ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ BACILLUS TRONG QUY TRÌNH VỆ SINH SẢN XUẤT THUỐC THÚ Y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
VÀ BACILLUS TRONG QUY TRÌNH VỆ SINH SẢN XUẤT
THUỐC THÚ Y

Sinh viên thực hiện

: DƯƠNG NGỌC HÂN

Lớp

: DH06DY

Ngành

: Thú y chuyên ngành dược

Niên khóa

: 2006 - 2011

Tháng 8/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

DƯƠNG NGỌC HÂN

ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
VÀ BACILLUS TRONG QUY TRÌNH VỆ SINH SẢN XUẤT
THUỐC THÚ Y

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn
TS. TRẦN THỊ QUỲNH LAN

THÁNG 8/2011

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Dương Ngọc Hân
Tên luận văn: “Đánh giá sự hiện diện của vi sinh vật hiếu khí và Bacillus trong
quy trình vệ sinh sản xuất thuốc thú y”. Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của
giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng chấm thi tốt
nghiệp Khoa ngày…/…/2011.
Giáo viên hướng dẫn

TS. Trần Thị Quỳnh Lan

ii

LỜI CẢM TẠ
Với những tình cảm sâu sắc nhất
Con xin chân thành biết ơn ba mẹ, người đã sinh thành và hi sinh cả cuộc đời
mình vì tương lai của con.
Xin tỏ lòng biết ơn đến
TS. Trần Thị Quỳnh Lan đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện đề tài.
Thành kính tri ân
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi – Thú Y.
Bộ môn Nội Dược, cùng toàn thể Thầy Cô đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn
em trong suốt quá trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn
Ban Giám Đốc công ty TNHH Virbac Việt Nam.
Th.s Đặng Ngọc Bích Thảo.
Cùng toàn thể các cô chú, anh chị tại công ty đã tận tình giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập.
Cảm ơn
Các bạn lớp DY32 và những người bạn khác đã đồng hành và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Dương Ngọc Hân

iii


TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Đề tài nghiên cứu “Đánh giá sự hiện diện của vi sinh vật hiếu khí và Bacillus
trong quy trình vệ sinh sản xuất thuốc thú y” được tiến hành tại công ty TNHH

Virbac Việt Nam, thời gian từ 01/01/2011 đến 06/06/2011.
Đề tài khảo sát 2 chỉ tiêu về tổng vi sinh vật hiếu khí và Bacillus spp trên 2 đối
tượng: đối tượng tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm (máy trộn, bồn chứa), đối tượng
tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm (tường, cửa, bàn, cân,…) đồng thời khảo sát sự tồn
dư thuốc sát trùng sau khi vệ sinh sát trùng. Kết quả đạt được:
-

Đối với chỉ tiêu Bacillus spp
• Trong quy trình sản xuất thuốc bột, khảo sát trên bề mặt tiếp xúc trực tiếp
với sản phẩm được sát trùng ở hai nồng độ (0,5% và 1%) thuốc sát trùng. Qua
năm đợt khảo sát, tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn thay đổi từ 33,33% - 71,34%.
Khảo sát bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm có 51,28% mẫu đạt tiêu chuẩn.
• Trong quy trình sản xuất thuốc nước, khảo sát trên bề mặt tiếp xúc trực tiếp
với sản phẩm. Qua hai đợt khảo sát, số mẫu đạt tiêu chuẩn thay đổi từ 66,67% 83,33%.
Khảo sát trên bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm, số mẫu đạt tiêu chuẩn là

80,95%.
-

Đối với chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí
• Trong quy trình sản xuất thuốc bột, qua năm đợt khảo sát sử dụng với hai
nồng độ ( 0,5% và 1%) thuốc sát trùng. Tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn qua các đợt
thay đổi từ 28,57% - 71,43%.
• Trong quy trình sản xuất thuốc nước, qua hai đợt khảo sát tỷ lệ mẫu đạt tiêu
chuẩn thay đổi từ 83,33% - 91,67%.

-

Tồn dư thuốc sát trùng
Khảo sát thực hiện qua năm đợt, kết quả cho thấy 100% mẫu đều đạt tiêu

chuẩn. Quy trình vệ sinh sát trùng không để lại tồn dư hóa chất trên bề mặt
trang thiết bị tiếp xúc với sản phẩm.

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ......................................................................................................................i
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN ........................................................................................ iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ..................................................................................... xi
Chương 1MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Mục đích và yêu cầu .............................................................................................1
1.2.1 Mục đích.............................................................................................................1
1.2.2 Yêu cầu...............................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN ..........................................................................................3
2.1 Giới thiệu về nhà máy sản xuất thuốc thú y Virbac Việt Nam .............................3
2.1.1 Các dây chuyền sản xuất tại Nhà máy Virbac Việt Nam ...................................3
2.1.2 Thị trường các sản phẩm của Virbac Việt Nam .................................................4
2.2 Vi khuẩn lây nhiễm trong môi trường sản xuất ....................................................5
2.2.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TSVSVHK) .........................................................5
2.2.2 Một số vi sinh vật hiếu khí thường gặp..............................................................5
2.2.2.1 Escherichia coli ...............................................................................................5
2.2.2.2 Salmonella .......................................................................................................7

2.2.2.3 Staphylococcus aureus ....................................................................................8
2.2.3 Bacillus subtilis ................................................................................................11
2.2.3.1 Đặc điểm phân loại........................................................................................11
2.2.3.2 Đặc điểm hình thái ........................................................................................11
2.2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy .........................................................................................11
2.2.3.4 Khả năng tạo bào tử ......................................................................................12
2.2.3.5 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp: ......................................12
2.2.3.6 Sự đề kháng của Bacillus subtilis..................................................................12
2.2.3.7 Độc tính của Bacillus subtilis (Dẫn liệu Nguyễn Nhật Chen, 2008) ............13
2.2.3.8 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus subtilis ..............................14
2.2.4 Bacillus licheniformis.......................................................................................15
2.2.4.1 Đặc điểm của B. licheniformis ......................................................................15
2.2.4.2 Các nghiên cứu về B. licheniformis ..............................................................15
2.2.4.3 Tác hại ...........................................................................................................16
2.2.4.4 Ứng dụng .......................................................................................................16
2.3.1 Khái niệm biofilm ............................................................................................17
2.3.2 Ý nghĩa của biofilm trong an toàn vệ sinh nhà xưởng, trang thiết bị ..............17
2.4 Một số chất sát trùng thông dụng ........................................................................18

v


2.4.1 Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) .............................................................................18
2.4.2 Acid peracetic (CH 3 COOH) ...........................................................................19
2.6 Qui trình vệ sinh sát trùng nhà xưởng sau sản xuất ............................................22
2.6.1 Hóa chất sử dụng ..............................................................................................22
2.6.1.1 Hoá chất vệ sinh nhà xưởng ..........................................................................22
2.6.1.2 Hoá chất rửa thiết bị và dụng cụ ...................................................................22
2.6.1.3 Chất sát trùng nhà xưởng, thiết bị và dụng cụ ..............................................22
2.6.2 Các bước vệ sinh và sát trùng ..........................................................................23

2.6.2.1 Thứ tự sát trùng .............................................................................................23
2.6.2.2 Nhà xưởng .....................................................................................................23
2.6.2.3 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................24
2.6.3 Phương pháp sát trùng......................................................................................24
2.6.3.1 Nhà xưởng .....................................................................................................24
2.6.3.2 Dụng cụ sản xuất ...........................................................................................24
2.6.3.3 Thiết bị ..........................................................................................................24
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................26
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện..........................................................................26
3.1.1 Thời gian ..........................................................................................................26
3.1.2 Địa điểm ...........................................................................................................26
3.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu......................................................................26
3.2.1 Đối tượng .........................................................................................................26
3.2.2 Nội dung ...........................................................................................................26
3.3 Thiết bị - dụng cụ ................................................................................................26
3.3.1 Thiết bị .............................................................................................................26
3.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................27
3.3.3 Môi trường nuôi cấy .........................................................................................27
3.4 Phương pháp tiến hành ........................................................................................27
3.4.1 Sơ đồ lấy mẫu và số lượng mẫu .......................................................................27
3.4.1.1 Khu vực sản xuất thuốc bột ...........................................................................27
3.4.1.2 Khu vực sản xuất thuốc nước ........................................................................28
3.4.2 Đánh giá sự hiện diện của Bacillus spp và TSVSVHK trong qui trình sản xuất
...................................................................................................................................29
3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu ...................................................................................29
3.4.2.2 Phương pháp phân tích ..................................................................................31
3.4.2.3 Tính kết quả...................................................................................................31
3.4.2.4 Tiêu chuẩn đánh giá về vi sinh vật trong sản xuất thuốc thú y .....................32
3.4.3 Khảo sát sự tồn dư thuốc sát trùng của quy trình vệ sinh thiết bị, dụng cụ .....32
3.4.3.1 Phương pháp lấy mẫu và số lượng mẫu ........................................................32

3.4.3.2 Phương pháp phân tích ..................................................................................33
3.4.3.3 Kết quả ..........................................................................................................33
3.5 Xử lý thống kê .....................................................................................................34
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................35
4.1 Kết quả phân tích Bacillus spp ............................................................................35

vi


4.1.1 Khu vực sản xuất thuốc bột ..............................................................................35
4.1.1.1 Bề mặt trực tiếp .............................................................................................35
4.1.1.2 Bề mặt gián tiếp ............................................................................................37
4.1.2 Khu vực sản xuất thuốc nước ...........................................................................38
4.1.2.1 Bề mặt trực tiếp .............................................................................................38
4.1.2.2 Bề mặt gián tiếp ............................................................................................39
4.2.1 Khu vực sản xuất thuốc bột ..............................................................................39
4.2.2 Khu vực sản xuất thuốc nước ...........................................................................42
4.3 Kết quả khảo sát sự tồn dư thuốc sát trùng trên bề mặt ......................................43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................44
5.1 Kết luận ...............................................................................................................44
5.2 Đề nghị ................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................46
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 49

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFSSA

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

BGA

Brilliant Green Agar

BGB

Brilliant Green Bile

CFU

Colony Forming Unit

E.Agg.E.C

Enteroaggreagative Escherichia coli

E. coli

Escherichia coli

E.H.E.C

Enterohaemorrhagic Escherichia coli

E.I.E.C

Enteroinvasive Escherichia coli

E.P.E.C

Enteropathogenic Escherichia coli

E.T.E.C

Enterotoxingenic Escherichia coli

EMB

Eosin Methyl Blue

GMP

Good Manufacturing Practices

LT

Heat labile enterotoxin

ST

Heat stable enterotoxin

SFSTP

Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques

TSA

Trypticase Soya Agar

TSB

Trypticase Soya Broth

TVSVHK

Tổng số vi sinh vật hiếu khí

VP

Vosges Proskauer

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

Trang

Hình 2.1 Bacillus subtilis dưới kính hiển vi điện tử .............................................. 11
Hình 2.2 B. Licheniformis dưới kính hiển vi điện tử............................................. 15
Hình 2.3 Chất tẩy rửa Topax 18 ............................................................................ 24
Hình 2.4 Chất sát trùng Oxonia active .................................................................. 25
Hình 3.1 Lấy mẫu theo phương pháp tiếp xúc trực tiếp ........................................ 31
Hình 3.2 Cách lấy mẫu phết ................................................................................. 32
Hình 3.3 Lấy mẫu bằng tăm bông vô trùng .......................................................... 32
Hình 3.4 Bộ test kit (peracetic acid test) ............................................................... 35

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E. Coli và đối tượng gây bệnh của
nó .............................................................................................................................. 6
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát Bacillus spp theo khu vực lấy mẫu bề mặt trực tiếp .. 35
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát Bacillus spp theo thời điểm lấy mẫu bề mặt trực
tiếp .......................................................................................................................... 36
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát Bacillus spp trên bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm
................................................................................................................................ 37
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát Bacillus spp trên bề mặt trực tiếp theo thời điểm lấy mẫu
................................................................................................................................ 38
Bảng 4.5 Kết quả khảo sát Bacillus spp trên bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm
................................................................................................................................ 39
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát TSVSVHK theo khu vực lấy mẫu ............................. 40
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát TSVSVHK theo thời điểm lấy mẫu ........................... 40
Bảng 4.8 Kết quả khảo sát TSVSVHK theo thời điểm lấy mẫu .......................... 42
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát sự tồn dư thuốc sát trùng ........................................... 43

x


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ

Trang

Sơ đồ 2.1 Đối tượng sử dụng các sản phẩm Virbac Việt Nam ............................... 3
Sơ đồ 2.2 Thị trường thuốc bột, thuốc nước và thuốc viên của Virbac .................. 4
Sơ đồ 2.3 Thị trường chews .................................................................................... 4
Sơ đồ 2.4 Qui trình sản xuất thuốc bột và thuốc nước ......................................... 23
Sơ đồ 2.5 Các bước vệ sinh, sát trùng nhà xưởng ................................................ 25
Sơ đồ 2.6 Các bước vệ sinh, sát trùng thiết bị và dụng cụ .................................... 26
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ khu vực sản xuất thuốc bột ........................................................ 29
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ khu vực sản xuất thuốc nước....................................................... 30
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ lấy mẫu nước tồn dư thuốc sát trùng .......................................... 34

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi, lĩnh vực sản xuất thuốc thú y
đang ngày càng được quan tâm chú trọng nhiều hơn. Ra đời nhằm mục đích tạo ra
những sản phẩm bảo vệ sức khỏe vật nuôi, lĩnh vực thuốc thú y đã không ngừng
nâng cao chất lượng và chủng loại. Tuy nhiên để có những sản phẩm tốt cần phải
kiểm soát chặt chẽ quy trình sản xuất, kiểm nghiệm cũng như đảm bảo vệ sinh nhà
xưởng trong công tác sản xuất, đặc biệt là các sản phẩm dược có nguồn gốc vi sinh
(probiotic, men...). Trong giai đoạn hiện nay, khi mà các công ty sản xuất thuốc thú
y có uy tín đều hướng đến tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices) thì yêu
cầu đặt ra là làm sao xây dựng được một quy trình vệ sinh sát trùng nhà xưởng,
trang thiết bị theo những tiêu chuẩn của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Mục đích để đảm bảo rằng sau khi sản xuất một lô sản phẩm thì lượng vi sinh vật

nhiễm (nếu có) trên các thiết bị dụng cụ phải trong giới hạn cho phép, tránh lây
nhiễm và ảnh hưởng đến chất lượng của các sản phẩm cùng loại và sản phẩm dược
được sản xuất trên cùng một dây chuyền trong quy trình. Đồng thời những hóa chất
dùng sát trùng trong quá trình tẩy rửa dụng cụ thiết bị cũng phải được đặt trong sự
theo dõi và kiểm soát chặt chẽ.
Xuất phát từ thực tế đó, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Quỳnh Lan
chúng tôi thực hiện đề tài: “ Đánh giá sự hiện diện của vi sinh vật hiếu khí và
Bacillus spp trong quy trình vệ sinh sản xuất thuốc thú y”.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Khảo sát hiệu quả của quy trình vệ sinh sát trùng trong sản xuất thuốc thú y,
từ đó xây dựng và từng bước chuẩn hóa tiêu chuẩn về an toàn vi sinh trong sản xuất

1


thuốc thú y. Từ các kết quả đạt được, đề xuất một số biện pháp nhằm kiểm soát, hạn
chế, phòng ngừa và loại bỏ sự lây nhiễm giữa các lô sản phẩm thuốc.
1.2.2 Yêu cầu
− Xác định những khu vực hay giai đoạn sản xuất có nguy cơ lây nhiễm vi sinh
vật trong nhà xưởng, trang thiết bị và dụng cụ của dây chuyền sản xuất thuốc
thú y.
− Đánh giá mức độ nhiễm Bacillus và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong quy
trình sản xuất thuốc thú y.
− Đánh giá hiệu quả vệ sinh sát trùng và tồn dư thuốc sát trùng trên bề mặt
trang thiết bị sản xuất.

2

Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu về nhà máy sản xuất thuốc thú y Virbac Việt Nam
Nhà máy được đưa vào hoạt động sản xuất từ tháng 7 năm 1999, được xây
dựng theo tiêu chuẩn quốc tế - GMP châu Á và GMP châu Âu.
Virbac Việt Nam là Công ty sản xuất thuốc thú y và thủy sản đạt cùng lúc 2
tiêu chuẩn chất lượng GMP châu Á (Quacert-VN) và châu Âu (AFSSA hay ANES
của Pháp).
2.1.1 Các dây chuyền sản xuất tại Nhà máy Virbac Việt Nam
-

Dây chuyền sản xuất thuốc nước đạt tiêu chuẩn GMP.

-

Dây chuyền sản xuất thuốc bột đạt tiêu chuẩn GMP.

-

Dây chuyền sản xuất thuốc viên.

-

Dây chuyền sản xuất Chew - thức ăn dùng vệ sinh răng miệng cho thú cưng.

-

Dây chuyền phân liều và đóng gói vắc-xin ngừa bệnh dại tại Navetco.

Sơ đồ 2.1 Đối tượng sử dụng các sản phẩm Virbac Việt Nam

3


2.1.2 Thị trường các sản phẩm của Virbac Việt Nam
Thuốc dạng bột, thuốc nước và thuốc viên
châu Á

châu Phi

Việt Nam

Nam Phi

Philippines

Tusinia

Hàn Quốc
Thái Lan
Malaysia
Indonesia
Nhật
Trung Quốc
Đài Loan
Banglades
Sơ đồ 2.2 Thị trường thuốc bột, thuốc nước và thuốc viên của Virbac
Chews dùng cho thú cưng

châu Á

châu Âu

châu Úc

Việt Nam

Hungary

Úc

Philippines

Pháp

Hàn Quốc
Nhật
Đài Loan
Ấn Độ
Indonesia
Sơ đồ 2.3 Thị trường chews

4


2.2 Vi khuẩn lây nhiễm trong môi trường sản xuất
2.2.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TSVSVHK)
Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều
kiện có sự hiện diện của ôxi phân tử.
TSVSVHK là tổng số tất cả các loài vi khuẩn ưa khí hiện diện trong mẫu và

dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh của sản phẩm. Ngoài ra, chỉ tiêu TSVSVHK được
dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về sự ô nhiễm vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng,
thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình sản xuất, vận
chuyển và bảo quản sản phẩm.
2.2.2 Một số vi sinh vật hiếu khí thường gặp
2.2.2.1 Escherichia coli
Đặc điểm hình thái
E.coli là trực khuẩn gram âm hình que thẳng, hai đầu tròn, kích thước dài
ngắn khác nhau trung bình khoảng 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trường
nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 µm. Trực khuẩn thường di động, có vỏ bọc, có lông
và không sinh bào tử.
Đặc điểm nuôi cấy
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là 35 –
37oC, một số dòng có thể phát triển ở nhiệt độ hơn 40oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối
ưu nhất là 7,2 – 7,4).
Trên môi trường thạch EMB (Eosin Methyl Blue): E.coli thường cho khuẩn
lạc màu tím ánh kim.
Trên thạch Macconkey: E.coli tạo khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, lồi.
Đặc tính sinh hóa: E.coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường
thông thường như: lactose, glucose, manitol...căn cứ vào khả năng lên men đường
lactose mà người ta phân biệt E.coli và một số vi khuẩn đường ruột khác.
E.coli có phản ứng sinh hóa: Indol (+), Methyl red (+), Vosges Proskauer
(-), Citrate (-).

5


E.coli có sức đề kháng kém, bị giết chết sau 60 phút ở nhiệt độ 55oC, ở nhiệt
độ 60oC chúng bị giết chết sau 30 phút.
Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của E.coli rất phức tạp với 4 loại kháng nguyên O, H, K, F.
Những kháng nguyên có cấu trúc khác nhau thì khả năng gây bệnh cũng khác nhau.
• Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân.
• Kháng nguyên K: là kháng nguyên bề mặt.
• Kháng nguyên lông H: tạo nên khả năng di chuyển của E.coli.
• Kháng nguyên tiêm mao F: tiêm mao không tham gia vào sự di chuyển, tiêm
mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng
trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
Các chủng E.coli gây bệnh
(Theo tài liệu tổng hợp của Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007)
Đối với các E.coli gây bệnh đường ruột người ta chia làm 5 loại sau đây:
• Enteroaggreative E. coli (E.A.E.C hay E.Agg.E.C)
• Enteroinvasive E. coli (E.I.E.C)
• Enterphathogenic E. Coli (E.P.E.C)
• Enterohaemorrhagic E. Coli (E.H.E.C)
• Enterotoxigenic E. Coli (E.T.E.C).
Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E. Coli và đối tượng gây bệnh của nó
(trích dẫn bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Kháng nguyên

Đối tượng gây bệnh

K 88

Heo con

K 99

Cừu, bê

O8, O9, O20, O101

K 41

bê

O9, O101

CFA/1

Người

O15, O25, O63, O78

CFA/2

Người

O6, O8

6

Serogroup O
O8, O45, O138, O141,
O147, O149, O157


Khả năng gây bệnh
Gây bệnh cho người
E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn sống cộng sinh với người nhưng E. Coli có thể gây
bệnh cơ hội, chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật,
đường hô hấp và nhiễm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày
ruột ở trẻ em.
Gây bệnh thực nghiệm trên thú
Khả năng gây bệnh cho súc vật yếu, phải đưa một lượng lớn vi khuẩn vào
phúc mạc chuột nhắt hay đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết cho súc vật.
E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản
sinh độc tố ruột hay E.T.E.C.
2.2.2.2 Salmonella
Đặc điểm hình thái
Salmonella là trực khuẩn gram âm. Hầu hết Salmonella đều có lông xung
quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vì vậy có khả
năng di động, không sinh nha bào.
Đặc điểm nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là
37oC, pH thích hợp 7 – 7,3. Salmonella dễ nuôi cấy, có thể phát triển trong môi
trường thông thường.
Trên thạch BGA (Brillient Green Agar): khuẩn lạc môi trường chuyển sang
màu đỏ. Trên thạch MCK (MacConkey) cho khuẩn lạc không màu, không gây dung
huyết trên thạch máu.
Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi), không lên
men lactose, indol âm tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat thay đổi,
urease âm tính, H 2 S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H 2 S âm tính)...

7


Cấu trúc kháng nguyên
Kháng nguyên O là kháng nguyên thân, việc xác định các yếu tố kháng

nguyên O là hết sức quan trọng để định nhóm và định type.
Kháng nguyên H: chỉ có ở những Salmonella có lông.
Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài vách tế bào vi
khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy được ở kính hiển vi thường.
Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh Salmonella typhi và S. paratyphi C.
Khả năng gây bệnh
Bệnh thương hàn
Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi. Bệnh lây từ người này sang
người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi khỏi bệnh về mặt lâm
sàng, một số bệnh nhân trở thành nguồn lan truyền bệnh quan trọng.
Các bệnh khác
Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là nhiễm
trùng ống tiêu hóa trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm, trong đó
Salmonella typhimurium là tác nhân hay gặp nhất. Bệnh có biểu hiện sốt, nôn,
tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu
hóa như viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi...
2.2.2.3 Staphylococcus aureus
Đặc điểm hình thái
S.aureus là vi khuẩn gram dương, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, đường
kính khoảng 0,8 – 1 µm, thường tụ lại thành từng chùm hay từng đôi, không có vỏ
bọc, không có lông và không sinh bào tử.
Đặc điểm nuôi cấy
S.aureus mọc dễ dàng trên môi trường nuôi cấy không chọn lọc, phát triển
được ở nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều, chúng có thể phát triển trong khoảng nhiệt
độ 10 – 45oC.
Trên môi trường canh, sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi
trường, sau 24 giờ môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều.

8

Trên môi trường thạch không chọn lọc, sau 24 giờ vi khuẩn phát triển mạnh,
khuẩn lạc dạng S (Smooth), tạo sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm.
Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc dạng S, thường gây tan máu và tạo
sắc tố vàng.
Hầu hết các dòng S.aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có
nhiệt độ trên 15oC, độc tố sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35
– 37oC, tất cả các dòng S.aureus đều có khả năng phát triển trong môi trường chứa
đến 15% NaCl, nhạy với novobiocine và có khả năng tan huyết (95%).
S.aureus có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, sucrose, trehalose,
phản ứng catalase dương tính và có khả năng đông tụ huyết tương, phản ứng
oxidase âm tính.
Cấu trúc kháng nguyên
Dựa vào hiện tượng liên kết với huyết thanh thỏ miễn dịch, người ta chia
thành 18 kiểu huyết thanh của S.aureus, trong đó có 3 kiểu đầu (I, II, III của
Cowan) phần lớn là các kiểu huyết thanh gây bệnh ở người.
Sức đề kháng
Tụ cầu nhiễm vào thức ăn sau 4 – 5 giờ sẽ sản sinh ngoại độc tố ruột (A, B,
C, D, E) có khả năng chịu nhiệt cao, ngoại độc tố này chỉ bị phá vỡ ở nhiệt độ
100oC trong thời gian 1 – 2 giờ. Ở nhiệt độ thấp, độc tố ruột có thể duy trì độc tính
trên 60 ngày và nó không làm thay đổi mùi vị của thức ăn do đó rất khó phát hiện
và dễ gây bệnh.
Các loại enzyme và độc tố
• Các loại enzyme
-

Men coagulase: men này có khả năng làm đông huyết tương người và thỏ, nó
là một protein bền nhiệt nhưng bị thủy phân và bất hoạt bởi protease, có tính
chất kháng nguyên yếu, có thể gây huyết cục trong tĩnh mạch.

-

Men fibrinolysin: là men đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người. Men
này làm tan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc
mạch nhỏ, tạo ra nhiễm khuẩn di căn.

9


-

Men desoxyribonuclease: là men có thể thủy phân AND, gây ra các tổn
thương tổ chức bên trong.

-

Men hyaluronidase: men này gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự
thủy phân của acid hyaluronic.

-

Men penicillinase: hầu hết các tụ cầu đều sản xuất được loại men này (betalactamase), nó phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh
như penicilline G, ampicilline... làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.

-

Men exfoliatine: là men phá hủy lớp thượng bì, gây tổn thương da tạo các
bọng nước.

• Các độc tố

+ Dung huyết tố (hemolysin) có 3 loại
-

Dung huyết tố (α): gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC, huyết tố này
cũng có thể gây hoại tử da và gây chết, nó là một ngoại độc tố, có tính
kháng nguyên cao và có thể trở thành giải độc tố.

-

Dung huyết tố (β): có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 4oC, ít độc hơn
dung huyết tố α.

-

Dung huyết tố (δ): có tác dụng lên hồng cầu và gây hoại tử da.

+ Nhân tố diệt bạch cầu (leucocidin): nhân tố này làm bạch cầu mất tính di
động và bị phá hủy nhân.
+ Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp,
các độc tố ruột chỉ do một chủng tụ cầu tiết ra. Có 5 loại độc tố ruột (enterotocine
A, B, C, D, E) bền nhiệt, trong đó có 2 loại được biết rõ là:
- Độc tố ruột A: được tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm
độc thức ăn.
- Độc tố ruột B: được tạo ra do một chủng phân lập từ bệnh nhân viêm ruột.
Khả năng gây bệnh
Độc tố khi vào dạ dày thấm vào niêm mạc dạ dày, ruột, vào máu sau đó tác
động lên hệ thần kinh thực vật làm cường phó giao cảm gây tăng nhu động ruột làm
dạ dày co bóp dẫn đến triệu chứng ngộ độc.

10

2.2.3 Bacillus subtilis
2.2.3.1 Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.2.3.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Bacillus subtilis dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 100.000 lần)
( />B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu Gram dương, kích thước
0,5 – 0,8 μm x 1,8 – 3 μm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 – 12 lông,
có khả năng hình thành nội bào tử. Bào tử B.subtilis phát triển bằng cách nảy chồi
do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại,
phóng xạ…
2.2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC.
Nhu cầu O 2 : B.subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
Thích hợp phát triển nhất với pH = 7,0 – 7,4.

11


Môi trường thạch TSA: khuẩn lạc dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều,
tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn
nheo màu hơi nâu.
Môi trường canh TSB: làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại

như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải
tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng citrate (+), phản ứng nitrate (+), VP (+),
indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
2.2.3.4 Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử
trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong
môi trường bị cạn kiệt , nhiệt độ…).
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp vi khuẩn vượt qua
những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không
thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi… mỗi vi khuẩn
chỉ tạo một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ này mầm trở về dạng tế
bào sinh dưỡng.
2.2.3.5 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp:
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau
như: subtilin, subtilosin A, Tas A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin,
rhizocticins, difficidin…
2.2.3.6 Sự đề kháng của Bacillus subtilis
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc trong đường ruột nên ngoài khả
năng chịu đựng được acid của dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột,
chúng còn có khả năng đấu tranh với các vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột.
Theo các chuyên gia tại Đại học Havard – Mỹ cho biết quá trình tạo bào tử
của Bacillus subtilis tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vài giờ và khi bắt

12


đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránh thời điểm đó càng

lâu càng tốt.
Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một
số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống
giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng
phần lớn chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh
nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.
Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất
kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này
nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài
thời kỳ trước khi tạo bào tử.
2.2.3.7 Độc tính của Bacillus subtilis (Dẫn liệu Nguyễn Nhật Chen, 2008)
Đối với con người
Một số chủng Bacillus subtilis cũng như họ hàng gần của nó là Bacillus
licheniformis, Bacillus pumulis, Bacillus megaterium có khả năng sản xuất
lecithinase - một enzyme có khả năng phá vỡ tế bào của động vật hữu nhũ. Tuy
nhiên vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người.
Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có
độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với
những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường
hô hấp….
Bacillus subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme
ngoại bào và là tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người. Ngoại trừ
những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của
người đang suy yếu. Người ta vẫn phát hiện Bacillus subtilis ở những bệnh nhân bị
ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…Tuy nhiên tỉ lệ các
trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm Bacillus (trong
1034 ca nhiễm) là do Bacillus subtilis.

13