PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ ( CP )CỦA Odontoglossum ringspot virus ( ORSV )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)
CỦA Odontoglossum ringspot virus (ORSV)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ BÍCH THÚY

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 07/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA Odontoglossum ringspot virus (ORSV)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN XUÂN DŨNG

TRẦN THỊ BÍCH THÚY

KS. NGUYỄN THỊ NGỌC THẢO

Tháng 07/2011


LỜI CẢM ƠN
Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ cùng những người thân trong gia đình
luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Thực hiện luận văn tốt nghiệp là cơ hội giúp tôi ôn lại những kiến thức
đã có và học hỏi nhiều điều mới. Trong quá trình thực hiện luận văn tôi đã
được sự giúp đỡ rất nhiều từ Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
ThS. Nguyễn Xuân Dũng và KS. Nguyễn Thị Ngọc Thảo đã giúp đỡ tôi
từ những ngày đầu thực tập đến khi hoàn thành luận văn tại Trung tâm.
Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiêp này.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban
Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Các anh chị làm việc tại phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử và phòng

Công nghệ Sinh học Thực vật đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian qua.
Tập thể lớp DH07SH, đặc biệt là các bạn phòng 17F đã gắn bó, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua.
Xin chân thành cảm ơn!
Trần Thị Bích Thuý

i


TÓM TẮT
Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) là một trong những loại vi rút
gây ra thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế cho người trồng lan.Việc nghiên
cứu tìm ra biện pháp kỹ thuật thích hợp để góp phần làm giảm chi phí phát
hiện vi rút ORSV trên lan là một việc làm cần thiết hiện nay. Đề tài “Phân
lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ (CP) của Odondoglossum ringspot
virus (ORSV)” được thực hiện nhằm tạo ra cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo trong việc kiểm soát vi rút này một cách hiệu quả.
Đề tài được bắt đầu với việc kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của
mẫu lá lan và thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP của vi rút ORSV.
Các mẫu lá có chứa vi rút được sử dụng để ly trích RNA vi rút và khuếch đại
gen mã hóa cho protein vỏ (CP) bằng phương pháp RT-PCR. Đoạn gen CP
sau khi phân lập được chèn vào vectơ pJET 1.2/blunt và sau đó vectơ mang
gen được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp hóa biến
nạp. Tiến hành kiểm tra hiệu quả chèn và biến nạp bằng cách sàng lọc các
dòng vi khuẩn trên môi trường kháng sinh chọn lọc và kiểm tra sự hiện diện
của đoạn gen.
Một số kết quả đạt được trong nghiên cứu này là phân lập được gen CP
của vi rút ORSV, thu nhận được dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α mang
plasmid nhân dòng chứa trình tự gen mã hóa protein vỏ CP của vi rút ORSV
và xác định được trình tự gen CP của vi rút ORSV tại Việt Nam.

ii


SUMMARY
Odontoglossum Ringspot virus (ORSV) is one of the virus that causes
severe damage to economically for orchid growers. Nowaday, researching to
find appropriate technical measures to help reduce the cost of detecting the
virus ORSV is a necessary target. Project "Isolation and cloning the
Odondoglossum CP ringspot virus (ORSV) coat protein (CP) gene" was
done to create the basis for further research to control this virus effectively.
This project has begun with checking the status of the sample was
infected with virus by using RT-PCR method with specific primers, and then
designing primers which amplify the CP gene of the ORSV virus. The CP
gene sequence was amplified by RT-PCR with the designed primers. The
amplified CP gene was inserted into pJet1.2/blunt vector to create the
recombinant vectors. Before, they were transformed into E.coli DH5α.
Finally, isolation of E.coli DH5α containing the recombinant vectors was
performed by using antibiotic selection. The presence of the target gene in
transformed E.coli DH5α was checked by using clony PCR.
Some achievements: we have isolated the ORSV CP gene, have
obtained the DH5α E. coli cells which containing the recombinant vector.
And, we have also analyzed the sequence of this recombinant vector .

iii


iv

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................... i
TÓM TẮT ............................................................................................................................... ii
SUMMARY ........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC............................................................................................................................... v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu............................................................................................................................. 1
1.3. Nội dung thực hiện............................................................................................................ 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 2
2.1. Ảnh hưởng của vi rút đối với cây trồng ............................................................................. 2
2.2. Các loại vi rút gây bệnh cho lan và các triệu chứng của nó ................................................ 2
2.3. Giới thiệu về Odontoglossum ringspot virus...................................................................... 3
2.4. Các phương pháp phát hiện vi rút trên lan ......................................................................... 6
2.4.1. Phương pháp ELISA ...................................................................................................... 6
2.4.2. Phương pháp RT-PCR.................................................................................................... 7
2.5. Sơ lược về phương pháp PCR và kỹ thuật tạo dòng gen..................................................... 8
2.5.1. Phương pháp PCR .......................................................................................................... 8
2.5.2. Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen.................................................................................... 9
2.5.2.1. Những bước căn bản trong việc tạo dòng gen .............................................................. 9
2.5.2.2. Tầm quan trọng của tạo dòng gen ...............................................................................10
2.6. Một số yêu cầu của mồi trong thiết kế mồi .......................................................................10
2.7. Tình hình nghiên cứu về phát hiện Odontoglossum ringspot virus trên lan .......................11
2.7.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................11
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước...................................................................................12
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................14

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.....................................................................................14
3.2. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................................14
v


3.2.1. Mẫu...............................................................................................................................14
3.2.2. Hóa chất........................................................................................................................14
3.2.3. Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ..............................................................................15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................................16
3.3.1. Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan ..................................................16
3.3.2. Thiết kế mồi đặc để khuếch đại gen CP .........................................................................17
3.3.3. Phân lập gen CP ............................................................................................................18
3.3.4. Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng ....................................................................19
3.3.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn và sàng lọc ...................................................19
3.3.6. Kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen nhân dòng ..............................................................20
3.3.6.1. Kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc................................................................20
3.3.6.2. Kiểm tra bằng enzym cắt hạn chế ...............................................................................21
3.3.7. Kiểm tra trình tự gen CP bằng phương pháp giải trình tự...............................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................23
4.1. Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan .....................................................23
4.2. Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP ....................................................................23
4.3 Phân lập gen CP ................................................................................................................23
4.4. Chèn đoạn gen CP vào plasmid nhân dòng và biến nạp plasmid tái tổ hợp .......................24
4.5. Kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen nhân dòng .................................................................26
4.5.1. Kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc...................................................................26
4.5.2. Kiểm tra bằng phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế................................................28
4.6. Giải trình tự plasmid có chứa đoạn gen CP.......................................................................30
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................33
5.1. Kết luận ...........................................................................................................................33
5.2. Đề nghị ............................................................................................................................33

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................34
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp:

Ampicillin

Bp :

Base pair

Cp:

Coat protein

CGMMV:

Cucumber green mottle mosaic virus

CNSH:

Công nghệ Sinh học

cDNA:

Complementary Deoxyribonucleotic Acid

CyMV:

Cymbidium mosaic virus

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA:

Deoxyribonucleotide acid

ELISA:

Enzym-linked immunosorbent assay

LB:

Luria- Bertani

RNA:

Ribonucleic acid

kb:

Kilobase pair

kDa:

Kilo Dalton

MCS:

Multiple cloning site

MP:

Movement protein

NCBI:

National Center for Biotechnology information

ORF:

Open reading Frame

ORSV:

Odontoglossum ringspot virus

PCR:

Polymerase chain reaction

PMMV:

Pepper mild mottle mosaic virus

RdRp:

RNA-Deppendent RNA polymerase

RT-PCR:

Reverse transcription Polymerase Chain Reaction

SHMV:

Sunn - hemp mosaic virus

TAE:

Tris-acetate-EDTA

Taq polymerase:

Thermus aquaticus polymerase

TMV:

Tobacco mosaic virus

TMGMV:

Tobacco mild green mosaic virus

ToMV:

Tomato mosaic virus
vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT–PCR phát hiện vi rút ORSV ...................................17
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP của vi rút ORSV .............18
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cho phản ứng PCR khuẩn lạc .........................................20

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình dạng của ORSV ........................................................................................... 3
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của ORSV .................................................................................. 4
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của ORSV .................................................................................. 5
Hình 2.4 Triệu chứng của ORSV trên lá ............................................................................ 6
Hình 3.1 Thang DNA. .........................................................................................................15
Hình 3.2 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR phát hiện vi rút ORSV. ......................17
Hình 3.3 Quy trình nhiệt cho phản ứng RT–PCR khuếch đại gen CP của ORSV ..........19
Hình 3.4 Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc ...................................................21
Hình 4.1 Kết quả kiểm tra vi rút ORSV bằng RT-PCR. ...................................................23
Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP của ORSV. .................24
Hình 4.3 Vectơ pJET 1.2/blunt. ..........................................................................................25
Hình 4.4 Vùng trình tự MSC của vectơ pJET 1.2/blunt...........................................................25

Hình 4.5 Khuẩn lạc vi khuẩn phát triển sau 16 giờ nuôi cấy ............................................26
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi FOCP và ROCP .........27
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc mồi FpJET và RpJET .....................28

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm plasmid. .....................................................................29
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt ...............................................................................29
Hình 4.10 Kết quả giải trình tự gen CP của ORSV, dòng O4.12 .....................................30
Hình 4.11 Kết quả so sánh trình tự gen CP .......................................................................31
Hình 4.12 Kết quả so sánh với trình tự AB541501.1 ........................................................32

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lan là một trong những cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao nhưng các tác nhân
gây bệnh như côn trùng, nấm, vi khuẩn, vi rút đã làm cho năng suất và chất lượng hoa
lan trong sản xuất giảm mạnh. Trong đó, mức độ tác hại do vi rút gây ra là nghiêm
trọng nhất. Odondoglossum ringspot virus (ORSV) là một trong những loài vi rút gây
bệnh phổ biến nhất trên nhiều giống lan. Bệnh do vi rút ORSV nói riêng và vi rút nói
chung gây ra đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị. Biện pháp chủ yếu để kiểm soát bệnh
do vi rút này vẫn là phòng tránh thông qua việc phát hiện và loại bỏ những cây đã
nhiễm. Việc nghiên cứu tìm ra biện pháp kiểm soát hiệu quả bệnh do vi rút ORSV gây
ra là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay. Hiện tại đã có một số nghiên cứu về
vấn đề phát hiện vi rút ORSV gây hại trên lan ở Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu
chuyên sâu về phân lập, tạo dòng gen của vi rút này để làm cơ sở cho những ứng dụng
tiếp theo vẫn chưa được triển khai. Đề tài “Phân lập và tạo dòng gen mã hóa protein vỏ
(CP) của Odondoglossum ringspot virus (ORSV)” được thực hiện nhằm góp phần giải
quyết vấn đề trên.
1.2. Yêu cầu
-

Phân lập được gen CP của vi rút ORSV.

-

Thu nhận được dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa
trình tự gen CP của vi rút ORSV.

1.3. Nội dung thực hiện
-

Kiểm tra tình trạng nhiễm vi rút ORSV của mẫu lá lan bằng phương pháp RT-PCR.

-

Thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại trình tự gen CP của ORSV.

-

Phân lập gen CP của ORSV bằng phương pháp RT-PCR.

-

Chèn gen CP vào plasmid nhân dòng pJET và hóa biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi

khuẩn E.coli DH5α.
-

Kiểm tra hiệu quả chèn và biến nạp bằng cách sàng lọc trên môi trường kháng

sinh chọn lọc và kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen CP.
-

Giải trình tự gen CP đã được tạo dòng.

1


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Ảnh hưởng của vi rút đối với cây trồng
Vi rút tạo ra rất nhiều điều bất thường có thể làm thay đổi hình thức và dáng vẻ
từ chóp rễ đến đỉnh ngọn. Hai ảnh hưởng dễ thấy nhất là sự chuyển sang màu vàng và
sự chết mô. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt hoặc cùng một lúc. Các vi rút
chỉ gây bệnh cho một số loại cây ở điểm bị thủng, nơi nó tấn công các tế bào ở gần vết
thương. Vi rút tấn công bệnh trong một cây chủ thường tồn tại ở đó suốt cuộc đời của
cây. Ở những cây sinh sản theo cách dinh dưỡng, sự tồn tại dai dẳng đem tới việc các
đoạn cắt bị lây lan hoặc những phần tách chiết có mang vi rút.
Các triệu chứng về vi rút biến thiên nhiều và không những tùy thuộc vào loại cây
chủ mà còn tùy thuộc vào nòi vi rút và điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ và
dinh dưỡng. Thời gian giữa sự nhiễm bệnh và sự phát hiện triệu chứng cũng tùy thuộc
nòi vi rút và điều kiện môi trường.
2.2. Các loại vi rút gây bệnh cho lan và các triệu chứng của nó
Hơn 25 loại vi rút được biết đã nhiễm vào lan (Moran J., Knoxfield). Có 2 loài vi
rút thông thường nhất nhiễm vào cây lan là Cymbidium mosaic virus (CymMV)
và Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Nhiều giống vi rút không những làm đổi
màu trong mô cây chủ mà còn hạn chế sự phát triển của cây và làm cho cây cằn cỗi
mất sinh lực. Hầu hết các loại vi rút không thể sống sót trong một thời gian dài bên
ngoài tế bào thực vật sống. Đó là nguyên nhân tại sao vi rút hiếm nếu chúng ta tiêu
huỷ cây bị nhiễm. Hầu hết các triệu chứng do vi rút gây ra đều giảm năng suất và chất
lượng hoa của cây lan.
Một vài loại cây trồng như khoai tây, rau diếp hay hoa cúc, sản lượng giảm có
thể thấy chỉ trong một vụ. Và thông thường thì sự giảm sản lượng này đủ để chứng
minh được có sự hiện diện của vi rút. Tuy nhiên, lan là loài phát triển chậm, nên khó

có thể xác định được sự có mặt của vi rút chỉ trong một mùa vụ. Hơn nữa, sản lượng
cao hay thấp dựa vào chất lượng hoa, và khả năng ra hoa (một sự đo lường chủ quan)
hơn là số lượng. Triệu chứng gây ra bởi vi rút thì rất nhiều. Chúng có thể không biểu
hiện, mặc dù tồn tại trong cây, và gây ra các triệu chứng không nhìn thấy được, hoặc
những triệu chứng này có thể biểu hiện rất ít, không rõ, và có khi bị hoại tử. Vì tính đa
2


dạng của các loài lan, nên các triệu chứng này cũng rất khác nhau, thậm chí khác nhau
trên từng cây. Như vậy, rất khó có thể dự đoán chính xác vi rút có nhiễm và biểu hiện
trên cây hay không. Các triệu chứng bệnh gây ra bởi bệnh vi rút có thể tương tự với
các triệu chứng bệnh do các tác nhân khác và các triệu chứng rối loạn sinh lý khác như
bệnh úa vàng, bệnh đốm hay vệt hoại tử. Bệnh nấm và vi khuẩn, các vấn đề sinh lý
như cường độ ánh sáng, chế độ phân bón và chế độ nước cũng gây nên các triệu chứng
tương tự. Với kinh nghiệm trồng trọt có thể phân biệt được các dấu hiệu đó với các
triệu chứng được gây ra từ vi rút, tuy nhiên, vẫn có thể nhầm lẫn. Các nhà nghiên cứu
vẫn chưa tìm ra nguyên nhân tại sao một vài loài biểu hiện những triệu chứng nghiêm
trọng, trong khi một vài loài khác bị nhiễm vẫn khỏe mạnh. Điều này cho thấy sự cần
thiết để thiết lập nên một quy trình chuẩn đoán bệnh vi rút chính xác hơn để bảo đảm
được bộ sưu tập lan sạch bệnh vi rút (Phan Chỉnh Nguyên, 2009).
2.3. Giới thiệu về Odontoglossum ringspot virus
Odontoglossum ringspot virus (ORSV) là một thành viên của nhóm tobamo virus
(TOV). Cùng với CyMV, ORSV cũng là một trong những vi rút gây hại nghiêm trọng
và phổ biến nhất trên hoa lan (Zetter và cs, 1990). Phần tử vi rút có dạng hình que, dài
290-300 nm (Navalinskiene và cs 2005)

Hình 2.1 Hình dạng của ORSV (Navalinskiene và cs, 2005).
Cấu trúc bộ gen của ORSV tương tự với các vi rút khác thuộc nhóm potex virus với
vùng 5’ và 3’ không mã hóa đặc trưng và ít nhất 4 khung đọc mở (ORFs).ORSV có RNA
bộ gen sợi dương, bao gồm 6618 nucleotide, chứa 5 khung đọc mở (ORFs 1-5), mã hóa

cho các loại protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 126 KDa, 181 KDa, 34 KDa,
3


18 KDa và 52 KDa (Ryu và Park, 1995b). Tuy nhiên, theo Cheng và cs (1996) thì cấu
trúc bộ gen của ORSV bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-deppendent RNA polymerase –
RNA polymerase phụ thuộc RNA), MP (movement protein – protein vận động) và CP
(coat protein - protein vỏ) (Hình 2.2). Bộ gen RNA gồm 6609 nucleotide, có 4 khung
đọc mở (ORFs 1-4), mã hóa cho 3 loại protein khác nhau: RdRp (126 kDa/183 kDa),
MP (33 KDa) và CP (18 KDa). Đây là một trong những vi rút có RNA dài nhất trong
số các vi rút được biết của nhóm tobamo virus. Trình tự của các protein được mã hóa
bởi RNA của ORSV biểu hiện sự tương đồng cao với các protein của các thành viên
khác trong nhóm tobamo virus. Phân tích trình tự và cấu trúc bộ gen cho thấy ORSV
có mối liên hệ gần với các loại vi rút như TMGMV (tobacco mild green mosaic virus
– vi rút khảm xanh thuốc lá), PMMV (pepper mild mottle mosaic virus – vi rút khảm
đốm tiêu), ToMV (tomato mosaic virus - vi rút khảm cà chua) và TMV hơn các loại vi
rút như CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus – vi rút khảm đốm xanh dưa
chuột) và SHMV (sunn - hemp mosaic virus – vi rút khảm cây lục lạc) (Ryu và Park,
1995)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của ORSV (Cheng và cs, 1996)

4


Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của ORSV (Ajjikuttira và cs, 2003)
ORSV được biết đến trước tiên với việc gây ra các đốm vòng vàng trên lá lan
Odontoglossum grande Lindl. Tuy nhiên, nó được biết phổ biến hơn với triệu chứng
vàng lá dạng hình thoi đặc trưng trên lá lan Cymbidium. Các đốm hình thoi này cũng
đi kèm với các vệt vàng ở Cymbidium (Moran và Knoxfield, 1999). Trên hoa, ORSV

tạo ra sự khảm màu (đậm hay nhạt hơn màu hoa) (Marais, 2000; McMillian và cs
2005). Các vệt màu đen thường được nhận thấy trong phần lớn các cây lan có hoa từ
màu hồng đến xanh nhạt pha đỏ (lavender). Tuy nhiên, không nên nhầm lẫn sự khảm
màu với các vệt màu trắng trên các cây Cattleya có hoa màu xanh nhạt pha đỏ do biến
dị di truyền gây ra. Sự khảm màu trên hoa lan, trước đây được cho là chỉ xảy ra ở
Cattleya, đã được thông báo hiện diện ở các giống lan như Odontoglossum,
Cymbidium, Vanilla, Epidendrum, Encyclia, Oncidium, Phalaenopsis và nhiều giống
lan khác. Ở cùng một thời điểm, sự khảm màu hoa được cho là gây ra bởi 2 chủng vi
rút riêng biệt đó là chủng nhẹ và nặng. Triệu chứng khảm màu nhẹ (chủng nhẹ) phổ
biến ở Cattleya hơn triệu chứng khảm màu nặng (chủng nặng). Các cây bị nhiễm
chủng nhẹ có ít đốm trên hoa hơn các cây bị nhiễm chủng nặng, hoa không bị biến
dạng và lá chỉ có triệu chứng khảm nhẹ. Sự khảm màu nặng được thể hiện đặc trưng
bởi nhiều đốm màu khác nhau trên hoa, ở đó màu sắc bình thường của đài và cánh hoa
được thay bởi các mảng mô không đều có màu đậm hay nhạt hơn màu hoa bình

5


thường. Không có sự biến dạng hay méo mó hoa ở trường hợp chủng nhẹ. ORSV cũng
gây ra vệt hoại tử nâu trên hoa Cattleya (McMillian và cs 2005).

Hình 2.4 Triệu chứng của ORSV trên lá lan (Ảnh: PocketdiagnosticTM).
Nói chung, vi rút gây ra một loạt các sự biến đổi bất thường trên lan, với các triệu
chứng thay đổi rất lớn trong các giống lan khác nhau bị nhiễm cùng một loại vi rút.
Các triệu chứng nổi bật nhất là vàng lá (mất diệp lục) và chết mô (hoại tử) cũng như sự
cằn cỗi cây. Các triệu chứng này có thể xảy ra riêng biệt, kết hợp với nhau hoặc hoàn
toàn không biểu hiện do điều kiện nuôi trồng tốt ngăn cản sự phát triển của triệu
chứng. Các cây ở trong điều kiện stress thường có xu hướng biểu hiện triệu chứng
nghiêm trọng khi bị nhiễm vi rút (Marais, 2002).
Sự thay đổi của các triệu chứng vi rút phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng vi

rút, loài thực vật bị nhiễm và các điều kiện môi trường như cường độ sáng, nhiệt độ,
dinh dưỡng và sự ngộ độc Ure (biểu hiện triệu chứng giống với nhiễm Cymbidium
mosaic virus trên lá Cymbidium) (Marais, 2002). Sự mất cân bằng dinh dưỡng, ngộ
độc muối, cường độ sáng cao, côn trùng, bệnh do nấm hay sự rối loạn di truyền có thể
gây ra các triệu chứng tương tự như bệnh vi rút (Flynn, 1996).
2.4. Các phương pháp phát hiện vi rút trên lan
Có nhiều phương pháp khác nhau có thể được dùng cho việc phát hiện vi rút trên lan.
Tuy nhiên, 2 phương pháp thường được sử dụng phổ biến đó là ELISA và RT-PCR.
2.4.1. Phương pháp ELISA
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym. Khi có sự hiện diện của cơ chất
(thường là nitrophenol photphat) trong phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một
6


chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên
đã xảy ra. Nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hiện có 2 kỹ thuật ELISA
được xác định dựa vào cường độ màu sử dụng phổ biến là ELISA trực tiếp (direct Double
Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) (Vũ Triệu Mân, 2003).
Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến cho việc phát hiện vi rút trên lan. Một số
công trình tiêu biểu của các tác giả trên thế giới liên quan đến ELISA đã được công bố
như: Hu và cs, 1993; Wong và cs, 1994; Khentry và cs, 2006.
2.4.2. Phương pháp RT-PCR
RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch đại
các phân tử RNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử dụng kỹ
thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). Trước hết, RNA được chuyển
thành cDNA (Complementả Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzym phiên mã ngược từ Mo
- MLV (Murine leukemia virus) hoặc AMV (Avian myeloblastosis virus). Mồi sử dụng
trong giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau (Antisense mồi), có thể là
Oligonucleotid dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể là

các hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên
RNA. Sau đó, cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Sự hiện diện của sản phẩm
được nhận biết qua điện di trên gel agarose. Người ta cũng có thể sử dụng Tth DNA
polymerase cho cả 2 giai đoạn. Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại
với hàm lượng thấp, hoặc RNA của vi rút, không thể phát hiện bằng các phương pháp
khác như Northern blot. Ngoài ra, với kỹ thuật in - situ RT-PCR người ta có thể thực hiện
việc khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên,
được tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo
nhiệt chuyên cho lame (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Ngoài ra, một ứng dụng khác của RT-PCR nhằm cho phép định lượng chính xác số
bản sao vi rút có trong mẫu phát hiện Real-time RT-PCR. Phương pháp này dựa trên
nguyên tắc sự bắt cặp và phát sáng của chất phát huỳnh quang (thường là SYBR Green)
với DNA mạch đôi được tạo ra trong phản ứng khuếch đại. Sự xuất hiện của sản phẩm
khuếch đại sẽ được thể hiện thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra. Dựa vào tín hiệu này,
người ta có thể nhận biết có hay không sự xuất hiện của sản phẩm. Việc định lượng vi rút
sẽ được thực hiện thông qua một đường chuẩn (được thiết lập dựa trên mối quan hệ tuyến
tính giữa số chu kỳ ngưỡng và độ pha loãng của mẫu có số bản sao vi rút cho trước theo hệ
7


số bậc 10). Độ đặc hiệu của sản phẩm tạo thành được phân tích qua quá trình melt - curve
(gia nhiệt). Quá trình gia nhiệt làm 2 mạch của DNA mạch đôi (sản phẩm khuếch đại) tách
ra. Khi DNA tách mạch hoàn toàn, tín hiệu huỳnh quang tương ứng cũng sẽ giảm đến mức
tối thiểu (do chất phát huỳnh quang không bắt cặp với DNA mạch đơn). Mỗi đoạn DNA sẽ
có một nhiệt độ tách mạch khác nhau mà ở đó tín hiệu huỳnh quang sẽ giảm xuống. Điều
này cho phép phân biệt giữa các sản phẩm khác nhau được tạo ra trong phản ứng Realtime (Phạm Hùng Vân, 2009); đã có nhiều nghiên cứu sử dụng RT-PCR và RT-Real-time
PCR để phát hiện 2 loại vi rút CyMV và ORSV trên lan được công bố ở nhiều nơi trên thế
giới như Lim và cs, 1993; Ryu và Park, 1995a; Ryu và cs, 1995; Seoh và cs, 1998; Liu và
cs, 2009.
2.5. Sơ lược về phương pháp PCR và kỹ thuật tạo dòng gen

2.5.1. Phương pháp PCR
Kỹ thuật khuếch đại DNA đặc hiệu, còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ
thuật PCR (polymerase chain reaction) được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những
năm 80 và đã mang lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử (Lê Đình
Lương, 2001); Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. DNA
polymerase dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung
với nó. Các sợi DNA khuôn mạch đơn này có thể được tạo ra theo cách đơn giản là đun
nóng dung dịch DNA mạch kép tới gần nhiệt độ sôi. DNA polymerase cũng đòi hỏi phải
có một đoạn ngắn DNA mạch kép (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Vì vậy, để
khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 –
30 nucleotid), đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép. Đó là đặc
điểm quan trọng đầu tiên của kỹ thuật PCR vì DNA polymerase được điều khiển để tổng
hợp một đoạn DNA đặc thù. Cả hai sợi DNA đều được dùng để làm khuôn cho quá trình
tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật
PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn DNA được nhân lên, sao cho các
đoạn DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi còn
lại. Như vậy, kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý
thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc
điểm quan trọng thứ hai trong kỹ thuật PCR (Lê Đình Lương, 2001).

8


Các bước tiến hành phản ứng PCR: bước đầu tiên của quá trình là làm nóng hỗn
hợp phản ứng đến khoảng 94oC. Tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép tách
nhau ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và DNA
polymerase; sau đó nhiệt độ được hạ xuống khoảng 30 - 65oC để các đoạn mồi gắn với
các trình tự tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn; tiếp theo nhiệt độ được nâng
lên 72oC, nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase bền nhiệt hoạt động. Nhiệt độ
được duy trì ở 72oC trong khoảng 5 phút để DNA được tổng hợp; vào cuối giai đoạn

này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94oC, nhưng lần này chỉ trong vòng 20 giây
để cho các mẫu ngắn của DNA mạch kép tách nhau ra, Các sợi đơn này trở thành
khuôn cho một chu kỳ tổng hợp DNA khác. Như vậy, một chu kỳ gồm: đun nóng để
tách các sợi DNA kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi
khuôn và tổng hợp DNA bằng DNA polymerase, được lặp lại từ 30 - 60 lần (Lê Đình
Lương, 2001).
2.5.2. Sơ lược về kỹ thuật tạo dòng gen
Kỹ thuật tạo dòng là kỹ thuật chuyển một đoạn gen vào vectơ và nhân lên thành
dòng gồm vô số bản sao giống nhau. Đoạn gen tạo dòng được gọi là đoạn DNA mục
tiêu được chèn vào vectơ khi đó vectơ này trở thành vectơ tái tổ hợp. Vectơ tái tổ hợp
này sẽ được chuyển vào tế bào chủ và tồn tại trong tế bào chủ với lượng xác định. Khi
tế bào chủ phân chia, vectơ tái tổ hợp sẽ phân chia và tiếp tục nhân lên theo quá trình
phân chia của tế bào chủ. Các khuẩn lạc sau khi sàng lọc trên môi trường có kháng
sinh sẽ được đánh giá là các dòng có mang đoạn gen được tạo dòng (Brown, 1997).
2.5.2.1. Những bước căn bản trong việc tạo dòng gen
Việc tạo dòng gen gồm các bước căn bản sau: Một đoạn DNA (gen cần tạo dòng)
được chèn vào DNA mạch vòng (gọi là vectơ) để tạo thể khảm hoặc phân tử DNA tái tổ
hợp; tế bào giống y hệt nhau được tạo thành. Mỗi tế bào trong dòng vô tính chứa một
hoặc nhiều bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp. Điều này có nghĩa là gen được mang bởi
phân tử DNA tái tổ hợp cũng được Vectơ này hoạt động như một vật mang chuyển gen
vào tế bào chủ (thường là vi khuẩn); trong tế bào chủ, những vectơ này tự sao chép để
tạo số lượng lớn các bản sao chứa DNA của vectơ và gen nó mang; khi tế bào chủ phân
chia, những bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp cũng được phân chia cho thế hệ tế bào
sau và quá trình tạo bản sao sẽ tiếp tục diễn ra; khi có một lượng lớn tế bào phân chia,
một khuẩn lạc hay gọi là một dòng vô tính của những tạo dòng (Brown, 1997).
9


2.5.2.2. Tầm quan trọng của tạo dòng gen
Một gen được tạo dòng cung cấp cho ta đầy đủ thông tin về cấu trúc phân tử

cũng như sự biểu hiện của gen đó. Tính hữu dụng của những vật liệu được tạo dòng
thúc đẩy các phương pháp phân tích phát triển phục vụ cho nghiên cứu gen với nhiều
kỹ thuật mới được đưa vào sử dụng trong suốt thời gian qua. Các nghiên cứu trong
ngành dược và ngành nông nghiệp cũng nhận được những bước tiến quan trọng từ kỹ
thuật tạo dòng gen. Một vài loại vacxin mới cung cấp khả năng kháng nhiều bệnh mà
việc tiêm chủng trước đây không ngăn ngừa được. Ngày nay, những bệnh di truyền có
thể chẩn đoán trước khi đứa bé ra đời. Các nghiên cứu gần đây mở ra tia hy vọng có
thể chữa trị sớm chứng xơ nang, ung thư vú, hở van tim. Đối với nông nghiệp, tạo
dòng gen cũng cung cấp tâm quan trọng không kém là phát triển những cây trồng biến
đổi di truyền nhằm chống lại sự phá hoại của sâu bệnh, cải thiện chất lượng cây trồng,
tạo cây chịu hạn, chịu mặn; tạo protein tái tổ hợp trong cây (Brown, 1997).
2.6. Một số yêu cầu của mồi trong khuếch đại gen
Mỗi mồi chỉ bắt cặp với một trình tự trên sợi DNA đích và không bắt cặp trên các
trình tự DNA khác.Chiều dài của mồi ảnh hưởng tới tính duy nhất và nhiệt độ nóng
chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó. Nói cách khác, mồi càng dài thì tính duy nhất
và nhiệt độ nóng chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó càng cao. Chiều dài của mồi
không được thấp hơn 14 nucleotid để đảm bảo tính duy nhất của mồi thích hợp. Chiều
dài mồi phù hợp là từ 18 - 28 nucleotid; thành phần nucleotide ảnh hưởng đến tính đặc
hiệu của quá trình bắt cặp, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp và sự ổn định cấu trúc
phân tử của mồi. Các trình tự được sắp xếp ngẫu nhiên sẽ tốt hơn trình tự chứa những
vùng giàu (A + T) hoặc (G + C), để đảm bảo cho việc bắt cặp đặc hiệu. Tỷ lệ (G + C)
trung bình là 50 - 60% sẽ cho nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho
phản ứng PCR thông thường. (Có thể được phép thay đổi trong một số trường hợp).
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nữa sợi DNA là sợi đơn và
một nửa còn lại là sợi đôi. Tm tùy thuộc vào thành phần nucleotid. Tỷ lệ (G + C) cao sẽ
dẫn đến nhiệt độ nóng chảy cao.
-

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy:
Tm = [59.9 + 0.41 * (%GC) - 600]/chiều dài (Với những mồi ≤ 20 nucleotid, thì

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)).

10


Nhiệt độ bắt cặp (Ta) là nhiệt độ mà tại đó mồi bắt cặp với DNA mục tiêu. Có thể
tính toán theo Tm. Công thức tính: Ta = Tm-mồi – 4oC. Để đảm bảo mồi bắt cặp vào
DNA mạch khuôn trước khi hai sợi của DNA đích hồi tính, cần đảm bảo yêu cầu:
Tm-sản phẩm – Ta ≥ 30oC; Ta là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tính nghiêm ngặt
của sự bắt cặp hoặc tính đặc hiệu của quá trình khuếch đại đoạn DNA (Ta quá thấp →
tính nghiêm ngặt thấp → có sản phẩm phụ → không đặc hiệu; T a quá cao → tính
nghiêm ngặt cao → mồi có thể không bắt cặp được → không có sản phẩm khuếch
đại). Vì luôn có một cặp mồi, mồi xuôi và mồi ngược trong một phản ứng PCR, nên điều
kiện phản ứng cần phải đảm bảo thích hợp cho cả hai, một đặc tính quan trọng là nhiệt độ
bắt cặp của chúng. Nên có sự tương ứng giữa hai mồi về Ta. Khác biệt giữa chúng tối đa
là 3 - 5oC (Ta càng gần thì kết quả PCR càng tốt); Nếu mồi có thể tạo thành cấu trúc bậc
hai (cấu trúc kẹp tóc), tự bắt cặp, hoặc bắt cặp chéo thì hiệu suất của phản ứng PCR sẽ
bị giảm rõ rệt (trong một số trường hợp những cấu trúc thứ cấp này không ảnh hưởng
đến kết quả của phản ứng PCR khi nhiệt độ bắt cặp không cho phép hình thành cấu
trúc thứ cấp) (Nguyễn Quốc Bình, 2009).
Mồi với đầu 5’ ổn định sẽ cho kết quả khuếch đại tốt nhất: giảm thiểu sự bắt cặp
sai trên các đoạn đích chưa được biết đến; tính ổn định thấp của đầu 3’ ngăn chặn sự
hình thành sợi đôi → khởi đầu sự tổng hợp DNA. Trong khi đó, đầu 5’ phải có khả
năng hình thành sợi đôi bền vững (Nguyễn Quốc Bình, 2009).
2.7. Tình hình nghiên cứu về phát hiện Odontoglossum ringspot virus trên lan
trong và ngoài nước
2.7.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Hu và cộng sự (1993), đã sử dụng ELISA phát hiện vi rút trên 44 giống lan ở
Hawaii. Kết quả cho thấy có 61% mẫu nhiễm CyMV, 25% mẫu nhiễm ORSV và 20%
mẫu nhiễm cùng lúc 2 loại CyMV và ORSV; năm 1994, Wong và cộng sự đã sử dụng

ELISA gián tiếp phát hiện 2 loại vi rút CyMV và ORSV trên các giống lan trồng ở
Singapore. Kết quả cho thấy có 54% mẫu nhiễm CyMV, 4% mẫu nhiễm ORSV và
14,2% mẫu nhiễm cùng lúc 2 loại CyMV và ORSV trong số 12 giống lan được kiểm
tra; năm 1995, Ryu và cộng sự sử dụng RT-PCR phát hiện CyMV với ngưỡng phát
hiện thấp nhất đạt được ở nồng độ 10 fg RNA vi rút. Ryu và Park cũng sử dụng RTPCR phát hiện ORSV với ngưỡng phát hiện đạt được ở mức tương tự như trường hợp
CyMV (10 fg RNA); năm 1997 Hu và cộng sự, đã sử dụng các mẫu dò cDNA đánh
11


dấu DIG (được tổng hợp từ cDNA vi rút) để phát hiện CyMV và ORSV. Kết quả cho
thấy có thể phát hiện RNA tinh sạch của CyMV và ORSV lần lượt ở mức 50 pg và 250
pg. Cũng trong năm 1997, Tanaka và cộng sự, sử dụng hệ thống RIPA (immunofilter
Paper Assay), một dạng giấy thử phát hiện nhanh được thiết lập dựa trên phản ứng
ELISA, để phát hiện vi rút trên các giống lan trồng ở Thái Lan. Kết quả cho thấy có 17
giống nhiễm CyMV và 4 giống nhiễm ORSV trong tổng số 24 giống được kiểm tra.
Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy CyMV là vi rút phổ biến hơn ORSV.
Năm 1998 Seoh và cộng sự, sử dụng RT-PCR phát hiện đồng thời 2 loại vi rút
CyMV và ORSV nhưng chỉ sử dụng duy nhất 1 cặp mồi. Đây là kết quả đầu tiên về
việc sử dụng 1 cặp mồi chung để phát hiện đồng thời hai 2 vi rút thuộc 2 nhóm phân
loại khác nhau; Liu và cộng sự (2009), sử dụng Real-time RT-PCR phát hiện và định
lượng CyMV và ORSV. Kết quả cho thấy phương pháp này có thể xác định được hàm
lượng vi rút có trong mẫu và ngưỡng phát hiện tối thiểu đạt được ở mức 2 bản sao/l
mẫu RNA vi rút.
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 1999, Lê Thị Ánh Hồng và cộng sự, sử dụng phương pháp DAS-ELISA
nghiên cứu tình hình nhiễm CyMV và ORSV trên các vùng trồng lan ở Việt Nam và
mối liên hệ giữa triệu chứng biểu hiện và khả năng nhiễm vi rút. Kết quả cho thấy tất
cả các giống lan được kiểm tra đều nhiễm 2 loại vi rút CyMV và ORSV, đặc biệt tỷ lệ
bệnh khá cao tại các vùng có tiềm năng sản xuất hoa lan như Thành phố Hồ Chí Minh,
Đà Lạt. Trong các triệu chứng được kiểm tra, triệu chứng cây sinh trưởng kém, khó ra

hoa cho tỷ lệ nhiễm vi rút cao nhất. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành cải
tiến độ nhạy cho phản ứng ELISA bằng việc gắn thêm hệ thống Avidine-Biotine, kết
quả đã làm tăng độ nhạy của phản ứng lên từ 5-75 lần tùy theo từng trường hợp cụ thể.
Năm 2007, Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự, sử dụng Real-time RT-PCR để phát
hiện vi rút trên lan. Kết quả của nhóm này cho thấy các mẫu lan trưởng thành trồng tại
các vườn sản xuất có tỉ lệ nhiễm cao với 2 loại vi rút CyMV (100%) và ORSV (43%);
và toàn bộ các mẫu lan cấy mô (100%) đều nhiễm với 2 loại vi rút CyMV và ORSV
trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, mặc dù sử dụng Real-time RT-PCR nhưng kết quả
nghiên cứu của nhóm này chỉ dừng lại ở mức định tính, chưa xây dựng được quy trình
định lượng vi rút; ngoài ra nhóm tác giả còn sử dụng CTAB, một phương pháp ly trích
12


phức tạp nhưng không phù hợp cho ly trích RNA, để ly trích RNA vi rút. Có
thể nói đây là một trong những hạn chế của nghiên cứu này.
Năm 2009, trong một đề tài nghiên cứu cấp Trung tâm tại Trung tâm
Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự
đã sử dụng RT-PCR và Real-time RT-PCR để phát hiện vi rút trên lan. Một
trong những điểm nổi trội của nghiên cứu này là sử dụng phương pháp ly
trích vi rút sucrose (Berendzen và cs, 2005) đơn giản cùng với quy trình RTPCR một bước đã giảm đáng kể về thời gian và chi phí. Kết quả nghiên cứu
của nhóm cho thấy cả 3 giống lan được kiểm tra (Dendrobium, Mokara và
Cymbidium) đều bị nhiễm vi rút với một tỉ lệ nhất định. Dendrobium là giống
có tỉ lệ nhiễm vi rút cao nhất trong 3 giống. Vi rút CyMV gây nhiễm trên cả 3
giống, trong khi vi rút ORSV chỉ nhiễm trên 2 giống Cymbidium và Mokara.
Trường hợp cá biệt, trên 2 giống Cymbidium và Mokara, cả 2 loại vi rút cùng
nhiễm trên một cây. Kết quả cũng cho thấy CyMV là vi rút gây hại phổ biến
hơn ORSV. Nhóm cũng đã xây dựng thành công quy trình phát hiện định
lượng 2 loại vi rút này với ngưỡng phát hiện tối thiểu từ 1-10 bản sao/l. Kết
quả phát hiện định lượng bằng Real-time RT-PCR cho thấy số lượng vi rút
khoảng từ 10 1 – 10 4 bản sao/μl cho Mokara, và từ 10 4 – 10 6 bản sao/μl cho

Cymbidium.

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ ngày 1/12/2010 - 20/07/2011.
-

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử - Trung Tâm Công

nghệ Sinh học – Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Mẫu
Mẫu lá lan Cymbidium nhiễm vi rút ORSV được cung cấp bởi nhóm Sinh học
Phân tử Cây trồng, phòng Công nghệ Sinh học Thực vật - Trung Tâm Công nghệ Sinh
học - Tp. Hồ Chí Minh.
3.2.2. Hóa chất
- Vectơ pJET1.2/blunt
- Mồi FpJET1.2 : 5’CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC - 3’
- Mồi RpJET1.2: 5’AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG - 3’
- Mồi để phát hiện vi rút ORSV:
Mồi xuôi: 5’- CATTAACGATTTGGCTCAGAGACG - 3’, vị trí khuếch đại từ
nucleotid 66 – 89.
Mồi ngược 5’- TTCTCTCGAGCCTAGCCAGATAAG - 3’, vị trí khuếch đại từ
nucleotid 440 - 483.
- Môi trường LB ( Luria - Bertain)
-Thành phần PCR: MgSO4, Pfu DNA polymerase, dNTP, MgCl2, DNA pfu buffer (Fermentas)

- Kit tách plasmid (Qiagen).
- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR (INtRON)
- Bộ kít tách chiết từ gel (INtRON)
- Bộ kít tách chiết Plasmid từ tế bào (INtRON)
- Enzym EcoRI (Biolab)
- Enzym BamHI (Biolab)
- Enzym Hind III (Biolab)
- T4 DNA ligase (Biolab)
14