Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (curcuma longa l ) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ
TÀI NGUYÊN SINH VẬT
---------------

HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC

NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA
L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hóa sinh
Mã ngành: 60420114

LUẬN VĂN: THẠC SĨ SINH HỌC

HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. DƢƠNG NGỌC TÚ

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS.Dƣơng Ngọc
Tú, Trƣởng phòng Sinh dƣợc - Viện Hóa học, Phó giám đốc kiêm điều phối viên Trung tâm
Xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vƣơng quốc Anh.

Thầy đã luôn hƣớng dẫn, định hƣớng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trƣờng Đại học Thái Nguyên
cũng nhƣ các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tnh
giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp tại
phòng Sinh dƣợc, phòng Nghiên cứu các Hợp chất tự nhiên, Viện Hóa học và đã đồng
hành và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Đặc biệt là PGS.TS.Nguyễn Thị Hoàng
Anh ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi từng bƣớc từ khi mới bắt đầu nghiên cứu về
lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên, cũng nhƣ giúp đỡ, và cho tôi những lời khuyên quý báu
để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng tôi là

chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm
ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn.
Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2015
Học viên

Nghiêm Văn Đức

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i MỤC LỤC
......................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ
HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
......................................................
iv
DANH
MỤC
CÁC
HÌNH
ẢNH,

ĐỒ
THỊ........................................................
v
MỞ
ĐẦU
........................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1. Nấm nội sinh. ........................................................................................ 4
1.1.1. Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật. .................... 4
1.1.2. Phân lập nấm nội sinh:.................................................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh:.............................................. 6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới: ...................... 6

1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước: ...................... 12
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc. ........ 16
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu. ....................................................................... 16
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc. ........................................ 16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. .................................................................. 16
2.2.1. Phương pháp thu hái mẫu thực vật. .............................................. 16
2.2.2. Phương pháp phân lập nấm nội sinh trong thực vật. .................... 16
2.2.3. Phương pháp bảo quản nấm.......................................................... 17
2.2.4. Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái. .................... 18
2.2.5. Phương pháp sinh khối nấm nội sinh. ........................................... 19
2.2.6. Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên. ............................ 20

2.2.7. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. ......... 21
2.2.8. Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm của các hợp chất sinh học.
.................................................................................................................. 23
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................ 24
3.1. Kết quả phân lập và sinh khối nấm nội sinh. .................................. 24
3.1.1. Kết quả thu hái và xử lý mẫu thí nghiệm. ...................................... 24
3.1.2. Kết quả phân lập nấm nội sinh. ..................................................... 25
3.1.3. Kết quả định danh một số chủng nấm nội sinh. ............................ 33
3.1.4. Kết quả sinh khối nấm nội sinh: .................................................... 35
3.2. Kết quả ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu nấm nội sinh.
..................................................................................................................... 36
3.2.1. Kết quả ngâm chiết mẫu nấm B1 và C, sinh khối.......................... 36

3.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm B.cinera của các dịch chiết ..... 38
3.2.3. Kết quả phân lập chất từ nấm Fusarium sp. (B1). ........................ 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 52

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

AChE

Acetylcholinesterase

Enzyme thủy phân
acetylcholinesterase

ARNr

ARN ribosome

ARN ribosome

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký bản mỏng

CC

Column chromatography

Sắc ký cột

HPLC

High-performance liquid

sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
GC/MS

Gas Chromatography Mass

Sắc ký khí ghép khối phổ

Spectometry
MS

Mass spectrometry

Khối phổ

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

IR

Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

iii


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm đã sinh khối .......................... 37
Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập các hợp chất từ nấm Fusarium sp. (B1)... 40

Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botryts cinera của các dịch chiết nấm 38
Bảng 3.2: Thông tin các hợp chất 1-12 ................................................... 41
1
13

Bảng 3.3: Số liệu phổ H- và C-NMR và HSQC của chất 14
(DMSO, 500 và 125 MHz) ...................................................................... 47

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình 3.1: Hình ảnh mẫu nghệ vàng (Curcuma longa) ............................ 24
Hình 3.2: Thu hái mẫu nghệ vàng ........................................................... 24
Hình 3.3: Khử trùng các mẫu nghệ trong phân lập nấm nội sinh............ 25
Hình 3.4: Mẫu đối trứng (kiểm tra công thức khử trùng)........................ 25
Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, củ nuôi cấy phân lập nấm nội sinh) 26

Hình 3.6: Chủng nấm A........................................................................... 27
Hình 3.7: Chủng nấm B1 ......................................................................... 27
Hình 3.8: Chủng nấm B2 ......................................................................... 28
Hình 3.9: Chủng nấm C ........................................................................... 28
Hình 3.10: Chủng nấm D......................................................................... 28
Hình 3.11: Chủng nấm E ......................................................................... 29
Hình 3.12: Chủng nấm F ......................................................................... 29
Hình 3.13: Chủng nấm G......................................................................... 29
Hình 3.14: Chủng nấm H......................................................................... 30
Hình 3.15: Chủng nấm I .......................................................................... 30
Hình 3.16: Chủng nấm J .......................................................................... 30
Hình 3.17: Chủng nấm K......................................................................... 31

Hình 3.18: Chủng nấm L ......................................................................... 31
Hình 3.19: Chủng nấm M ........................................................................ 31
Hình 3.20: Chủng nấm Ng1..................................................................... 32
Hình 3.21: Chủng nấm Ng2..................................................................... 32
Hình 3.22: Chủng nấm Ng3..................................................................... 32
Hình 3.23: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng C, bar 20 µm ...... 33
Hình 3.24: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng B1, bar 10 µm .... 34
Hình 3.25: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NG01, bar 20 µm 35
Hình 3.26: Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng NG03, bar 20 µm
.................................................................................................................. 35
Hình 3.27: Kết quả sinh khối chủng nấm Fusarium sp. (B1) ................. 36
Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối chủng nấm .................................. 37

Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm
Botryts cinera của các cặn chiết. ............................................................ 39
Hình 3.30: Phổ sắc ký đồ của mẫu NB1M4 ........................................... 44
Hình 3.31: Phổ 1H chất 14 .................................................................... 48
Hình 3.32: Phổ C13CPD chất 14............................................................ 49
Hình 3.33: Phổ HSQC chất 14............................................................... 50

v


MỞ ĐẦU
Nấm nội sinh là những vi sinh vật sống trong tế bào cây mà không gây ra bất kì tác

động tiêu cực nào. Trong nhiều trƣờng hợp, nấm nội sinh có chức năng bảo vệ cây chống
lại các loài gây bệnh bên ngoài. Có hai cơ chế liên quan đến khả năng bảo vệ cây này,
hoặc các loài nấm nội sinh trực tiếp sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất để tấn công
các loài ngoại lai xâm nhập, hoặc chúng sẽ kích thích cơ chế phòng vệ của cây chủ. Nấm
nội sinh còn có thể kích thích tăng trƣởng cây bằng cách sản xuất ra hormone thực vật,
tổng hợp siderophore, cố định nito, hòa tan các chất khoáng, ức chế ethylene, hoặc trợ
giúp quá trình phytoremediation. Nấm nội sinh có thể đƣợc truyền đi từ thế hệ này
sang thế hệ khác thông qua mô cây, hạt, hoặc các phƣơng thức truyền giống thực vật
khác. Trong số hơn 300 ngàn loài cây thực vật bậc cao, mỗi cây là vật chủ của một hoặc
nhiều loài nấm nội sinh. Tƣơng tác giữa nấm nội sinh và cây chủ tƣơng ứng liên quan đến
quá trình đồng sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học, tuy nhiên ngƣời ta vẫn chƣa
hiểu hết đƣợc bản chất sự tƣơng tác này. Điều quan trọng là bản chất mối quan hệ cộng

sinh xác định rằng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh đều không hại đến
tế bào cây và không gây độc, do đó việc ứng dụng chúng trong y tế, chữa trị bệnh
cho con ngƣời có tiềm năng rất cao.
Hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính
sinh học hoặc có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc. Các hợp chất thiên nhiên
đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu trên thế giới đối với các chất có hoạt
tính sinh dƣợc. Những loài nấm nội sinh sống cộng sinh bên trong tế bào thực vật,
chúng hiện nay đang đƣợc nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và đƣợc coi nhƣ là nguồn
tài nguyên vô tận chƣa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dƣợc phẩm. Những
nghiên cứu về nấm nội sinh có nguồn gốc từ biển đã tìm thấy hơn 270 các hợp chất mới
từ những năm 1990 tới giữa năm 2002 (2/3 trong số đó là từ tảo biển và cây

1


ngập mặn). Chỉ trong khoảng 5 năm từ 2002 tới 2006, đã tìm ra hơn 330 các hợp chất
mới (là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm nội sinh). Các hợp chất trao đổi chất bậc
hai do vi sinh vật sống sản sinh ra là con đƣờng quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc
mới trong y tế ngày càng tăng vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc, và tính
mới. Các loài nấm sống nội sinh trong tế bào cây có thể sản sinh các hợp chất tƣơng tự,
hoặc cùng một loại hợp chất sản xuất bởi cây chủ. Cũng có trƣờng hợp nấm có thể sản
sinh ra các chất mà ngƣời ta không chiết ra đƣợc từ cây. Thông qua quá trình lên men vi
sinh ở quy mô lớn, các loài nấm nội sinh có thể sản xuất một số lƣợng lớn các hợp chất có
hoạt tính sinh học với giá thành rẻ để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất dƣợc

phẩm. Điều quan trọng nữa là khi sử dụng vi sinh vật nội sinh sẽ tránh đƣợc việc khai
thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt
chủng các loài cây, gây hậu quả xấu tới môi trƣờng tự nhiên.
Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ nghệ
vàng chứa tinh dầu, ngoài ra còn có chất curcumin... Theo y học cổ truyền, nghệ vàng
đƣợc phân làm hai vị thuốc. Thân rễ to đƣợc gọi là khƣơng hoàng, các củ nhỏ mọc ra từ
thân rễ đƣợc gọi là uất kim. Uất kim thƣờng có màu đỏ hơn. Nghệ không chỉ làm gia vị để
tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhƣng
công dụng nhất là loại nghệ vàng. Nghệ vàng có vị đắng cay, có mùi thơm hắc, tính ấm, có
tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Nghệ vàng dùng để chữa các bệnh: kinh
nguyệt không đều, viêm loét dạ dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt
Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thƣ, HIV, tiểu đƣờng, Alzheimer, viêm gan B, C, kháng

nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [1].
Hoạt chất Curcumin trong c Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần
chính của Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa

2


học là (1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5- dione. Curcumin
có dạng bột màu vàng đƣợc mệnh danh nhƣ một loại thần dƣợc có khả năng phòng
chống và chữa đƣợc rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống
viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu ở
khối u, giúp tăng cƣờng miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm,

kháng virus.
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhƣng đối tƣợng nấm nội ký sinh
trong cây nghệ thì vẫn chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu. Vì vậy phân lập nấm nội ký sinh
từ cây nghệ là một hƣớng mới trong nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực
các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Để tm hiểu về những vấn đề trên chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma
longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh”. Mục tiêu chính của đề tài là tm
ra các chủng nấm nội sinh trong cây nghệ và nghiên cứu thành phần hóa học của chúng.
Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ nấm nội sinh.

3

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm nội sinh.
1.1.1. Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật.
Nấm nội sinh (Endophytes fungal, Endophytc fungi) là những vi sinh vật sống ở
mô sâu thực vật nhƣng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [32]. Endophytes
cũng có thể thúc đẩy tăng trƣởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau nhƣ sản
xuất phytohormones [10], tổng hợp siderophores [21], cố định đạm [23], hay qua hỗ
trợ phytoremediaton [24]. Endophytes có thể đƣợc truyền từ một thế hệ kế tiếp thông
qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [9]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng
các sản phẩm tự nhiên thu đƣợc từ vi khuẩn endophytc có chống vi khuẩn, chống ung thƣ,
chống oxy hóa, chống tiểu đƣờng, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và

chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [26].
Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tƣơng sinh, nấm nội
sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tƣơng
tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến
việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng
nấm nội sinh hữu ích. Chúng đƣợc xem nhƣ là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh
trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [7,32].
Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số
loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, ngƣời ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu
đựng khô hạn hoặc chịu đƣợc độc tính của nhôm trong nguồn nƣớc, trong môi trƣờng
sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ nhƣ động vật ăn
cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên đƣợc sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã

đƣợc quan sát, theo dõi và đƣợc kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt
nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trƣớc thực tế này, một câu hỏi đƣợc
đặt ra

4


rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ
tƣơng sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [7].
1.1.2. Phân lập nấm nội sinh:
Trên thế giới có khoảng 300 nghìn loài thực vật. Đó là một số lƣợng quá lớn
mà ta không thể thử nghiệm hết cũng nhƣ không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng

khi đƣa vào nghiên cứu. Do đó, việc chọn thực vật để phân lập nấm nội sinh cũng cần
phải dựa trên những đối tƣợng cây có đặc điểm sinh học. Một số nguyên tắc cơ bản sau
đây thƣờng đƣợc áp dụng:
Với thực vật sống trong môi trƣờng sinh học bất thƣờng, môi trƣờng bất
thƣờng và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố
đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu cao. Và ngƣời ta mong đợi nhân tố đó
chính là các nấm nội sinh có ích. Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài cây sống dƣới
nƣớc ở Tây Nam Venezuela, nơi mà môi trƣờng nƣớc rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập
bởi tác dụng nƣớc cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thƣơng. Từ đó các nấm gây
bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhƣng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây đƣợc sự bảo vệ bởi các
nấm nội sinh có trong cây. Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia
marcescens đƣợc phân lập từ cây R. penicillata có khả năng sản xuất ra oocydin A,

một hợp chất kháng nấm mới [30].
Một số loài thực vật dƣợc liệu dân gian đã đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm dân
gian, từ đời này sang đời khác để chữa lành vết thƣơng, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ
nhƣ, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã đƣợc dân gian sử dụng sáp nhựa để
trị vết thƣơng, sát trùng. Từ cây này đã phân lập đƣợc chủng Streptomyces sp. NRRL
30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng đƣợc nấm gây bệnh thực vật, vi
khuẩn và Plasmodium [11].

5


Các thực vật có tính đặc thù về sinh thái: tuổi thọ cao bất thƣờng, phát triển trong

các vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xƣa…cũng là những
đối tƣợng nghiên cứu rất lý tƣởng để cung cấp các nấm nội sinh mới lạ.
Nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lƣợng của chúng tìm
thấy thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trƣờng sống của nó. Đã có
nhiều kĩ thuật phân lập nấm nội sinh đƣợc đề nghị bởi nhiều tác giả khác nhau. Nhƣng tất
cả các quy trình phân lập đều dựa trên cơ sở chung nhất đó là: giải quyết tốt giai đoạn xử
lý bề mặt, diệt các sinh vật ngoại nhiễm bằng chất sát trùng hoặc các phƣơng pháp sát
trùng. Sau đó tạo điều kiện không nhiễm để chỉ thu nhận các nấm nội sinh phát triển từ
nội mô thực vật. Tiếp theo chọn nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp và thử hoạt tính
sinh học [30,32].
1.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh:
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới:

Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra đƣợc 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm
1975 đã tm ra đƣợc 5.000 chất kháng sinh. Trên thế giới đã biết đƣợc hơn 13.000 chất
kháng sinh đƣợc sản xuất từ thiên nhiên (Berdy, 1984). Theo đó, từ những năm 1990,
Taxomyces andreanae lần đầu tiên đƣợc phân lập từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản
xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có
phổ khối tƣơng tự nhƣ paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Một
số nhà khoa học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ
và tm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất đƣợc sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị
bệnh ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus)
luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh [28,29].
Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc hàng trăm loài
nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói

6


các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chƣa từng đƣợc phát hiện và rất
đáng chú ý, chúng tƣơng tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã đƣợc biết là có tổng
hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua
những bằng chứng miễn dịch học, ngƣời ta cũng đã phát hiện đƣợc sự tổng hợp taxol ở
nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng
của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp. [28,29].
Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh
Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 đƣợc phân lập từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất

kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) nhƣ Bacillus anthracis, M.
tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng
NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng
sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P. falciparum với LD50=710ng/ml
[11].
Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng đƣợc công nhận là
nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học. Một vật chủ có thể phân
lập đƣợc rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [33].
Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh
Cryptospriopsis quercina đƣợc phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm này có thể
sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số nấm gây bệnh
cho ngƣời nhƣ Candida albicans, Trichophyton sp. và chống một số nấm gây bệnh thực

vật nhƣ Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria
oryzae và một số nấm gây bệnh thực vật [30]. Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự
đã nghiên cứu về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và
Alpinia galanga [32].

7


Năm 2005, Raviraja đã phân lập đƣợc mƣời tám loài nấm nội sinh đƣợc phân lập
từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats của Ấn Độ: Curvularia
clavata, C. lunata, C. Pallescens, Fusarium oxysporum... Nấm nội sinh đã đƣợc tm thấy
nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây. Phần lớn

các loài nấm nội sinh đã đƣợc tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử
châu, họ Hoa môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ
Hoa chuông (5 loài) [22].
Năm 2007, Li và cộng sự đã tm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia
serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme
acetylcholinesterase, và đƣợc dùng trong điều trị bệnh Alzheimer
[20].
Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập đƣợc Fusarium solani từ Camptotheca
acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9- methoxycamptothecin và
10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thƣ [19].
Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong
cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dƣỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi

trƣờng sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên
quan có thể thúc đẩy tăng trƣởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte
Paenibacillus sp. đƣợc phân lập từ thân rễ củ nghệ và cả hai chủng đã đƣợc tìm thấy có
khả năng để sản xuất Indole 3 acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC high- performance liquid chromatography) [8].
Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân
lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tm mạch
[12].

8


Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dƣợc và Công nghệ

Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên bang Đức phân lập và xác
định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của nấm nội ký sinh Acremonium
strictum Gams, phân lập từ cây Đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt
Nam. Trong đó có 5 dẫn xuất polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone
(2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã biết (612). Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với
hai dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời là ung thƣ biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin
(A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR), trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt
tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [13].
Các hợp chất có hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh
1 - Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thƣ: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm nội
sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể tổng hợp đƣợc các
chất gây độc và têu diệt tế bào ung thƣ. Cyclic depsipeptides bionectriamides A-C đƣợc

tách chiết từ chủng Bionectria ochroleuca đƣợc phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia
caseolaris) ở Hải Nam, Trung Quốc [11].
2 - Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội sinh
sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện tƣợng nhờn thuốc
của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nhà khoa học đã tm thấy nhiều hợp chất có nguồn
gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt một dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh.
Fusarium incarnatum đƣợc phân lập từ cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam,
Trung Quốc có khả năng sinh ra equisetin [7].

9

3 - Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thƣờng đƣợc tìm thấy ở các cây dƣợc
liệu, rau và hoa quả. Chất chống oxi hóa thƣờng đƣợc xem nhƣ các tác nhân giúp phòng
tránh và chữa trị bệnh nhƣ ung thƣ, bệnh tim, tăng huyết áp, tiểu đƣờng, run chân tay và
mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần phenol từ nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao.
Loài nấm Phomopsis amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và
Trichoderma đƣợc tm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra
các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Nấm nội sinh Alternaria sp. R6 phân lập từ rễ
cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra các chất chuyển hóa
resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do ABTS&DPPH [7,34].
4 - Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm sự
hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đƣờng huyết sau khi ăn. Các chất
này có thể đƣợc sử dụng để điều trị tiểu đƣờng, béo phì. Hai chất mới đƣợc tm thấy từ

nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ loài cây ngập mặn Kandelia candel ở
vùng Quảng Đông, Trung Quốc (6’-O- desmethylterphenyllin,

3-hydroxy-6’-O-

desmethylterphenyllin) có hoạt tính ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao
hơn cả chất đối chứng dƣơng genistein. Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp. BL321 có
hoạt tính ức chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao. Ngoài ra, các chất chuyển hóa của
vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatn từ nấm nội
sinh Penicillium sp. HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera manghas) cũng biểu hiện hoạt
tính kháng cao [27].
5 - Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) hiện sử

dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer. Tuy nhiên, hiện vẫn chƣa tm đƣợc loại
chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác dụng phụ nhất. Sporothrin A từ nấm nội
sinh Sporothrix sp. có biểu hiện ức chế AChE rất mạnh. Hai terphenyls từ nấm nội sinh
Penicillium chermesinum

10


(ZH4-E2) cũng có hoạt tính ức chế AchE. Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các hợp chất do
nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp. sk5GW1L và Penicillium
sp. sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE nhƣ arigsugacin I, arigsugacin F và territrem B
[14].

6 - Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất cần thiết
trong điều trị các bệnh viêm. Nấm nội sinh Irpex hydnoides, Aspergillus flavus,
Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii, Pestalotopsis microspora,
Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản
sinh ra các chất chống viêm có hoạt tính tƣơng đƣơng thuốc Indomethacin [15].
7 - Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria, vi khuẩn Lao phổi đang trở nên rất
nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tm ra các chất
mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách. Nấm nội sinh Fusarium sp. DZ-27 phân lập
từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có thể sinh ra axit fusaric. Các thử nghiệm
chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit fusaric với muối cadmium và muối đồng
của nó thể hiện hoạt tính têu diệt rất cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis
BCG và M.tuberculosis H37Rv [7]. Nấm nội sinh Nigrospora sp. phân lập từ cây Bruguiera

sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh cao chống lại rhino
virus [17].
Nhiều nấm nội sinh trong cây đã đƣợc phân lập, chúng có khả năng sản sinh những
chất biến dƣỡng có hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u,
chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
Fusarium sp. là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, đƣợc thu nhập từ vùng
Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất đƣợc một pentaketide mới là CR
377 cho tác dụng mạnh trên C. albicans [25].
Pestralotiopisis microspora thƣờng gặp ở rừng mƣa nhiệt đới, sản xuất nhiều chất
có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có

11

tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã đƣợc phân lập
từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm.
Muscodor albus là nấm đƣợc phân lập từ cành của cây Quế (Cinnamomum
zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành
phần chính của những hợp chất này đã đƣợc xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí
ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó đƣợc tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp đƣợc
có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với ngƣời [31].
Nodulisporium sp. đƣợc phân lập từ cây Bonta daphnoides sản xuất hợp chất
nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng [16].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước:

Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nƣớc đã phân lập đƣợc 6 chủng nấm nội
sinh từ vỏ cây thông đỏ, đã định đƣợc tên của 6 chủng nấm này. Đây là loài thực vật đặc
hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một vị thuốc. Chúng thƣờng
đƣợc phân bố ở Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và
chủ yếu là ở Lâm Đồng. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotopsis maculans
(corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ đƣợc lấy mẫu. Chúng phù
hợp nhất với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp. đƣợc tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ
ở Mỹ và đƣợc các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản
mỏng cùng với chất taxol chuẩn [35].
Trong 2 năm 2003-2004, phòng sinh học thực nghiệm cũng đã phân lập đƣợc trên
115 chủng nấm kí sinh trên các cây thuốc khác nhau trong đề tài đƣợc giao: “Phân lập
một số chủng nấm ký sinh thực vật và tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học” [35].

12


Năm 2005, Lê Mai Hƣơng cùng các cộng sự thuộc phòng sinh học thực nghiệm Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã tiến hành nhiệm vụ “Nghiên cứu khu hệ nấm
nội ký sinh trong các cây Thông”. Nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào 3 loài Thông là
Thủy tùng (Glyptostrobus pensilis), Thông đỏ Bắc (Taxus chinensis) và Thông đỏ lá dài
(Taxus wallichiana). Mục têu của việc nghiên cứu là cung cấp cơ sở khoa học cho chính
quyền địa phƣơng và ngành Lâm nghiệp về giá trị bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn tài
nguyên quý hiếm, cũng nhƣ cho ngành Y học ứng dụng kết quả nghiên cứu để giảm thiểu
và điều trị bệnh ung thƣ. Địa điểm triển khai khảo sát thực địa, thu thập mẫu của nhiệm
vụ này ở tại một số tỉnh phía Bắc nhƣ Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Sơn La và

một số tỉnh miền Trung nhƣ Lâm Đồng, Đắc Lắc. Sau chuyến thực địa, các nhà nghiên cứu
đã thu thập đƣợc 118 mẫu tại các tỉnh khảo sát. Các mẫu này đƣợc kiểm định rồi đem
nuôi cấy, lên men và tách chiết sơ bộ các chủng nấm phân lập để sàng lọc hoạt tính
sinh học, tách chiết hóa học theo định hƣớng hoạt tính một số chủng nấm tiêu biểu [35].
Lê Mai Hƣơng và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45
mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vƣờn thuốc Mê Linh thu đƣợc 89 chủng nấm nội
sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm
22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số),
27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ
32 chủng có hoạt tính, bằng phƣơng pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn đƣợc 9 chủng
có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 có hoạt tính cao nhất,

kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [3].
Năm 2009, Trần Thị Nhƣ Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây khổ
sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu đƣợc chủng
nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất

13


ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào,
chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với
MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh với cả 3
dòng tế bào thử là ung thƣ gan, ung thƣ màng tử cung và ung thƣ màng tim [2].

Năm 2009, tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Phạm Quang Thu và cộng sự
cũng đã nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm
gây bệnh ở các dòng Keo tai tƣợng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế. Phân lập đƣợc 8
chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tuợng khảo nghiệm
tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và nấm nội sinh trên tổng số 21
chủng có hoạt tính ức chế nấm Ceratocystis sp. ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8
trên tổng số 21 chủng ức chế nấm Corticium salmonicolor ở mức dộ mạnh và rất mạnh
[5].
Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng nấm nội sinh thực vật
trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu đƣợc chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C.
albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.) thu đƣợc chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐTR3 cho hoạt tính kháng C. albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu
đƣợc chủng Trichoderma TT-L1 kháng C. albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu đƣợc

chủng Fusarium TR-T1 kháng C. albicans…[4].
Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học
các Hợp chất Thiên nhiên đã phân lập đƣợc rất nhiều nấm nội sinh, nhiều nhất ở lá (50
chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Thử
hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt
tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thƣ nhƣ mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6,
SHT9…Bằng phƣơng pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên đƣợc
4

14

chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fssa SHT46; Eupenicillium ehrlichii
SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Hợp chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc
dòng tế bào ung thƣ cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml. Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện
khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25 μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt
tính gây độc 2 dòng tế bào ung thƣ phổi và ung thƣ cơ vân với giá trị IC50 tƣơng ứng là
4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả
năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tƣơng đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng [35].
Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trƣờng nuôi cấy thích
hợp cho nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum đƣợc phân lập trên Thông đỏ (Taxus
wallichiana) tại vùng Lạc Dƣơng, Lâm Đồng và lƣợng taxol sinh ra ở môi trƣờng nuôi cấy là
250,98 mg/kg khối lƣợng khô [6].

15


CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc.
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.
Mẫu củ, thân, lá nghệ vàng tƣơi.
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc.
Dụng cụ hóa chất cho phân lập nấm nội sinh trong thực vật.
- Bình tam giác sạch.

- Đèn cồn

- Giấy bạc

- Box cấy

- Que cấy, que trang.

- Môi trƣờng

- Cốc thủy tinh 500 ml

- Agar

- Dao mổ, panh gắp.

- Malt extract

- Khăn vuông sạch, giấy thấm sạch.

- Chloramphenicol

- Đĩa petri đã đƣợc khử trùng.

- Nƣớc cất.

- Pipet malt.

- Cồn 70%

- Parafilm.

…

- Bình xịt có chứa cồn.
Dụng cụ, hóa chất, dung môi cho tách chiết các hợp chất trong nấm nội
sinh.

- Bình cô quay các loại

- Bản mỏng tráng silica gel Merck

- Bình tam giác các loại

(Darmstadt, CHLB Đức) Alufolien

- Phễu lọc, phễu chiết.

60 F254 chiều dày 0.2 mm trên nền

- Giấy lọc

nhôm.

- Cột sắc ký

- Máy cô quay chân không

- Bình tam giác các loại

- Máy khuấy

- Ống nghiệm các loại

- Máy hứng phân đoạn

- Sephadex LH-20

- Máy siêu âm

- Silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm

...

16


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp thu hái mẫu thực vật.
Mẫu cây thu đƣợc xác định tên khoa học dựa dựa theo những tên gọi dân gian,
những mô tả về hình thái của thực vật, các đặc điểm hoa, quả, hạt (nếu có) và các bộ
phận khác, để từ đó có cơ sở đem so sánh với khóa phân loại hoặc các tài liệu tham
khảo chuyên biệt để xác định tên khoa học thực
vật.
Chọn những cây trung tuổi, khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay các
biểu hiện bệnh nhƣ đốm lá, úng lá… Thu tất cả các bộ phận của cây nghệ nhƣ: củ, rễ, thân,

lá. Các bộ phận thu hái đƣợc tiến hành cắt gọn tùy theo đặc điểm cấu tạo của bộ phận để
dễ dàng rửa sạch mẫu. Rửa sạch đất, bụi bẩn trên các mẫu thu hái. Mẫu đƣợc phân loại
theo các bộ phận thu hái tránh bị gẫy và dập nát gây tổn thƣơng các lớp tế bào mô và tế
bào biểu bì ảnh hƣởng đến sức sống của vi sinh vật sống nội sinh trong cây.
2.2.2. Phương pháp phân lập nấm nội sinh trong thực vật.
Chuẩn bị môi trường:
Công thức môi trƣờng: Agar 15g, malt extract 15g, chloramphenicol
0,2g, nƣớc cất 1l.
Môi trƣờng đƣợc đem đi khử trùng ở 121ᴼC trong 20 phút. Sau khi khử trùng xong
lấy ra cho vào tủ hút đã lau sạch bằng cồn, bật đèn UV 15 phút. Môi trƣờng nguội đến
50ᴼC - 60ᴼC xoay nhẹ cho nó phân tán đều, rót ra đĩa
petri.

Khử trùng mẫu thực vật:
Sau khi xử lý sơ bộ các mẫu cây bằng cách xịt cồn 70% trƣớc khi đƣa vào box cấy.
Các mẫu đƣợc cắt nhỏ theo cấu tạo của các bộ phận mẫu cây và ngâm ngập trong cốc cồn
70% trong 90-120 giây sau đó chuyển mẫu sang cốc nƣớc thanh trùng ngâm ngập trong
120 giây. Mẫu khử trùng xong đƣợc để ráo tự nhiên hoặc đặt trên giấy/khăn lau đã khử
trùng.


Phân lập nấm và theo dõi thí nghiệm:
Kiểm tra công thức khử trùng (độ sạch của mẫu nghệ dùng để phân lập nấm) bằng
cách: Quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên trên bề mặt thạch (mẫu đối chứng).
Xử lý mẫu đã khử trùng: Dùng panh và dao sắc cắt nhỏ, cắt lát các mẫu nghệ rồi

tiến hành đặt mẫu đã cắt lên bề mặt đĩa thạch. Mỗi đĩa khoảng 4-5 mẫu cây đã cắt lên môi
trƣờng thạch (mẫu thí nghiệm/mẫu phân lập).
Đĩa thạch đối chứng và mẫu thí nghiệm đƣợc bọc kín bằng paraffin. Tiến hành
O
nuôi mẫu trong điều kiện 22 - 25 C. Sau 48h có thể kiểm tra mẫu : Mẫu đối chứng
không có gì (vi sinh vật không xuất hiện trên môi
trƣờng nuôi cấy) chứng tỏ khử trùng mẫu đã sạch.
Mẫu đối chứng có dấu hiệu nấm phát triển chứng tỏ khử trùng mẫu
chƣa sạch cần tiến hành lại thí nghiệm với loại mẫu này.
Cấy chuyển và làm sạch các chủng nấm:
Theo dõi sự phát triển của nấm nội sinh trong khoảng từ 1-2 tuần. Nấm nội sinh
đƣợc phân biệt với các nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của khóm nấm và khóm vi

khuẩn.
Sau đó cấy chuyền nấm nội sinh sang môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp mới. Khi
xuất hiện các sợi nấm mọc trên đĩa thạch cần tiến hành cấy chuyển luôn, tránh hiện tƣợng
mọc lẫn nhau của 2 hay nhiều chủng nấm. Từ đó phân biệt các chủng giống khác nhau, ký
hiệu chủng.
2.2.3. Phương pháp bảo quản nấm.
Phương pháp cấy truyền:
Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm
sợi đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ
cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ đƣợc bảo quản theo
các cách khác nhau:
O

Các ống thạch đƣợc để trong tủ lạnh (4-7 C).

17


Bảo quản trong thạch dƣới lớp dầu: Các ống thạch đƣợc bảo quản dƣới lớp dầu
O
parafin có tỷ trọng tƣơng đối là 0.83- 0.89 đã đƣợc khử trùng ở nhiệt độ 121 C trong 15
O
phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20 C.
Bảo quản trong nƣớc, nấm sợi đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch đĩa. Sau khi sợi
2

phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thƣớc khoảng 6 mm và cho vào lọ
nƣớc đã thanh trùng, bảo quản tại nhiệt độ phòng.
Một số phương pháp khác:
Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel, bảo quản nấm sợi có bào tử theo
phƣơng pháp đông khô, bảo quản nấm sợi bằng phƣơng pháp đông khô trực tiếp.
2.2.4. Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái.
Tên khoa học của các chủng nấm nội sinh cho chất biến dƣỡng ra môi trƣờng có
tác động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… sẽ đƣợc xác định đến mức chi dựa
trên các đặc điểm của nấm.
Các qui tắc chính trong định danh
Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn vi sinh vật khác). Sử dụng
môi trƣờng nuôi cấy có thành phần phù hợp.

Quan sát và ghi lại các đặc điểm phân loại của chủng nấm cần định danh (đặc
điểm khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học…).
Dùng chuyên luận các nhóm phân loại để định loại nấm đến mức chi.
Kiểm tra chủng nấm đã định danh với chủng nấm có trong bộ sƣu tầm
mẫu.
Viết tên các nhóm phân loại đúng với danh pháp quốc tế.
Quan sát các đặc điểm khuẩn lạc
Dùng que cấy, cấy điểm chủng nấm cần nghiên cứu vào môi trƣờng
O
thạch đĩa LCA, PDA. Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ ấm 25 C, trong 7-14 (30)

18