Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây tỏa dương (balanophora laxiflora hemsl , họ dó đất balanophoraceae) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG
VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ
ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN
THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG
VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ
ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN
THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 8720205
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Thùy Dương
2. PGS.TS. Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
tới TS. Nguyễn Thùy Dương, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà
Nội, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn
này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đỗ Thị Hà và NCS. Nguyễn
Thị Hồng Anh, khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu đã chỉ bảo và giúp đỡ
tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật
viên, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực,
trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi
thực hiện và hoàn thiện luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã
luôn đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày 22 tháng 3 năm 2018

Nguyễn Thị Thắm


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu ..................................................................... 2
1.1.1. Tên khoa học ..................................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học .......................................................................................... 2
1.1.4. Công dụng ......................................................................................................... 7
1.1.5. Tác dụng dược lý............................................................................................... 8
1.2. Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm ........................ 11
1.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vitro...................................... 11
1.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo ................................ 13
1.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo.............................. 15
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT
LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………..20
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................. 19
2.1.1. Động vật nghiên cứu ....................................................................................... 19
2.1.2. Dược liệu nghiên cứu ...................................................................................... 19
2.1.3. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ............................................................................... 19
2.1.4. Hóa chất thuốc thử .......................................................................................... 20
2.1.5. Máy móc, thiết bị, dụng cụ.............................................................................. 20
2.2. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................................ 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 22
2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do, chống oxy hóa .................... 22
2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân
đoạn và chất phân lập ................................................................................................ 23
2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo ...................................... 24
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 28
Chương 3 . KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 29
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do ........................................................... 29

3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro của các phân đoạn tỏa
dương......................................................................................................................... 29
3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid anion (O2-•) in vitro của
các phân đoạn tỏa dương ........................................................................................... 30
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và
chất phân lập ............................................................................................................. 31
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân
đoạn…………………………………………………………………………...……31
3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các chất phân
lập………. ................................................................................................................. 34
3.3. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm in vivo các phân đoạn và chất phân lập
tiềm năng của tỏa dương. .......................................................................................... 36
3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp của các phân đoạn và chất phân
lập tiềm năng của tỏa dương trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng
carrageenan................................................................................................................ 36
3.3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm mạn của các phân đoạn và chất phân
lập tiềm năng trên mô hình gây u hạt bằng bông ...................................................... 38
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 41
4.1. Về tác dụng quét gốc tự do của các phân đoạn tỏa dương. ................................ 41
4.2. Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn và chất phân
lập............ .................................................................................................................. 42
4.2.1. Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các phân đoạn ...................... 42
4.2.2. Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro của các chất phân lập ................. 43
4.3. Về tác dụng chống viêm in vivo của các phân đoạn và chất phân lập ............... 44
4.3.1. Về tác dụng chống viêm cấp in vivo của các phân đoạn và chất phân lập tiềm
năng trên mô hình gây phù bằng carrageenan........................................................... 45
4.3.2. Về tác dụng chống viêm mạn in vivo của các phân đoạn và chất phân lập
tiềm năng trên mô hình gây u hạt .............................................................................. 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Ý nghĩa

A

Aceton

Ac

Acid acetic

ALT

Alanine aminotransferase

AST

Aspartate transaminase

COX

Enzym cyclooxygenase

CTCT

Công thức cấu tạo

D

Dichloromethan

DCGGP

1,3-di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-glucopyranose

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DPPH

1,1-Dimethyl-2-picryl hydrazyl

ED50

Effective dose 50% (liều có tác dụng 50%)

EDTA

Ethylene Diamine Triacetic Acid

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

HPLC

High Performance Liquid Chromatograph (sắc ký hiệu năng cao)

Hx

n-Hexan

IC50

Inhibitory concentration 50% (nồng độ ức chế 50%)

iNOS

NO synthase cảm ứng

IR

InfraRed (Tia hồng ngoại)

LPS

Lypopolysacharid

MeOH

Methanol

NF- kB

Nuclear factor –kappa B (Yếu tố sao chép nhân)

NMR

NMR-Nuclear Magnetic Resonance:
phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NTB

Nitro blue tetrazolium

PG

Prostaglandin


ROS

Reactive oxygen species (Các dạng oxy phản ứng)

SE

Standard Error (sai số chuẩn)

SOD

Superoxide

TCGP

1,2,6-tri-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose

TGGP

1, 2, 6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose

TNF

Tumor necrosis factor

UV

Ultra-violet (tia cực tím)

W

Water (nước)

X

X-ray


Danh mục các bảng

Tên bảng

STT
1

Bảng 1.1

2

Bảng 1.2

3

Bảng 2.1

4

Bảng 3.1

CTCT và tên khoa học của 19 hợp chất đã phân lập.
Tóm tắt tác dụng dược lý của các loài trong chi
Balanophora.
Hàm ẩm và hiệu suất của cao toàn phần và các phân
đoạn của tỏa dương.
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các
phân đoạn.

5

Bảng 3.2

6

Bảng 3.3

7

Bảng 3.4

Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD của các phân
đoạn
Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro
của các phân đoạn.
Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro
của các chất phân lập.

Trang
3

13

21

30

31

33

36

Ảnh hưởng của các chất phân lập và các phân đoạn

8

Bảng 3.5

tiềm năng đến mức độ phù của chân chuột (%) theo

38

thời gian.
Ảnh hưởng của các chất phân lập và các phân đoạn
9

Bảng 3.6

tiềm năng đến khối lượng u hạt trên chuột cống
trắng.

40


Danh mục các hình vẽ, đồ thị.

Tên hình, tên sơ đồ

STT
1

Hình 2.1

2

Hình 2.2

3

Hình 2.3

Hình ảnh cây tỏa dương (Balanophora laxiflora
Hemsl.).
Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu.
Qui trình thí nghiệm đánh gía khả năng ức chế
enzym COX-2 in vitro.

Trang
20

22

25

Qui trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống
4

Hình 2.4

viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột

26

bằng carrageenan.

Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống

5

Hình 2.5

6

Hình 3.1

7

Hình 3.2

Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc

34

Hình 3.3

Công thức cấu tạo của các chất phân lập từ phân
đoạn EtOAc.

35

8

viêm mạn bằng mô hình gây u hạt.
Khả năng ức chế enzym COX- 2 in vitro của các
phân đoạn tỏa dương.

28

32


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., họ Dó đất Balanophoraceae) hay
còn gọi là ngọc cẩu, củ gió đất, củ ngọt núi, hoa đất, cu chó, cây không lá, xà cô là
một dược liệu quý được phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào và Việt
Nam [5], [7]. Trong dân gian từ lâu đã được sử dụng để điều trị các chứng nhức
mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung, trĩ, yếu sinh lý nam, liệt
dương, di tinh, mộng tinh và làm thuốc bổ cho người già, người mới ốm dậy, phụ
nữ sau khi sinh [5], [7], [11].
Trên thế giới đã có những nghiên cứu cho thấy một số cây trong họ Dó đất
Balanophoraceae có tác dụng chống viêm [20], [54], [66]. Năm 2011, tác giả Wen
F.C. đã chỉ ra tác dụng chống viêm của các cao chiết và các chất phân lập từ các
cao chiết loài B. laxiflora [66]. Ngoài tác dụng chống viêm, một số nghiên cứu
khác cũng cho thấy chi Balanophora có nhiều hợp chất có tác dụng chống oxy hóa
trong đó các hợp chất tannin có tác dụng rất tốt [23]. Năm 2009, tác giả She G.M
và các cộng sự đã chỉ ra tác dụng dọn gốc tự do DPPH của cao chiết và các hợp
chất phân lập từ các cao chiết B. laxiflora [57]. Những năm sau đó, tác giả Ho S.T
đã chỉ ra tác dụng dọn gốc tự do DPPH, superoxid anion của các cao chiết hoa

B.

laxiflora đồng thời đánh giá được tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid của
hoa đực B. laxiflora tốt hơn hoa cái [31]. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nghiên
cứu dược lý đánh giá tác dụng chống viêm của cây tỏa dương và các nghiên cứu
hóa thực vật dựa theo định hướng tác dụng sinh học của cây tỏa dương còn hạn

chế. Do vậy, để cung cấp bằng chứng khoa học đối với dược liệu này. Chúng tôi
thưc hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây tỏa dương
(Balanophora laxiflora Hemsl., Họ Dó đất Balanophoraceae) trên thực
nghiệm” với 2 mục tiêu như sau:.
1. Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do, chống oxy hóa, chống viêm in vitro của
các phân đoạn và các chất phân lập từ cao chiết tỏa dương.
2. Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của phân đoạn tiềm năng và chất
phân lập tiềm năng.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu
1.1.1. Tên khoa học
Tỏa dương còn có tên khác là Nấm đất (Dó đất, Ngọc cẩu, Cu chó, Dó đất hoa
thưa). Tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl., thuộc họ Dó đất
(Balanophoraceae) [4], [5], [7], [11].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây cỏ mập, sống kí sinh trên rễ, màu nâu đỏ, cao 10-20 cm, không có diệp
lục. “Củ” hình trứng, đường kính 2-2,5 cm, bề mặt sần sùi và có mụn hình sao nổi
rõ. Thân khí sinh (là cuống cụm hoa) mang 5-10 lá dạng vảy ở phía gốc; phiến lá
hình mũi mác, cỡ 2-2,5 × 1-1,5 cm. Hoa đơn tính khác gốc, hợp thành cụm hoa
hình bông nạc. Cụm hoa đực hình trụ, gồm những hoa gần như không cuống; bao
gồm 6 mảnh, trong đó 2 mảnh giữ (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh
bên hình trái xoan tròn đầu; khối phấn bị ép ngang. Hoa cái hình bầu dục thuôn;
không có bao hoa, mọc ở quanh chân của vảy bảo vệ; vảy hình trứng lõm ở đỉnh;
1 vòi nhụy. Hoa nở vào tháng 10 – 12. Cây mọc rải rác trong rừng cây lá rộng, nơi
ẩm, ở độ cao 600-2000 m, thường kí sinh trên rễ cây gỗ và cây bụi như đỗ quyên,
sồi, thông. Tái sinh bằng đẻ nhánh [5], [7], [11]. Trên thế giới, tỏa dương phân bố ở

Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào. Tại Việt Nam, tỏa dương có ở các tỉnh Cao
Bằng, Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Ngọc Guga, Ngọc Pan), Lào Cai [4],
[5].
1.1.3. Thành phần hóa học
1.1.3.1. Những nghiên cứu nước ngoài
Năm 2009, tác giả She G.M và cộng sự đã công bố, trong cao chiết tỏa
dương đã phân lập 19 hợp chất gồm: các balaxiflorin A và B, 3 hợp chất
phenylpropanoid, 4 hợp chất lignan, 9 hợp chất tannin thủy phân, và acid gallic
được thể hiện dưới bảng 1.1 [57].

2


Bảng 1.1. CTCT và tên khoa học của 19 hợp chất đã phân lập [57].
STT Tên hoạt chất
(1)

(7'-S,8R,

Công thức hóa học

8'-R)-9-O-

Galloyllariciresinol-4'O-β-D-glucopyranosid

R= Gal
(2)

6-O-(E)-Caffeoyl
coniferin

(3)

Coniferin

(4)

Lariciresinol-4-O-β-D-

2.R=Caf

glucopyranosid

R=H
(5)

Pinoresinol-O-β-Dglucopyranosid

3

3. R=H


(6)

Isolariciresinol

(7)

Isolariciresinol-4-O-β-

6.R=H

7. R=Glc

D-glucopyranosid
(8)

3-O-Galloyl-β-Dglucopyranosid

8. R1 =Gal, R2=H
(9)

6-O-Galloyl-β-D-

9. R1=H, R2=Gal

glucopyranosid
(10)

1-O-[(E)-Caffeoyl]-3-

Ghi chú

O-galloyl-4,6-[

(11)

(12)

R1

R2

R3

R4

(S)-HHDP]-β-D-

10

Caf

H

Gal

(S)-HHDP

glucopyranosid

11

Gal

H

Gal

(S)-HHDP

1,3-Di-O-galloyl-4,6-

12

Caf

H

H

Gal

Gal

[(S)-HHDP]-β-D-

13

Gal

Gal

H

H

Gal

glucopyranosid

14

Caf

H

Cal

(S)-HHDP

1-O-[(E)-Caffeoyl]-

15

Caf

H

H

H

H

16

Gal

H

Gal

H

H

4,6-di-O-galloyl-β-Dglucopyranosid
(13)

R5

1,2,6-Tri-O-galloyl-βD-glucopyranosid

4


(14)

1,3-Di-O-[(E)caffeoyl]-4,6-[(S)HHDP]-β-Dglucopyranosid

(15)

1-O-[(E)-Caffeoyl]-βD-glucopyranosid

(16)

1,3-Di-O-galloyl-β-Dglucopyranosid

(17)

Acid caffeic

(18)

Acid coumaric

(19)

Acid gallic

Ghi chú:

5


Năm 2012, tác giả Ho S.T và cộng sự đã phân lập 4 hợp chất từ phân đoạn
EtOAc của tỏa dương gồm [30]:
1-O-(E)-Caffeoyl-β-D-glucopyranosid (20).
1-O-(E)-p-Coumaroyl-β-D-glucopyranosid (21).
1,3-di-O-Galloyl-4,6-(S)-hexanhydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranosid (22).
1-O-(E)-Caffeoyl-4,6-(S)-hexanhydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranosid (23).
1.1.3.2. Những nghiên cứu trong nước.
Năm 2014, tác giả Cầm Thị Ính và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất
pinoresinol (24), daucosterol (25), từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) [9].

(25)

(24)

Năm 2015, tác giả Đỗ Thị Hà và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất
triterpenoids từ cao chiết ethanol cây tỏa dương bao gồm: lupeol (26), β- amyrin
(27), β-sitosterol (28), (21β)-22-hydroxyhopan-3-one (29), daucosterol (25) và
(21α)-22-hydroxyhopan-3-one (30). Trong đó hợp chất (26), (29) (30) lần đầu tiên
được công bố từ loài Balanophora laxiflora [27].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Quyết Tiến và cộng sự đã phân lập được 6 hợp
chất bằng sắc ký cột từ các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và dichlomethan của
cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.). Kết hợp các phương pháp phổ hồng
ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, và so
sánh dữ liệu phổ của chúng với tài liệu đã được công bố, đã xác định được cấu trúc
hóa học của chúng là 1-hexacosanoylglycerol (31), daucosterol (25), methyl gallat
(32), 4-hydroxyl-3-methoxycinnamaldehyd (33), methyl-4-hydroxy cinnamat (34)
và methyl caffeat (35) [15].
Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã phân lập được một
chalcon mới với 8 hợp chất khác từ cao chiết ethyl acetat của cây tỏa dương:

6


Balanochalcon (36), methyl caffeat (35), β-hydroxydihydrochalcon (37), methyl
gallat (32), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo (38), xanthen-1,2-dicarboxylat (39)
acid p-coumaric (40), quercetin (41), scopoletin (42) và pinoresinol (43) [53].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự đã phân lập được 4 hợp
chất phenolic từ cặn ethyl acetat của cây tỏa dương. Bốn hợp chất đã được phân lập
bao gồm epoxyconiferyl alcohol (44), salicifoliol (45), 5-(hydroxymethyl)-2furaldehyd (46) và ethyl caffeat (47). Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu
tiên từ loài này. Hợp chất (44), (45) và (46) được công bố lần đầu tiên từ
chi Balanophora [1]. Sau đó, trong một công trình công bố cùng năm 2017, tác giả
Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự tiếp tục phân lập được sáu hợp chất từ phân
đoạn nước của cây tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) bao gồm:

isolariciresinol

4-O-β-D-glucopyranosid

glucopyranosid

(49),

(48),

lariciresinol-4-O-β-D-

secoisolariciresinol-9′-O-β-D-glucopyranosid

secoisolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid

(51),

(50),

1-O-E-caffeoyl-β-D-

glucopyranose (52) và coniferin (53). Trong đó, các hợp chất (48), (49),
(50) và (51) lần đầu tiên được công bố phân lập từ loài B. laxiflora [2].
1.1.4. Công dụng
Ở Lào, người ta dùng củ để chế một loại nhựa dính dùng bẫy chim. Cây cũng
được dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe, kích thích ăn ngon miệng, chữa
đau bụng, chữa nhức mỏi chân tay, nhất là dùng cho phụ nữ sau khi đẻ. Ở Vân
Nam (Trung Quốc), toàn cây được dùng trị hư lao xuất huyết, đau lưng, trĩ, di tinh,
mông tinh, yếu sinh lý nam. Dạng dùng thông thường là thuốc rượu. Cây hái về rửa

sạch, thái mỏng sao qua, rồi ngâm rượu tỷ lệ 1:5, trong một tháng hoặc càng lâu
càng tốt [5], [7], [10], [11]. Một số bài thuốc sử dụng cây tỏa dương chữa bệnh trong
dân gian như [5], [10]:
+ Bài thuốc giúp phục hồi sức khỏe phụ nữ sau sinh: Tỏa dương 15 - 20 g, ích
mẫu thảo khô 30 g.
+ Bài thuốc chữa nam sinh lý yếu: Tỏa dương 100g, rễ đinh lăng 100g, ba kích
80g, dâm dương hoắc (sao với mỡ dê) 50g, đương quy 50g, hà thủ ô đỏ 50g, câu kỷ tử
50g, thục địa 50g, bạch truật 50g, trần bì 30g.

7


+ Bài thuốc chữa liệt dương: Tỏa dương 12g, thục địa 15g, sơn thù 15g, sơn dược
15g, phục linh 12g, câu kỷ tử 15g, nhục thung dung 12g, dâm dương hoắc 30g, ba
kích 12g, bạch nhân sâm 12g, lộc nhung 6g, táo nhân (sao) 12g, thỏ ty tử 12g, thiên
môn đông 9g, cam thảo 9g.
+ Bài thuốc bổ thận tráng dương: Tỏa dương 15 g, nhân sâm 12 g, hoàng kỳ
16 g, đỗ trọng 16 g, nhục thung dung 8 g, thỏ ty tử 12 g, xa sàng tử 12 g, phúc bồn tử
12 g, đương quy 12 g, bạch truật 12 g, thục địa 16 g, ba kích 12 g, dâm dương hoắc
12 g, lộc nhung 12 g, câu kỷ tử 12 g, đại táo 5 quả, long nhãn 10 g, cam thảo 6 g,
xuyên khung 8 g, hà thủ ô đỏ 12 g.
1.1.5. Tác dụng dược lý
 Chống viêm in vitro
Năm 2011, tác giả Chiou W.F và cộng sự đã công bố kết quả thử tác dụng
chống viêm của cao chiết cây tỏa dương. Kết quả cho thấy các phân đoạn n-hexan,
EtOAc, BuOH đều thể hiện tác dụng ức chế hình thành NO với giá trị IC50 lần lượt
là 28; 85; 2,44 và 1,56 μg/mL. Từ các phân đoạn này phân lập được 18 chất tinh
khiết trong đó có 2 hợp chất là isolariciresinol và ethyl caffeat trong cây tỏa dương
có tác dụng ức chế sự hình thành NO với giá trị IC50 lần lượt là 0,81 và 7,29 μM.
Đặc biệt isolariciresinol ức chế sự hình thành của NO và cả TNF-α với giá trị IC50

lần lượt là 17,8 và 123,8 μM. Điều này có thể cho thấy isolariciresinol có thể có
ứng dụng đối với các bệnh liên quan tới viêm [66].
 Tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự do:
Năm 2009, tác giả She G.M và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học
và hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được từ loài B. laxiflora
thông qua thí nghiệm đánh giá tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy,
19 chất phân lập được đều có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH, trong đó nhóm các
hợp chất tanin có hoạt tính cao hơn hẳn các hợp chất khác. Trong cùng một nhóm
hợp chất acid phenolic hợp chất càng nhiều nhóm hydroxyl (OH) thì hoạt tính càng
mạnh [57].
Năm 2011, Ho S.T và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các
phân đoạn EtOAc, butanol và nước loài B.laxiflora. Thí nghiệm đã chứng minh

8


phân đoạn EtOAc ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 µg/ml của hoa đực có hoạt tính
thu dọn gốc tự do DPPH và gốc tự do superoxid tốt hơn so với hoa cái với giá trị
IC50 của hoa đực trên 2 thử nghiệm này lần lượt tương ứng là 6,0 và 5,4 µg/ml
trong khi giá trị IC50 của hoa cái trên 2 thử nghiệm này lần lượt tương ứng là 6,4 và
17,0 µg/ml [30], [31].
Năm 2017, tác giả Đặng Ngọc Quang và các cộng sự đã phân lập được 8 chất
và thử tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đó qua thử nghiệm đánh giá
tác dụng dọn gốc tự do DPPH. Kết quả cho thấy, 2 hợp chất (36) và (38) có hoạt
tính chống oxy hoá [53].
 Tác dụng hạ acid uric máu và ức chế xanthin oxidase
Năm 2012, tác giả Ho.S.T và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết
thanh của cao chiết EtOAc tỏa dương và các chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn
này trên mô hình gây tăng acid uric bằng kali oxonat. Kết quả cho thấy phân đoạn
EtOAc và các chất phân lập gồm (22) và (23) có tác dụng giảm acid uric huyết

thanh. Đánh giá khả năng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn
và các chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn tiềm năng của tỏa dương cho thấy giá
trị IC50 của cao toàn phần và phân đoạn EtOAc tương ứng là 28,2 µg/ml và
14,2 µg/ml [30].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Thùy Dương và các cộng sự đã đánh giá tác dụng
hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin oxidase của tỏa dương trên chuột
nhắt trắng dựa trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat. Kết quả cho
thấy cao toàn phần tỏa dương với liều 300 mg/kg/ngày, uống liên tục trong 5 ngày
có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm.
Ngoài ra, cao toàn phần toả dương với liều này thể hiện khả năng ức chế hoạt độ
xanthin oxidase ở gan chuột nhắt trắng, gợi ý cho cơ chế tác dụng hạ acid uric của
tỏa dương [8]. Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Hồng Anh và các cộng sự đã sàng
lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn và chất phân lập từ
tỏa dương. Kết quả cho thấy phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng vượt trội trong số
các phân đoạn thử và khi so sánh với cao toàn phần. Trong số 4 hợp chất phân lập

9


từ phân đoạn này, BLE1 ((21α)-22-hydroxyhopan-3-on) thể hiện tác dụng ức chế
xanthin oxidase và theo cơ chế ức chế không cạnh tranh [3].
 Tác dụng tăng cường chức năng sinh dục nam
Năm 2015, tác giả Nguyễn Thanh Hương và cộng sự nghiên cứu về hoạt tính
androgen của cao lỏng tỏa dương (B. laxiflora) trên chuột cống đực non thiến và
chuột cống đực trưởng thành. Kết quả cho thấy cao lỏng tỏa dương thể hiện hoạt
tính androgen rõ rệt thông qua việc tăng nồng độ testosteron máu và khối lượng các
cơ quan sinh dục phụ. Tác dụng androgen của cao lỏng tỏa dương phụ thuộc liều,
liều thấp (0,28 g/kg) làm tăng khối lượng tinh hoàn và nồng độ testosteron trên
chuột cống đực trưởng thành, nhưng không làm tăng khối lượng các cơ quan sinh
dục phụ trên chuột cống đực non thiến. Ở liều cao (1,4 g/kg) cao lỏng tỏa dương

làm tăng cả khối lượng tinh hoàn và bao quy đầu trên chuột cống đực trưởng thành
và cả cả khối lượng túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn trong chuột cống đực
non thiến [12]. Khi đánh giá ảnh hưởng của cao chiết nước tỏa dương lên hành vi
tình dục chuột cống đực trưởng thành, cao tỏa dương ở các mức liều 0,28 g/kg;
1,4 g/kg; 2,8 g/kg làm tăng ham muốn tình dục, tăng hiệu quả giao cấu. Tác dụng
này phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc, khi sử dụng với liều lặp lại sau 10 ngày
hiệu quả trên các hoạt động tình dục thể hiện rõ rệt hơn khi sử dụng liều đơn sau 15
phút dùng thuốc [13].
 Tác dụng gây độc tính tế bào ung thư:
Năm 2017, Đặng Ngọc Quang và các cộng sự đã chỉ ra hợp chất (35) và (38)
cho thấy có độc tính tế bào ở mức trung bình đối với bốn dòng tế bào ung thư: KB
(ung thư biểu bì ở người), MCF7 (ung thư vú ở người), SK-LU-1 (ung thư phổi
người) và HepG2 (ung thư biểu mô tế bào) [9], [53].

10


1.2. Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm
1.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vitro
 Phương pháp gây kết tập bạch cầu đa nhân
Khi cho các tác nhân gây viêm vào cơ thể, chúng sẽ tạo ra các chất hóa ứng
động thu hút và tập trung bạch cầu tới nơi có các chất hóa ứng động. Sự có mặt quá
nhiều bạch cầu sẽ làm khuyếch đại phản ứng viêm gây ra những tổn thương trầm
trọng cho mô và cơ thể. Trong mô hình này sử dụng chất hóa ứng động là bạch cầu
Formyl –L- methionyl –L-leucyl- L- phenylamin (FMLP). Hỗn dịch tế bào được ủ
với thuốc thử 10 phút, sau đó trộn với chất hóa ứng động để gây kết tập bạch cầu.
Thông số đánh giá là sự kết tập bạch cầu của nhóm thử và chứng [26], [44].
 Phương pháp gây hóa ứng động đại thực bào
Mô hình sử dụng chất gây hóa ứng động đại thực bào và qua đó đánh giá khả
năng ức chế hóa ứng động đại thực bào của thuốc. Các tế bào từ dịch rỉ màng bụng

được tạo ra sau khi tiêm thioglycollat 4 ngày được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ 37 0C và
5% CO2. Các đại thực bào bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy, các tế bào không bám sẽ
bị rửa bằng nước muối sinh lý. Thông số đánh giá là số lượng đại thực bào của mẫu
thử và mẫu chứng [26], [44].
 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym cyclooxygenase (COX)
Acid arachidonic sẽ chuyển thành PGH2 sau phản ứng được xúc tác bởi
enzym cyclooxygenase (COX), PGH2 tạo ra được khử hóa bởi SnCl2 tạo PGF2α là
chủ yếu. Các prostaglandin tạo thành được gắn với kháng huyết thanh và chất đánh
dấu. Đo độ hấp thụ quang của phức hợp kháng huyết thanh-prostaglandin-chất
đánh dấu ở bước sóng 405 nm. Nếu chất càng ức chế COX, prostaglandin thu được
càng ít và do đó độ hấp thụ đo được thấp. Thông số đánh giá là giá trị nồng độ mà
tại đó thuốc thử ức chế 50% sự tạo thành PGF2α trong hỗn hợp phản ứng so mẫu
chứng [37], [49].
 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym Lypoxygenase (LOX)
Khi tiếp xúc với acid béo chưa no, LOX sẽ xúc tác oxy hóa các acid này để
tạo thành chất có nhiều liên kết đôi trong phân tử. Do đó, độ hấp thụ của dung dịch
ở bước sóng 234 nm sẽ tăng lên. Nếu chất nào có khả năng ức chế LOX sẽ làm

11


giảm độ hấp thụ của mẫu khi đo quang. Đo độ hấp thụ quang của sản phẩm tạo ra
sẽ xác định được khả năng ức chế LOX của mẫu cần thử.. Thông số đánh giá là giá
trị nồng độ mà tại đó thuốc thử ức chế 50% sự tạo thành sản phẩm oxy hóa của acid
linoleic trong hỗn hợp phản ứng so mẫu chứng [44], [59].
 Phương pháp tạo các eicosanoid từ tế bào tiểu cầu
Eicosanoid là tên gọi chung cho các sản phẩm chuyển hóa của acid
arachidonic, bao gồm prostagladin, leucotrien, thromboxane. Prostagladin gây tăng
tính thấm thành mạch, gây phù, ban đỏ, gây đau. Leucotrien có tính hóa ứng dộng
bạch cầu, kích thích bám dính tế bào bạch cầu vào tế bào nội mô… Thromboxan

kích thích sự kết hợp tiểu cầu. Do đó ức chế sự hình thành các chất này là một cơ
chế chống viêm quan trọng. Dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase, acid
arachidonic sẽ tạo thành PGE và thromboxan A2. Một thuốc có tác dụng ức chế
enzym COX sẽ ức chế tạo thành các sản phẩm chuyển hóa đó. Thông số đánh giá là
sự tạo thành Thromboxan A2 và PGE2 của mẫu thử và chứng [26], [44].
 Phương pháp tạo prostaglandin ở bạch cầu đa nhân trung tính
Phương pháp sử dụng LPS để kích thích tạo PGE2. Cách tiến hành do
Herrmann và cộng sự đề xuất lần đầu (1990), sau đó Weihmann và cộng sự cải tiến
năm 1994. Các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính ủ với LPS và thuốc thử trong 18
giờ. Thêm chất mang là ion calci và ly tâm. PGE2 tạo thành nằm trong phần dịch
nổi phía trên được xác định bằng kit ELISA. Thông số đánh giá là nồng độ PGE2
của mẫu thử so với chứng [26], [44].
 Phương pháp gây viêm bằng LPS trong đại thực bào RAW 264.7
Các chất chống viêm làm giảm sản xuất các enzym và chất trung gian hóa
học như: NO, PGE2, COX-2, IL-1 và TNF-α.... Do đó, mức độ biểu hiện trên của
các enzym và các chất trung gian hóa học này giảm. Phương pháp được tiến hành
dựa theo phương pháp phân tích Western blot. Thông số đánh giá là tỷ lệ biểu hiện
trên gen đích của mẫu thử so với mẫu chứng được tính theo công thức của Livak
[26], [29], [32], [43], [44].

12


 Phương pháp gây giải phóng các cytokin từ tế bào bạch cầu
Các cytokin đại diện cho một nhóm các peptid có hoạt tính sinh học cao.
Chúng liên quan tới rất nhiều quá trình tế bào như phản ứng viêm, miễn dịch và
nhiều đáp ứng khác. Việc khóa các IL-1 và TNF-α đã giúp điều trị thành công bước
đầu trên các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp, viêm ruột. Mô hình gây giải phóng
cytokine được dùng để phát hiện các thuốc mà tác động với LPS trong quá trình
giải phóng cytokine từ tế bào bạch cầu đơn nhân. Thử nghiệm được tiến hành trong

đĩa 96 giếng rất nhỏ. Dùng kit Elisa để xác định nồng độ cytokin. Thông số đánh
giá là nồng độ cytokin của lô thử và chứng [26], [44].
1.2.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo
Một số mô hình đánh gía tác dụng chống viêm cấp in vivo được sử dụng hiện
nay như sau:
 Mô hình gây phù bàn chân chuột
Trong số nhiều mô hình được sử dụng để sàng lọc các thuốc chống viêm, một
trong những mô hình được sử dụng phổ biến nhất là dựa trên khả năng ức chế phù
ở bàn chân sau của chuột. Nhiều chất gây phù đã được sử dụng như men bia,
formaldehyd, dextran, albumin trứng, kaolin, aerosil, polysaccharid sulfat như
carrageenan hoặc naphthoylheparamin. Khi tiêm các chất này vào bàn chân chuột
kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học như histamine, prostaglandin,
serotonin…và kết quả gây phù. Thuốc có tác dụng ức chế phù được coi là có tác
dụng chống viêm [14], [18], [26], [34], [44], [51]. Thông số đánh giá là mức độ
phù bàn chân chuột được tính theo công thức:
v  [(vt  v0 ) / v0 ]x100

Trong đó v (%): Mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây
viêm; vt , v0 : Thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm và tại thời điểm t giờ sau
khi gây viêm.
 Mô hình gây phù bằng chấn thương
Khi tác động cơ học mạnh lên bàn chân chuột sẽ gây tổn thương mô và tế bào
chân chuột, hoạt hóa phospholipidase A2 gây giải phóng acid arachidonic từ
phospholipid màng. Acid arachidonic sẽ chuyển hóa thành prostaglandin nhờ

13


enzym COX và gây phù. Tác nhân cơ học mạnh được sử dụng là quả tạ 100g từ độ
cao 50 cm rơi xuống bàn chân chuột vào ngày thứ 5 sau khi uống thuốc. Thông số

đánh giá là mức độ phù của bàn chân chuột các lô tại thời điểm 1, 3, 5 giờ [14],
[26], [44].
 Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch
Các chất gây viêm kích thích giải phóng các chất trung gian như histamin,
prostaglandin, leucotrien sẽ làm giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành
mạch. Kết quả là dịch và protein huyết tương bị thoát ra gây phù. Các thuốc có tác
dụng ức chế tính thấm của thành mạch sẽ có tác dụng giảm phù và chống viêm.
Các chất thường dùng để gây tăng tính thấm thành mạch như: phenethylamin, acid
acetic, oxazolon. Thông số đánh giá là tỉ lệ ức chế sự thoát mạch của lô thử so với
lô chứng [26], [44].
 Mô hình gây viêm màng phổi
Trên động vật thí nghiệm bệnh viêm màng phổi có thể được gây ra bởi một số
chất kích thích như histamin, bradykinin, prostaglandin, degranulator, tế bào mast,
dextran, enzym, kháng nguyên, vi khuẩn, và chất kích thích không đặc hiệu như
dầu thông hay carrageenan. Viêm màng phổi gây ra bởi carrageenan ở chuột nhắt
được coi là một loại mô hình viêm cấp tính tốt trong đó sự thoát dịch, sự di chuyển
của bạch cầu và các chỉ số sinh hóa khác có liên quan tới viêm được đo dễ dàng
trong dịch rỉ. Chuột được tiêm carrageenan 2% vào khoang màng phổi và được
uống thuốc sau 1, 24, 48 giờ sau khi gây viêm. Sau gây viêm 72 giờ, hút hết dịch
màng phổi vào ống nghiệm và đo thể tích dịch. Thông số đánh giá là thể tích trung
bình của dịch hạch của các lô thử và lô chứng. Một số thông số khác có thể sử dụng
như: số lượng tế bào bạch cầu trong dịch rỉ, hoạt tính của enzym trong lyzoxom,
fibronectin, PGE2 [14], [26], [44].
 Mô hình gây ban đỏ
Mô hình này sử dụng tia UV và X là tác nhân gây ban đỏ. Thuốc đối chứng
là aspirin 240 mg/kg đường uống. Tia UV hoặc X được chiếu lên chuột 2 phút và
ban đỏ được xác định tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi chiếu tia UV hoặc X. Thông

14

số đánh giá là diện tích ban đỏ của chuột và tỷ lệ ức chế ban đỏ của lô thử so với lô
chứng [26], [44].
 Mô hình tạo túi u hạt
Mô hình tạo túi u hạt do Selye phát minh năm 1953 và được Robert và
Nezamis cải tiến năm 1957. Mô hình này sử dụng dầu ba đậu là chất kích thích gây
viêm cấp do tăng nhiều thể tích dịch thoát mạch. Dầu ba đậu 1% được tiêm vào túi
không khí ở vùng da giữa lưng. Sau 48 giờ rút không khí trong túi và cho chuột
uống thuốc hằng ngày. Hút hết dịch vào xilanh thủy tinh vào ngày thứ 5. Thông số
đánh giá là trung bình dịch thu được của các lô và tỉ lệ ức chế viêm của lô thử so
với chứng [14], [26].
1.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo
Hiện nay các phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo được
thực hiện dựa trên các mô hình sau:
 Mô hình gây u hạt
Khi đưa vào cơ thể tác nhân gây viêm trơ như bông, amian cơ thể phản ứng
bằng cách tập trung nhiều loại tế bào xung quanh dị thể và tạo thành u hạt. Tổ chức
này bị bao phủ bởi một lớp xơ bao gồm bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu hạt
ưa base, tế bào dạng biểu mô, nguyên bào sợi nên không đủ máu tưới đến, thuốc
khó thâm nhập vào nên việc điều trị thường khó khăn và lâu dài. Một thuốc có khả
năng ức chế u hạt đồng nghĩa thuốc có tác dụng chống viêm mạn tính. Các tác nhân
gây u hạt bao gồm bông, amian, tinh dầu thông, mảnh kính, bọt biển. Trong đó, tác
nhân gây u hạt bằng bông hiện nay được sử dụng phổ biến nhất. Thông số đánh giá
là mức độ tăng khối lượng u hạt tươi và u hạt khô của lô thử so với lô chứng [14],
[26], [40, [44].
 Mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Freund
Mô hình này tiến hành theo phương pháp của Newbould B(1963) [47]. Chất
bổ trợ là hỗn hợp các vi khuẩn Mycobacterium M đã chết được pha trong parafin
lỏng hoặc dầu thực vật. Khi tiêm nội bì dưới gan bàn chân chuột cống sẽ gây hội
chứng giống viêm khớp. Thông số đánh giá là tỉ lệ ức chế độ dày bàn chân chuột

15


trước và sau 13 ngày tiêm chất bổ trợ của lô thử so với chứng được tính theo công
thức:
I%= (b-x)/(a-y)x100
Trong đó b: độ dày chân phải chuột lô thử sau khi tiêm 13 ngày, x: độ dày
chân phải chuột lô thử trước khi tiêm, a: độ dày chân phải chuột lô chứng sau khi
tiêm 13 ngày, y: độ dày chân phải chuột lô chứng trước khi tiêm [14], [21], [47].
 Mô hình gây viêm đa khớp bằng Mycoplasma arthritis
Mô hình được tiến hành theo phương pháp của Ward và Russel (1962) [36].
khi, gây viêm đa khớp thông qua tiêm phúc mạc hỗn hợp dextran 6 % và dịch rỉ
chứa mycoplasma. Ở những khớp bị viêm da đỏ, nóng, sưng, phần mềm tăng thể
tích, đôi khi viêm tấy. Các triệu chứng này bắt đầu xuất hiện từ ngày 3-4, đạt mức
tối đa về cường độ và số lượng vào ngày thứ 9 và giảm dần từ ngày thứ 12-15, mất
hẳn vào ngày 20. Thông số đánh giá là các biểu hiện viêm trên chân trước và chân
sau của chuột lô thử và chứng và được đánh giá qua chỉ sô viêm là tổng các chỉ số
viêm khớp được theo dõi hằng ngày: điểm 0: bình thường, 1: ban đỏ nhẹ, 2: ban đỏ
và sưng, 3: sưng tấy giả [14], [44].
 Mô hình gây viêm đa khớp bằng chất sáp D phân lập từ trực khuẩn lao
Chất sáp D được phân tán trong Tween80, dầu parafin và NaCl 0,9 % và được
tiêm dưới da gan bàn chân phải chuột gây viêm khớp. Có 2 loại tổn thương khớp là
viêm khớp và viêm đa khớp. Viêm khớp xuất hiện sớm tại vị trí tiêm bao gồm các
triệu chứng phù và ban đỏ xuất hiện sau 24h và tăng lên khi xuất hiện viêm đa
khớp, Viêm đa khớp xuất hiện sau 10-25 ngày tiêm chất bổ trợ và đạt tối đa về
cường độ sau 10-15 ngày xuất hiện tại các chân và đuôi chuột. Thông số đánh giá
là mức độ phù bàn chân chuột và chỉ số viêm của 4 khớp bàn chân chuột [14], [26],
[44].

16