nhiều nghiên cứu về virus PRRS đã được công bố, trong đó tập trung nhiều vào các
protein cấu trúc.
Trong số ba protein cấu trúc chính của virus PRRS, có lẽ protein M (matrix
protein) được mã hóa bởi gen ORF6 là protein mà chức năng của nó ít được biết đến.
Đây là protein không glycosyl hóa, có kích thước khoảng 18 - 19 kDa (Meulenberg và
6


ctv, 1995). Nếu GP5 là protein cấu trúc biến đổi nhiều nhất giữa các chủng virus
PRRS châu Âu và Bắc Mỹ thì protein M lại là protein cấu trúc bảo tồn nhất với 78 81% trình tự amino acid tương đồng. Mặc dù chức năng của protein M chưa được biết
nhiều, nó có thể đóng vai trò trong quá trình lắp ráp và phóng thích virus (Mardassi và
ctv, 1996; Meulenberg, 2000). Protein M hình thành cấu trúc dị phân tử M-GP5 với
protein GP5 thông qua cầu nối disulfide. Cấu trúc dị phân tử này được xem là thiết yếu
trong quá trình gây nhiễm của virus vì nó đóng vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên
tế bào đích (Delputte và ctv, 2002). Do đó, để phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc
và chức năng, việc biểu hiện protein M in vitro và thu một lượng lớn protein này là
thực sự cần thiết.
Protein M của virus PRRS đã được biểu hiện thành công trong nhiều hệ thống,
bao gồm cả vi khuẩn, nấm men, Baculovirus và tế bào động vật có vú. Vào năm 2003,

Qian và ctv đã sử dụng hệ thống nấm men Pichia pastoris để biểu hiện ở mức độ cao
protein M của virus PRRS. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp thu được có thể đạt
2 g/l. Năm 2008, Suesuttajit và ctv đã tạo dòng và biểu hiện thành công protein M của
virus PRRS phân lập tại Thái Lan vào hệ thống tế bào E. coli. Sử dụng hệ thống
Baculovirus, năm 2009, Bae và ctv cũng đã thành công trong việc tạo dòng và biểu
hiện gen ORF6 của virus PRRS phân lập tại Hàn Quốc. Và gần đây, vào năm 2010,
nghiên cứu của Jeong và ctv về biểu hiện protein M bằng hệ thống tế bào động vật có
vú cũng được công bố. Trong số các hệ thống biểu hiện, hệ thống E. coli thường được
ưa chuộng do thao tác dễ, tốc độ sinh trưởng nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản.
Nhược điểm lớn nhất của hệ thống này là không có quá trình biến đổi sau dịch mã nên
protein được biểu hiện thường không có đầy đủ hoạt tính như mong muốn. Tuy nhiên,
nhiều báo cáo cho thấy protein M là protein không glycosyl hóa (Meulenberg và ctv,
1995; Dea và ctv, 1996). Do đó, hệ thống tế bào E. coli thích hợp cho các nghiên cứu
về biểu hiện protein M.
Trong các phương pháp chẩn đoán PRRS hiện nay, các phương pháp chẩn đoán
huyết thanh học thường được sử dụng, nhất là ELISA, do dễ thực hiện, độ đặc hiệu và
độ nhạy tốt, có thể áp dụng với số lượng mẫu lớn (OIE, 2010). Vào năm 1997, nghiên
cứu của Cho và ctv cho thấy phương pháp ELISA rất hiệu quả về thời gian và chi phí,
phù hợp cho việc kiểm tra một số lượng lớn mẫu trong khoảng thời gian ngắn. Bên
cạnh đó, so với phương pháp IPMA, phương pháp ELISA được chứng minh là nhạy
7


hơn trong việc phát hiện sớm kháng thể của virus PRRS (Albina và ctv, 1992). Do đó,
việc phát triển bộ kít ELISA nhằm phát hiện kháng thể của PRRS rất cần thiết. Nhiều
nghiên cứu cho thấy, protein M có tính kháng nguyên cao và có thể kích thích tạo đáp
ứng kháng thể phát hiện được sau 10 ngày xâm nhiễm (Loemba và ctv, 1996; Meng và
ctv, 1995; Gagnon và ctv, 1998). Do đó, protein M sau khi biểu hiện có thể sử dụng
làm kháng nguyên để phát triển bộ kít ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể của virus
PRRS trong mẫu huyết thanh. Đây là mục tiêu chính mà nghiên cứu này hướng đến.

Sự xâm nhiễm của virus PRRS đặt ra thách thức đối với chiến lược phát triển
vaccine hiện nay. Vaccine bất hoạt và vaccine sống giảm độc lực, hai loại vaccine
thương mại chủ yếu trên thị trường hiện nay, đều có những mặt hạn chế. Vaccine bất
hoạt không thể luôn luôn tạo ra miễn dịch bảo vệ ở mức độ đàn (Meng, 2000); trong
khi đó, vaccine sống có thể tạo ra sự bảo vệ chắc chắn chống lại PRRS nhưng nguy cơ
phục hồi lại độc lực của virus vẫn là một điều lo ngại (Botner và ctv, 1997). Vì vậy,
việc phát triển một thế hệ vaccine mới với hiệu quả bảo vệ và độ an toàn cao là cần
thiết để kiểm soát căn bệnh này.
Nhiều nghiên cứu cho thấy miễn dịch qua trung gian tế bào T là thiết yếu trong
việc bảo vệ hiệu quả chống lại virus PRRS (Zuckermann và ctv, 2007; Martelli và ctv,
2009). Phân tích đáp ứng tế bào T đối với các protein cấu trúc của virus PRRS cho
thấy protein M đóng vai trò chủ yếu trong việc cảm ứng miễn dịch tế bào ở lợn nhiễm
bệnh (Bautista và ctv, 1999). Vào năm 2011, Xiang và ctv đã báo cáo rằng việc biểu
hiện protein M sử dụng vector CAV-2 có thể kích thích một đáp ứng miễn dịch đặc
hiệu chống lại virus PRRS. Do mối liên hệ mật thiết giữa protein M và GP5, nhiều
nghiên cứu đã tập trung vào việc đồng biểu hiện protein M và GP5 nhằm đánh giá về
đáp ứng miễn dịch chống lại virus PRRS. Kết quả cho thấy khi protein M dung hợp
với GP5, nó cảm ứng miễn dịch qua trung gian tế bào mạnh hơn so với chỉ một mình
protein M (Jiang và ctv, 2006a). Việc đồng biểu hiện protein M và GP5 có thể kích
thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh hơn, đặc biệt là kháng thể trung hòa chống lại virus
PRRS (Jiang và ctv, 2006b). Còn theo nghiên cứu của Zheng và ctv năm 2007, việc
đồng biểu hiện protein M và GP5 dưới sự kiểm soát của các promoter khác nhau trong
vector virus rMAV giúp tăng cường cả đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể chống lại
virus PRRS. Như vậy, việc biểu hiện protein M hoặc đồng biểu hiện protein M và GP5

8


có thể là chiến lược hiệu quả trong việc phát triển vaccine chống virus PRRS trong
tương lai. Đây cũng là một mục tiêu khác mà nghiên cứu này hướng tới.

2.2.2. Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, PRRS được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ.
Tháng 3/2007, bệnh bùng phát tại 7 tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng, sau đó là các
tỉnh miền Trung, đồng bằng sông Cửu Long. Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi ngày
18/07/2008, tổng số lợn mắc bệnh lên tới 16.677 con, tiêu hủy 14.799 con. Mối nguy
cơ bùng phát dịch bệnh vẫn tiềm ẩn đối với nền chăn nuôi bền vững của nước ta.
Cho tới nay, nhiều nghiên cứu về PRRS đã được công bố. Đa số các nghiên cứu
đều tập trung vào việc khảo sát tỷ lệ nhiễm virus PRRS, đặc điểm dịch tễ, phân lập
virus và phát triển các phương pháp chẩn đoán. Cục Thú y đã phối hợp một số nước và
các tổ chức quốc tế như Trung Quốc, Mỹ và FAO xác định cấu trúc di truyền của một
số chủng virus PRRS phân lập trong các vụ dịch năm 2007. Kết quả cho thấy chủng
virus phân lập tại Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ và có sự tương đồng cao với các
chủng virus độc lực cao được báo cáo ở Trung Quốc gần đây (Metwally và ctv, 2010).
Năm 2009, Lê Thanh Hòa và ctv đã tiến hành phân tích gen mã hóa cho protein M của
virus PRRS tại Việt Nam và so sánh với các chủng của Trung Quốc và trên thế giới.
Kết quả tương tự được ghi nhận. Hiện nay, trong nước vẫn chưa có nghiên cứu nào về
tạo dòng biểu hiện protein M được công bố.
2.3. Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai
2.3.1. Khái quát tạo dòng
Tạo dòng là quá trình tái tổ hợp một gen
hoặc một đoạn DNA vào vector có khả năng
nhân lên một cách độc lập trong tế bào chủ. Mục
đích của việc tạo dòng nhằm thu một lượng lớn
bản sao của một trình tự DNA xác định.
Các bước cơ bản trong tạo dòng bao gồm:
chọn và xử lý vector, xử lý DNA cần tạo dòng,
tạo vector tái tổ hợp, chuyển vector tái tổ hợp
vào tế bào chủ và tiến hành sàng lọc dòng tế bào
mang vector tái tổ hợp.

Hình 2.5 Các bước tạo dòng gen.
(Brown, 2010)
9


Kỹ thuật tạo dòng được ứng dụng rộng rãi trong việc giải trình tự gen, sản xuất
các loại protein, vaccine tái tổ hợp, kháng thể đơn dòng…
2.3.2. Vật liệu dùng trong tạo dòng
Tế bào chủ: Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng tùy thuộc vào mục
đích. Tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống, chấp
nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng được những yêu cầu này và
thường được sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng. E. coli là vi khuẩn gram âm, hình que,
thường gặp trong ruột người. E. coli có một nhiễm sắc thể dạng vòng nằm trong vùng
nhân. Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã xảy ra đồng thời. Sau khi
mRNA được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước sửa
đổi sau phiên mã. Rất nhiều thí nghiệm tạo dòng gen sử dụng E. coli làm tế bào chủ.
Ngoài ra, một số tế bào chủ khác cũng được sử dụng như nấm men, tế bào thực vật, tế
bào động vật (Trịnh Đình Đạt, 2010).
Vector là phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có
khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mượn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo ra
nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Các vector phải thỏa mãn một số yêu cầu
như: Có các trình tự khởi đầu sao chép (ori - origin of replication) để tự sao chép mà
tồn tại độc lập; có các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn để gắn đoạn gen lạ vào;
các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã đoạn gen lạ; đảm bảo sự di truyền
bền vững của DNA tái tổ hợp; có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc
các gen lạ. Có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm
men…Dựa vào chức năng, người ta còn phân ra vector tạo dòng (chỉ có mục đích nhân
dòng) và vector biểu hiện (có mang các tín hiệu cần thiết cho việc biểu hiện gen). Việc
lựa chọn sử dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn DNA cần tạo dòng và
mục đích tạo dòng.

Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2 - 5 kb) dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc
thể, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn. Sự sao chép của plasmid không phụ thuộc vào
sự sao chép trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Do kích thước nhỏ nên plasmid chứa rất
ít gen chọn lọc, thường là tính kháng kháng sinh. Plasmid có thể nhận 8 - 9 kb DNA
cần dòng hóa. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid đã không ngừng được cải
tiến, ngày càng mang thêm nhiều đặc tính quý cho việc tạo dòng. Plasmid thế hệ thứ
nhất là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên như pSC1001, ColE1…Plasmid thế hệ thứ
10


hai được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của nhiều plasmid tự nhiên, gắn
thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới, điển hình là pBR322. Plasmid thế hệ thứ
ba là các plasmid mạnh nhất hiện nay, có hai đặc tính cơ bản là: Kích thước nhỏ nên
sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn; có mang một
polylinker - đoạn polynucleotide tổng hợp tương ứng với một chuỗi các vị trí nhận biết
duy nhất của các enzyme giới hạn.
Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme - RE): Enzyme giới hạn đầu tiên được
phân tách bởi Hamilton Smith vào năm 1970 từ vi khuẩn Haemophilus influenzae và
được đặt tên là HinII. Đây là những enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự
DNA nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Dựa vào khả năng
nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu gồm 4 - 8 nucleotide, người ta chia enzyme giới
hạn thành ba loại. Loại thứ nhất gồm các enzyme khi nhận biết được trình tự, sẽ di
chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 - 5000 nucleotide, cắt tại đó và
giải phóng độ vài chục nucleotide. Loại thứ hai bao gồm các enzyme nhận biết được
trình tự và cắt ngay tại vị trị đó. Loại này được sử dụng phổ biến trong công nghệ di
truyền. Loại thứ ba là các enzyme nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotide. Dựa vào trình tự nhận biết mà các enzyme giới hạn có thể cắt
DNA tạo đầu so le (sticky ends) hay đầu bằng (blunt ends). Mỗi enzyme giới hạn hoạt
động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm.
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi

cho sự tiếp xúc enzyme - cơ chất (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Enzyme nối (ligase) là các enzyme có khả năng xúc tác hình thành các liên kết
phosphodiester để nối các đoạn acid nucleic lại với nhau. Có 3 loại enzyme nối thường
dùng. Enzyme E. coli DNA ligase được tách chiết từ E. coli, xúc tác phản ứng nối hai
đoạn DNA có đầu so le. Enzyme T4 DNA ligase, tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm
E. coli, chức năng giống như E. coli DNA ligase nhưng có khả năng nối các đoạn
DNA đầu bằng, là enzyme nối được ưa chuộng nhất hiện nay. Ngoài ra còn có enzyme
T4 RNA ligase, tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, có khả năng nối hai đoạn
RNA (Trịnh Đình Đạt, 2010).
2.3.3. Kỹ thuật dùng trong tạo dòng
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karry Mullis và ctv phát minh
năm 1985, cho phép tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác
11


cao, được thực hiện trong máy luân nhiệt. Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng
lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của enzyme DNA
polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Thành phần phản ứng bao gồm: DNA
khuôn, mồi xuôi và ngược, DNA polymerase, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP),
dung dịch đệm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn.
Giai đoạn biến tính, nhiệt độ tăng lên 94 - 95oC, DNA mạch kép tách thành mạch đơn
dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ hạ xuống trong
khoảng 55 - 65oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung.
Ở giai đoạn kéo dài, nhiệt độ tăng lên 72oC, từ vị trí mồi, DNA polymerase sẽ xúc tác
phản ứng kéo dài tạo mạch mới bổ sung với mạch DNA khuôn. Kỹ thuật PCR ngày
càng được hoàn thiện với việc phát hiện và sử dụng các enzyme DNA polymerase chịu
nhiệt như Taq DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Bên cạnh
đó, các thế hệ máy PCR ngày càng hoàn thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính
xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng (Trịnh Đình Đạt, 2010).
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription PCR) về nguyên lý cũng giống như

PCR thông thường nhưng khuếch đại gen dựa trên khuôn RNA. Phản ứng bao gồm hai
giai đoạn: Giai đoạn đầu là quá trình tổng hợp sợi cDNA (complementary DNA) từ
khuôn RNA với sự xúc tác của enzyme reverse transcriptase; giai đoạn sau là quá trình
tổng hợp đoạn DNA từ khuôn mẫu cDNA với xúc tác của enzyme DNA polymerase.
Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Hai phương pháp thường
được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli là điện biến nạp (electroporation
transformation) và hóa biến nạp (chemical transformation).
Phương pháp điện biến nạp: Sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ, từ đó
gây nên sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Thể tích của dung dịch
tế bào thường được dùng là 30 µl (tương ứng với nồng độ 1010 tế bào E. coli/ml) có bổ
sung 5 ng plasmid trong một cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm.
Hiệu suất biến nạp cao, lớn hơn 109 thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và khoảng 108
thể biến nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn. Phương pháp chuẩn bị tế bào
biến nạp cũng rất đơn giản. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi
thiết bị biến nạp đắt tiền.
Phương pháp hóa biến nạp: Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở
thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận DNA plasmid. DNA plasmid đưa
12


vào bằng cách sốc nhiệt nhanh (40 - 50 giây), các tế bào biến nạp sau đó được chọn lọc
trên các đĩa agar chứa môi trường LB và kháng sinh thích hợp. Mỗi khuẩn lạc trên đĩa
kháng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn. Các tế bào chứa plasmid mang DNA
ngoại lai có thể xác định bằng mắt trên đĩa môi trường có bổ sung thêm cơ chất X-Gal
cho enzyme β-galactosidase vì chúng là các khuẩn lạc không màu do sự khử hoạt tính
của enzyme bằng cách chèn đoạn DNA ngoại lai. Hiệu suất biến nạp của phương pháp
này thấp hơn phương pháp điện biến nạp, khoảng 104 - 106 thể biến nạp/µg plasmid
(Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Giải trình tự bằng phương pháp hóa học: Dựa trên cơ sở biến tính phân tử DNA
thành các mạch đơn được đánh dấu phóng xạ bằng đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’. Các

đoạn này chia làm 4 nhóm, mỗi nhóm chịu xử lý bởi các chất hóa học khác nhau để bẻ
gãy đoạn DNA có các đầu tận cùng là A, T, G, C riêng biệt. Sau khi xử lý ta sẽ được
các đoạn DNA có tận cùng là các nucleotide khác nhau dài hơn kém nhau 1 nucleotide
và được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamide, từ đó suy ra trình tự của đoạn
DNA phân tích.
Giải trình tự bằng phương pháp dideoxy: Phương pháp dideoxy của F. Sanger
(1977) dựa trên nguyên tắc DNA polymerase xúc tác cho việc kéo dài chuỗi
polynucleotide khi gặp các deoxynucleotide dạng bình thường (dNTP), còn khi gặp
các dideoxynucleotide (ddNTP) thì quá trình tổng hợp dừng lại, do đầu 3’-OH của
ddNTP không có nhóm -OH. Người ta cho nồng độ ddNTP chỉ bằng 10% so với dNTP
nên khi tổng hợp sẽ được các đoạn nucleotide dài ngắn khác nhau. Do đó, khi điện di
trên gel sẽ được các băng dài, ngắn khác nhau một nucleotide, từ đó suy ra được trình
tự của đoạn DNA cần phân tích.
Giải trình tự DNA tự động: dựa theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được
cải tiến dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác. Trong kỹ thuật này,
người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng chất hóa học phát huỳnh
quang (fluochrome). Mỗi ddNTP được đánh dấu bằng một loại fluochrome có màu
khác nhau. Sau khi kết thúc phản ứng, ta sẽ thu được các phân đoạn DNA được đánh
dấu bằng các màu khác nhau. Phần mềm máy tính sẽ tự động giải trình tự dữ liệu từ
gel điện di và cho hình ảnh kết quả giải trình tự (Nguyễn Như Hiền, 2007).

13