NGHIÊN cứu HOẠT CHẤT SINH học từ sản PHẨM TRAO đổi CHẤT của VI KHUẨN CỘNG SINH với TUYẾN TRÙNG STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN KHOA HỌC VÀ

VÀ ĐÀO TẠO

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

NGUYỄN THỊ NHÃ

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO
ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG
STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2009

1


VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO
ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG

STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21”

Chuyên ngành:

Hoá sinh

Mã số:

60 42 30

Học viên:

Nguyễn Thị Nhã

Hướng dẫn khoa học:

TS. Phan Kế Long

2


Hà Nội – 2009
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào
tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phan Kế Long
nghiên cứu viên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, người đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo và định hướng cho tôi trong suốt thời gian

thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Hệ thống học phân tử
và Di truyền bảo tồn và phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
làm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công
việc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định.
Tôi cũng xin cảm ơn các đồng chí lãnh đạo trường THPT Gia
Bình - Bắc Ninh, cùng các đồng chí trong tổ bộ môn đã tạo điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân
trong gia đình đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian làm luận văn.
Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./.
Hà nội, ngày 19 tháng12 năm 2009
Học viên
Nguyễn Thị Nhã

3


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết
quả và số liệu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố.

Học viên:

Nguyễn Thị Nhã

4

BSL

Bướm sáp lớn Galleria mellonella

BTB

Bromothymol Blue

DMSO

Dimethyl sulfoxide

EPN

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic

HPLC

nematode)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid

HPLC/MS

chromatography)
Sắc ký lỏng khối phổ hiệu năng cao (high performance liquid

HPLC/UV

chromatography/Mass Spectrometry)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng máy dò tia tử ngoại (High

LB

performance liquid chromatography/ultraviolet)
Một môi trường nhân nuôi vi khuẩn (Luria-Bertani)

IJ

Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile)

MeOH

Methanol CH3OH

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance)

RFLP

Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction

SEM

Fragment Length Polymorphism)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope)

TTC

Triphenyltetrazolium Chloride
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

VKCS

Vi khuẩn cộng sinh

MỤC LỤC
Trang

MỞ ĐẦU

12

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

14

5


1.1Tuyến trùng EPN.

14

1.1.1. Khái niệm

14

1.1.2. Phân loại

1.1.3. Cơ chế gây bệnh của EPN

14

1.1.4. Vòng đời của tuyến trùng EPN

15

1.1.5. Quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn

16

15

1.1.4.1. Vai trò của tuyến trùng

16

1.1.4.1. Vai trò của VKCS

17

1.1.6. Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới và trong nước

17

1.1.6.1.Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới

17

1.1.6.2.Tình hình nghiên cứu EPN trong nước

18

1.2. Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

19

1.2.1. Địa điểm phát hiện

19

1.2.2. Số đo

19

1.2.3. Đặc điểm hình thái

22

1.2.4. Đặc điểm phân biệt

27

1.2.5. Mối quan hệ phát sinh chủng loại
1.3.Vi khuẩn cộng sinh

28
28

1.3.1. Xenorhabdus

28

1.3.2. Photohabdus

29

1.4.Các chất trao đổi thứ cấp

30

1.4.1 Nguồn gốc và hoạt tính sinh học

30

1.4.1.1. Nguồn gốc

31

1.4.1.2. Hoạt tính sinh học

32

1.4.2. Công thức hoá học

38

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

6

41


2.1. Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

41

2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn

41

2.3. Phương pháp phân loại VKCS

42

2.3.1. Tách chiết ADN tổng số

42

2.3.2. Nhân bản đoạn ADN đích bằng kỹ thuật PCR

43

2.3.3. Điện di ADN trên gel agarose

44

2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

44

2.3.5. Giải và phân tích trình tự ADN

45

2.3.6. Phân tích số liệu

46
47

2.4. Phương pháp tách chiết hoạt chất

47

2.4.1. Nhân nuôi vi khuẩn In-vitro
2.4.2.Tách chiết hoạt chất

47

2.3.2. Tinh sạch

48

2.3.3. Xác định cấu trúc hóa học

52

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

53

3.1. VKCS với Steinernema robustispiculum TN21

53

3.1.1. Khuẩn lạc

53

3.1.2. Phân loại

54

3.2. Hoạt chất sinh học

57

3.2.1. Phân tích bằng HPLC/MS và HPLC/UV

58

3.2.2. Xác định công thức bằng NMR

59

3.3. Đặc tính của Diketopiperazine

60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

63

PHỤ LỤC

69

7


MỤC LỤC BẢNG
Trang

Bảng 1

Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

21

Bảng 2

Các loài tuyến trùng và VKCS tương ứng (Poinar G.O)

30

Bảng 3

Các chất kháng vi sinh vật được tổng hơp từ Xenorhabdus

32

Bảng 4

và Photorhabdus
Các nồng độ của nematophin phân lập từ X. nematophilus ức

35

chế sinh trưởng của một số loài vi khuẩn và nấm
Bảng 5

Nồng độ của chất ST từ P.luminescens chống lại những nấm

35

Bảng 6

bệnh quan trọng trong nông nghiệp và y học
Phạm vi và mức độ kháng khuẩn của ES (Sundar và Chang

36

Bảng 7

FN, 1992)
Danh mục các chất kháng sinh và hoạt tính của chúng

37

Bảng 8

được biết từ Xenorhabdus spp
Thành phần hỗn hợp cho PCR

43

Bảng 9

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

44

Bảng10

Thành phần hỗn hợp phản ứng giải trình tự ADN

45

Bảng11

Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự ADN

45

Bảng 12 Tổng số các nucleotide sai khác (số bên dưới), trung bình các
nucleotide sai khác có tính đến sự thiếu hụt các nucleotide (số

56

bên trên) thông tin di truyền đoạn gen 16S của Xenorhabdus
sp. TN21 và các loài trong cùng nhóm.

MỤC LỤC HÌNH
Trang

8


Hình 1

Sơ đồ vòng đời của EPN

15

Hình 2

Steinernema robustispiculum TN21

22

Hình 3

Ảnh SEM con đực của Steinernema robustispiculum TN21

24

Hình 4

Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21

25

Hình 5

Mẫu RFLP vùng ITS của loài Steinernema robustispiculum

26

TN21 được cắt với 17 enzym
Hình 6

Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của Steinernema

28

robustispiculum với 13 loài Steinernema dựa vào sự phân tích
ITS-rDNA
Hình 7

Công thức hoá học của một số chất kháng vi sinh vật từ

40

Xenorhabdus và Photohabdus

Hình 8

Sơ đồ các bước phân lập vi khuẩn Xenorhabdus sp.

41

từ tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21
Hình 9

Sơ đồ các bước nhân nuôi vi khuẩn In-Vitro

47

Hình 10

Sơ đồ các bước tách chiết hoạt chất từ Xenorhabdus.sp
Sơ đồ các bước tinh sạch hoạt chất bằng RP- HPLC

48

51

Hình 13

Sơ đồ lý thuyết quá trình tiến hành chạy RP-HPLC
Hệ thống Bruker DRX 500 Spectrometer

Hình 14

Khuẩn

53

Hình 11
Hình 12

lạc

và

tế

bào

VKCS

với

Steinernema

49

52

robustispiculum TN21
Hình 15

Mối quan hệ họ hàng của VKCS phân lập từ Steinernema

54

robustispiculum TN 21 với các loài Xenorhabdus spp. Dựa
trên phân tích đoạn gen 16S bằng phương pháp Maximum
Parsimony.
Hình 16

So sánh đoạn gen 16S của Xenorhabdus sp. TN21 với các loài trong
cùng nhóm
9

56


Hình 17

Đồ thị phân tích sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của

58

Xenorhabdus sp. cộng sinh với Steinernema robustispiculum
TN 21 bằng HPLC/MS và HPLC/UV
Hình 18

Cấu trúc của 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo[1,2-

60

a]pyrazine-1,4-dione

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, côn trùng có hại, bệnh của loài người và cây
trồng ngày càng gia tăng. Quá trình sử dụng thuốc trừ sâu hóa học kéo dài
không những ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể sinh vật mà còn dẫn đến sự
kháng thuốc của các sâu bọ, vi khuẩn, vi rút và nấm cũng như hậu quả nặng
nề là sự ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí. Sức khoẻ của nhân loại
đang đứng trước nguy cơ đe doạ. Cũng vì thế mà hiện nay có hàng loạt thuốc
trừ sâu hoá học phải đưa vào trong danh mục cấm sử dụng. Tương tự trong
lĩnh vực y học, những thuốc kháng sinh mà trước đây tiêu diệt những tác nhân

10


gây bệnh - vi khuẩn và nấm thật sự dễ dàng, ngày nay lại có thể trở thành vô
hiệu bởi sự kháng thuốc của những tác nhân này. Hiện tượng nhờn thuốc thật
sự đáng lo ngại, đòi hỏi các nhà khoa học cần thiết phải nghiên cứu tìm ra các
loại thuốc mới đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của con người trong thời đại ngày
nay. Hơn nữa, những bệnh như bệnh lao và các bệnh ưng thư luôn có xu
hướng gia tăng số người mắc và tỉ lệ tử vong vì vậy mà tổ chức y tế thế giới
khẩn cấp khẩn thiết đối với những chính phủ tăng cường nghiên cứu của họ
để ngăn ngừa sự lây lan của dịch bệnh. Do đó, một nhu cầu khẩn cấp những
thuốc kháng vi sinh vật mới để kiểm soát những căn bệnh một cách có hiệu
quả đang trở nên cực kỳ cấp bách. Hiện nay, nguồn các hoạt chất tự nhiên
được cung cấp chủ yếu từ xạ khuẩn (actinomycetes) tuy nhiên, ngành công
nghiệp dược phẩm đang tìm kiếm những chất kháng vi sinh vật từ những
nguồn khác nữa với hy vọng nhanh chóng tìm ra những chất kháng vi sinh vật
thích hợp có hiệu lực cao và hoạt phổ rộng .
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (entomopathogenic nematodes
– EPN) hiện đang là đối tượng để tìm các hoạt chất sinh học mới từ sản phẩm
trao đổi chất thứ cấp của các vi khuẩn cộng sinh cùng với chúng,
Xenorhabdus ở Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis. Nhiều

nghiên cứu đã xác định các chất trao đổi thứ cấp này có khả năng kháng vi
sinh vật hoạt phổ rộng, ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn, nấm và các tế
bào ung thư (Akhurst và Dunphy, 1993; Chen et al, 1994; Li et al., 1995a,b).
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở Việt Nam có tính đa dạng
khá cao. Hiện nay, khoảng hơn 40 chủng EPN đã được phân lập từ các vùng
sinh thái khác nhau của Việt Nam và đây cũng là nguồn VKCS rất quan trọng
không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với thế giới (Phan Kế Long và cộng sự,
2003) tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về VKCS cũng như sản phẩm trao
đổi chất thứ cấp của chúng chính vì vậy chúng tôi thực hiên đề tài “Nghiên

11


cứu hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh với
tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN 21“ với các mục tiêu chính sau:
-Xác định VKCS với Steinernema robustispiculum TN 21 bằng phương
pháp phân tích đoạn gen 16S.
-Xác định hoạt chất sinh học từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của
VKCS này.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TUYẾN TRÙNG EPN
1.1.1. Khái niệm
Tuyến trùng là nhũng giun tròn đơn giản, sống tự do, ăn thịt, hay ký sinh.
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được gọi là EPN (Entomopathogenic
nematode) là những loài có lợi trong việc tấn công những côn trùng có hại, sâu bọ,
phần lớn giết chết hay làm suy yếu những vật chủ mà chúng ký sinh, tuy nhiên lại

12

rất an toàn đối với người, động vật và thực vật. Chúng có thể giết chết côn trùng
vật chủ chỉ trong 24-48 h.
1.1.2. Phân loại
EPN gồm có 2 giống Steinernema và Heterorhabditis.
Phylum: Nematoda
Class: Chromadorea
Order: Rhabditida
Sub-order: Tylenchina
Infra-order: Panagrolaimomorpha
Super-family: Strongyloidoidea
Family: Steinernematidae
Genus: Steinernema
Neosteinernema
Sub-order: Rhabditina
Infra-order: Rhabditomorpha
Super-family: Strongyloidea
Family: Heterorhabditidae
Genus: Heterorhabditis
Vị trí phân loại của EPN theo De Ley and Blaxter, 2002

1.1.3.Cơ chế gây bệnh của EPN
Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúng
mang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990). Các IJ xâm nhập vào
xoang máu của côn trùng vật chủ qua những lỗ mở tự nhiên (miệng, hậu môn,
tuyến tơ hoặc nơi có lớp cutin mỏng). Trong xoang máu của côn trùng vật
chủ, ấu trùng giải phóng VKCS. Ở đây, các vi khuẩn này nhân lên nhanh
13

chóng và tạo ra độc tố giết chết vật chủ trong vòng 48h (Dunphy, 1990;
Webster, 1985, 1988a; Bowen et al, 1988). Đây là khoảng thời gian cho sự
phát triển của vi khuẩn, cũng là khoảng thời gian dẫn đến cái chết của côn
trùng vật chủ và cũng là khoảng thời gian để ấu trùng của Steinernema và
Heterorhabditis trong trứng nở ra và phát triển sang thế hệ thứ hai. Các ấu
trùng xâm nhiễm sinh sôi nảy nở, chui ra khỏi xác chết côn trùng để tìm kiếm
những côn trùng vật chủ mới (Poinar, 1990).
1.1.4. Vòng đời của EPN:

Hình 1: Sơ đồ vòng đời của EPN( theo H. Kaya)

14


+ Trước tiên, ấu trùng xâm nhiễm tìm kiếm những côn trùng vật chủ và
bắt đầu những lây nhiễm. Chúng thâm nhập vào trong khoang cơ thể sâu bọ,
thông thường qua các lỗ mở tự nhiên của cơ thể (miệng, hậu môn, lỗ thở của
côn trùng) hay những vùng của biểu bì mỏng.
+ Trong khoang cơ thể côn trùng:
- Vi khuẩn cộng sinh được giải phóng và nhân lên nhanh chóng dẫn tới
cái chết của sâu bọ (Xenorhabdus ở steinernematid, Photorhabdus ở
heterorhabditid).
- Còn tuyến trùng, chúng ăn những chất dinh dưỡng từ xác côn trùng
vật chủ, lớn lên thành dạng trưởng thành; kết đôi giao phối (Steinernema đơn
tính còn Heterorhabditis thì lưỡng tính) sinh sản ra nhiều ấu trùng xâm nhiễm
mới.Vòng đời được hoàn thành trong vài ngày, trong cơ thể côn trùng, tuyến
trùng sinh trưởng, phát triển và sinh sản 2 – 4 thế hệ.
+ Cuối cùng, hàng loạt ấu trùng xâm nhiễm được giải phóng ra ngoài
lại tiếp tục tìm kiếm những côn trùng vật chủ mới và khép kín vòng đời.
1.1.5. Quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn

Thực chất mối quan hệ giữa tuyến trùng và VKCS là hiện tượng cộng
sinh mà cả 2 phía cùng có lợi.
1.1.5.1. Vai trò của tuyến trùng
Tuyến trùng mang vi khuẩn trong ruột mình, bảo vệ vi khuẩn khi ở
ngoài côn trùng vật chủ; khi ở ngoài môi trường, vi khuẩn không tồn tại ở
dạng tự do.
Tuyến trùng còn đóng vai trò quan trọng là vector vận chuyển vi khuẩn
vào xoang máu của côn trùng vật chủ, bảo vệ vi khuẩn trong xoang máu côn
trùng vật chủ bằng cách chúng tiết ra một số chất có tác dụng làm trung hoà và
làm mất tác dụng của kháng thể do côn trùng tiết ra để chống lại vi khuẩn. Nhờ
vậy mà VKCS có thể sinh sôi nhanh chóng trong ruột côn trùng.
15


1.1.4.2. Vai trò của VKCS
VKCS sản sinh độc tố giúp giết chết côn trùng vật chủ, chuyển biến xác
côn trùng vật chủ thành hỗn hợp chất chất dinh dưỡng cho tuyến trùng phát
triển ( Akhust và Dunphy, 1993). Độc tố do VKCS tiết ra làm côn trùng chết
một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h. Thời gian giết chết côn trùng vật
chủ khác nhau tuỳ tổ hợp tuyến trùng – VKCS và cũng phụ thuộc vào loại côn
trùng vật chủ.
Vi khuẩn còn cung cấp nguồn thức ăn cho côn trùng. Khi mới bắt đầu
xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng sử dụng VKCS vừa giải phóng từ
cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng
của chúng, nhờ đó các ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 nhanh chóng phát triển sang
tuổi 4 và đạt đến trưởng thành. Từ thế hệ thứ II, tuyến trùng chuyển sang dinh
dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hoá.
VKCS hoạt hoá xác chết côn trùng nhờ việc tiết ra các enzyme. Các
enzyme do vi khuẩn tiết ra có tác dụng hoạt hoá mô cơ thể côn trùng thành
nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Nhờ đó từ thế hệ thứ II, tuyến trùng

sử dụng chính xác chết của côn trùng để làm nguồn dinh dưỡng để tiếp tục
phát triển, sinh sôi nảy nở ở các thế hệ tiếp theo. Thông thường trong cơ thể
vật chủ, tuyến trùng phát triển từ 2 – 4 thế hệ.
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn đã sản sinh ra các chất trao đổi
thứ cấp mang hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập
vào xác chết côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn giành cho tuyến
trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).

1.1.6.Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới và trong nước
1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

16


EPN được tìm thấy ở các vùng sinh thái đa dạng như đất rừng, bãi cỏ, đất
hoang hóa, đất trồng trọt .v.v. và chúng đã được phát hiện ở 37 quốc gia. EPN có
nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học. Hiện nay EPN đã được ứng dụng thành
công trong phòng trừ sinh học dế trũi phá hoại sân golf ở Mỹ, sâu xanh bướm
trắng ở Indonesia Trung Quốc và Pakistan, dòi đục thân su hào ở Bỉ, Hà Lan và
Đức, sâu đục thân cọ ở Ả-rập Xê-út, và càng ngày càng có nhiều quốc gia
nghiên cứu ứng dụng EPN trong phòng trừ nhiều loài sâu hại khác nhau.
Trên thế giới tại nhiều nước phát triển như Mỹ, Ôxtrâylia và châu Âu đã
có hàng chục công ty sản xuất tuyến trùng hữu ích và đã thương mại hóa chế
phẩm sinh học. Tại Ðông Nam Á, Malaixia và Thái Lan cũng đang nghiên
cứu theo hướng này, trong đó Thái Lan đã thương mại hóa một số chế phẩm.
Ðặc biệt là Trung Quốc đã thương mại hóa các chế phẩm sinh học tuyến trùng
diệt sâu đục thân hại táo, lê, đào. Hiện Trung Quốc có các nhà máy sản xuất
lớn ở Quảng Ðông, Bắc Kinh...
1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1997 và đến

nay đã đạt được một số thành tựu đáng kể. Các nhà khoa học đã điều tra, phân
lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế xâm nhập và phát
triển của tuyến trùng EPN. Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất tuyến
trùng EPN, bước đầu xản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng - thuốc trừ sâu
sinh học đáp ứng cho nền nông nghiệp nước nhà. Do EPN có khả năng ký
sinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại khác nhau nhưng lại an toàn cho người,
động vật, thực vật và môi trường.
EPN ở việt Nam có tính đa dạng khá cao. Hiện nay đã phân lập được
khoảng hơn 40 chủng từ các vùng sinh thái khác nhau . Trong đó điều đáng quan
tâm chú ý là các chủng VKCS với 2 giống tuyến trùng nói trên: Xenorhabdus
cộng sinh với Steinernema và Photohabdus cộng sinh với Heternorhabditis.

17


Tại Việt Nam, kể từ năm 1999, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng. Cho tới nay, đã sản xuất
được bảy chế phẩm trong đó một chế phẩm được sản xuất từ tuyến trùng nhập
nội và sáu chế phẩm sử dụng sáu chủng tuyến trùng bản địa. Kết quả thử
nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hại
khác nhau. Thử nghiệm trên quy mô 1-2 ha cho thấy các chế phẩm diệt được
sâu keo da láng hại nho ở Ninh Thuận (tỷ lệ sâu chết là 70%), sâu xám hại
thuốc lá ở Ba Vì (85-90%), bọ hung đen hại mía ở Thanh Hóa (50-65%). Hiện
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã chuyển giao công nghệ sản xuất cho
Ninh Thuận ở quy mô một xưởng sản xuất nhỏ và tiếp tục chuyển giao cho
một số nơi khác (Phan Kế Long và cộng sự, 2003).
1.2. Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21
1.2.1. Địa điểm phát hiện
Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 được phân lập từ
đất rừng ở Sa Sơn, Sa Thầy thuộc dãy núi Chư Mom Ray Nam, tỉnh Kon

Tum Việt Nam bằng phương pháp bẫy mồi (Bedding & Akhurst, 1975), sử
dụng mồi là ấu trùng BSL Galleria mellonella.
1.2.2. Số đo
Số đo Hylotype

Allotype

Paratypes

(m) (♂ thế hệ 1) (♀ thế hệ 1) (♂♂,n=20)
L

W

STL

1560

150

4,5

3375

195

5

Paratypes(♀♀ IJ(n = 25)
thế hệ 1,n=20)

1433  106

3206  249

712  43

(1320 –

(2745 - 3765)

(642 – 778)

1665)

193  18

28  3

127  15

(165 – 240)

(26 – 35)

(105 – 150)

6  1 (5 - 8)

18

STW

7,5

11

4  1 (3 -5 )

10 1 (8 –12)

EP

92

110

6 1(5–

108  8

54  4

8)

(90 – 117)

(50 – 68)

95  5

226  6

120  7 (115

(89 – 104)

(216 – 239)

– 152)

173  7

148  9

84  4

(162 – 186)

(132 – 165)

(80 – 100)

120  5

29  5

75  5

(110 – 1290)

(23 – 33)

(68 – 92)

50

73 9

16  1

(59 – 87)

(14 – 18)

ES

179

NR

T

ABW

SPL

227

143

33

50

65

50

65

46  4
(39 – 56)

SPW

15

58 3
(51 – 65)

GUB

4

13  1
(11- 15)

GUW

6

41  3
(36 -44)

SP/
SPW

4,3

6  1 (5- 8)

A

10

4,6  0,4

17  1

(4,2 – 5,6)

(15 – 19)

19

25  3

B

8,7

C

47

D

51

E

48

430

SW

1,3

GS

0,67

11  1

14  1

(18 – 29)

(9 – 13)

(13 – 16)

6 1

8 1 (7 -9)

160  17

(3,6 – 6,3)

(149 – 170)

10  1

50  8

48  3

(6 – 11)

(40 – 67)

(39 – 53)

46  3

56  5

(43 – 59)

(50 – 63)

75  5
(67 – 87)

1,3  0,1
(1,1 -1,50)

Muco

2,25

0,7  0,05
(0,64 -0,79)

V

55

2,4 0,56

55  2

(1,5 -3)

(50 – 58)

H
54  3
( 49 – 62)
Bảng 1: Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

20


1.2.3. Đặc điểm hình thái

Hình 2: Steinernema robustispiculum TN21
A: Toàn bộ cơ thể con đực; B: Toàn bộ cơ thể IJ; C: phần đầu cơ thể con cái;
D, E: phần đầu IJ; F: Vùng vulval; G: Vùng đuôi con đực với sự sắp xếp của
nhú sinh dục; H: Cấu trúc gai giao cấu và đĩa đệm; I: phần đuôi con cái; J:
đuôi IJ (Phan et al, 2004)

21


Con đực (thế hệ 1): cơ thể cong về phía bụng, dạng chữ C khi xử lí nhiệt.
Vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học. Đầu tròn, hơi tách
biệt với cơ thể. Đỉnh đầu có thể nhìn thấy rõ 6 nhú môi nhọn và 4 nhú đầu.
Xoang miệng nông dạng phễu hoặc dạng cái cốc. Cấu trúc thực quản và van
thực quản điển hình. Vòng thần kinh bao quanh ngay phía trước thực quản
gốc. Gai giao cấu lớn và cong mạnh về phía bụng, gốc gai tròn, thân gai dạng
lưỡi liềm, phía cuối thẳng và có dạng thuỳ chẻ 3, phần sống lưng trước rộng
và cong về phía lưng, kết thúc từ phía sau đến đầu gai.
Thuỳ bên của gai rộng về phía trước và kéo dài đến đầu gai, diềm gai lớn
nhưng không bao phủ đến tận đầu gai. Gai đệm dài bằng 70% chiều dài của

gai giao cấu, có dạng thuyền, phình rộng ở giữa và cong ở phần đầu. Khi quan
sát từ mặt bụng có thể thấy một cấu trúc dạng cái nêm dài, chẽ đôi nhưng
không kéo dài đến thân của gai giao cấu mà được tách biệt ở phần trước. Hệ
thống nhú sinh dục bao gồm: 1 nhú đơn trước huyệt sinh dục và 12 đôi nhú ở
phần đuôi, trong đó có 5 đôi nằm về phía bụng trước hậu môn, 1 đôi bên
ngang mức nhú đơn trước huyệt, 1 đôi nhú bụng gần hậu môn, 3 đôi đuôi phía
bụng bên và 1 đôi đuôi gần lưng. Đuôi hình chóp, tận cùng đuôi có 1 mucro
nhỏ. Plasmid không rõ.

22


Hình 3: Ảnh SEM con đực của Steinernema robustispiculum TN21
A: bề mặt đầu; B: Sắp xếp nhú sinh dục ở vùng đuôi; C: đuôi; D,E: gai đệm;
F: gai giao cấu. (Phan et al, 2004)
Con cái (thế hệ 1): cơ thể lớn và cong về phía bụng, tạo thành hình chữ
C khi xử lý nhiệt.Vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Phần đầu tròn rộng và không tách biệt với phần thân. Đỉnh đầu có 6 nhú
môi nhọn và 4 nhú đầu. Xoang miệng nông dạng phễu hoặc dạng cái cốc.
23


Cấu trúc thực quản và van thực quản điển hình. Nhánh sinh dục kép, gấp
khúc phần sau, bên trong tử cung chứa đầy trứng. Phần sau cơ thể hơi
phình rộng về phía sau hậu môn. Đuôi có cấu trúc vòm, tròn ,rộng. Chiều
dài của đuôi ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu môn. Tận cùng đuôi có một
cấu trúc như cái móc. Plasmid không rõ.

Hình 4: Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21
A-C: con cái thế hệ thứ nhất: A: Bề mặt đỉnh đầu; B:vùng vulval; C: Đuôi. DF: Ấu trùng cảm nhiễm: D: đầu; E: Vỏ cutin và vùng bên ở phần giữa cơ thể;

F. đuôi. (Phan et al, 2004)
24


Ấu trùng xâm nhiễm: cơ thể hơi cong về phía bụng, có dạng chữ C khi xử
lý nhiệt. Các nhú môi trên đỉnh đầu không rõ. Thực quản dài, hẹp với eo thắt
điển hình được bao quanh bởi vòng thần kinh. Phần sau thực quản dạng diều
và có cấu trúc van bên trong. Van thực quản - ruột nổi bật. Vị trí lỗ bài tiết ở
phần giữa thực quản. Túi vi khuẩn hình elip hoặc ô van dài. Vùng bên tại
phần giữa cơ thể gồm 9 rãnh tạo thành 8 gờ, trong đó các rãnh sát mép ngoài
và rãnh trung tâm không rõ bằng các rãnh còn lại. Đuôi hình chóp dài, hơi
thắt đặc biệt về phía bụng. Plasmid rõ và nằm ở phần trước của đuôi. (Phan et
al., 2004).

Hình 5: Mẫu RFLP vùng ITS của loài Steinernema robustispiculum TN21
được cắt với 17 enzym. (Phan et al., 2004)

25