KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG Clostridium perfringens TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ
ĐỊNH LƯỢNG Clostridium perfringens TRONG THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HỒNG LOAN

Tháng 10/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ
ĐỊNH LƯỢNG Clostridium perfringens TRONG THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGUYỄN THỊ HỒNG LOAN

CN. PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN

Tháng 10/2008


LỜI CẢM ƠN
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả
các quý thầy cô đã tận tâm dạy dỗ, truyền đạt những tri thức khoa học và kinh nghiệm
quý báu cho em trong suốt quá trình rèn luyện học tập tại trường.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn đến ThS. Nguyễn Tiến Dũng và CN. Phạm
Thị Phương Uyên đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực tập tốt nghiệp và bước đầu nghiên cứu khoa học.
Em xin cảm ơn Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân
Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và các bạn bè
thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 30 đã quan tâm hỗ trợ, động viên tạo điều
kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt khóa luận này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2008
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng Loan

iii


TÓM TẮT
Nguyễn Thị Hồng Loan, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 10/2008.
“KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG
Clostridium perfringens TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008.
Hướng dẫn khoa học
ThS. Nguyễn Tiến Dũng
CN. Phạm Thị Phương Uyên
Nội dung
1. Khảo sát ảnh hưởng của các kỹ thuật nuôi cấy đến kết quả định lượng C. perfringens.
2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng C. perfringens
3. Khảo sát mật độ C. perfringens trong thực phẩm.
Kết quả
1. Định lượng C. perfringens bằng phương pháp đổ đĩa có hiệu quả hơn so với
phương pháp đổ ống.
2. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
- Nền mẫu cá khô: 6 cfu/g
- Nền mẫu nước mắm: 3 cfu/ml
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng
- Chế độ không khí: Kỵ khí.
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp: 370C.
- Thời gian ủ thích hợp: 20 giờ.
4. Khảo sát mật độ C. perfringens trong thực phẩm
Trong 35 mẫu khảo sát, tỉ lệ nhiễm C. perfringens ở nhóm thịt heo: 100%,
nhóm mắm: 40%, nhóm hàng khô: 13,33%.

iv


SUMMARY
Nguyen Thi Hong Loan, Nong Lam University Ho Chi Minh city, October 2008 .
“INVESTIGATING
Clostridium

THE

perfringens

FACTORS

EFFECTING

DETERMINATION

IN

ON

FOOD

RESULT
BY

OF

CULTURE

METHOD”, carried out at the lab of Department of Biotechnology, Nong Lam
University Ho Chi Minh city, from April 2008 to August 2008.
Supervisor
MS. Nguyen Tien Dung
BaS. Pham Thi Phuong Uyen
Contents
1. Investigating the effect of cultural techniques on C. perfringens quantitative result.
2. Investigating the factors that have effect on C. perfringens quantitative method.
3. Investigating C. perfringens density in food.
Results
1. C. perfringens quantified by plate count method is more effective than tube
count method.
2. Limit of detection
- Dried fish matrix: 6 cfu/g
- Fish sauce matrix: 3 cfu/g
3. Some factors influence on quantitative method.
- Aeration: C. perfringens grows at anaerobically.
- Optimal temperature: 370C
- Optimal time: 20 hours.
4. Investigating C. perfringens density in food
On 35 tested samples, infection rate of pork, fish sauce and dried fish are 100%,
40% and 13,33% respectively.

v


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

LỜI CẢM ƠN............................................................................................................ iii
TÓM TẮT.................................................................................................................. iv
SUMMARY................................................................................................................ v
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ .................................................... xi
Chương 1. MỞ ĐẦU................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1
1.2. Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2
1.3. Mục tiêu và ý nghĩa ............................................................................................... 2
1.3.1. Mục tiêu.............................................................................................................. 2
1.3.2. Ý nghĩa ............................................................................................................... 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
2.1. Định nghĩa và phân loại C. perfringens ................................................................ 3
2.1.1. Định nghĩa .......................................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 3
2.2. Lịch sử phát hiện .................................................................................................. 3
2.3. Đặc điểm sinh học của C. perfringens................................................................... 4
2.4. Các loại độc tố của C. perfringens ........................................................................ 4
2.5. Đặc điểm cấu trúc bộ gen ...................................................................................... 5
2.6. Các bệnh do C. perfringens gây ra ........................................................................ 6
2.7. Cơ chế sinh bệnh ................................................................................................... 8
2.8. Tình hình nhiễm C. perfringens trong và ngoài nước ........................................... 9
2.8.1. Trong nước ......................................................................................................... 9
2.8.2. Ngoài nước ......................................................................................................... 9
2.9. Phòng bệnh ............................................................................................................ 9
2.10. Giới hạn cho phép C. perfringens trong thực phẩm............................................ 10

vi


Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 12
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................ 12
3.1.1. Địa điểm ............................................................................................................. 12
3.1.2. Thời gian............................................................................................................. 12
3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 12
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................. 12
3.2.2. Môi trường và hóa chất ...................................................................................... 12
3.2.3. Nguyên vật liệu................................................................................................... 12
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 12
3.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu thực phẩm .................................................. 12
3.3.2. Phương pháp pha loãng vi sinh vật .................................................................... 13
3.3.3. Phương pháp đổ đĩa ........................................................................................... 13
3.3.4. Phương pháp đổ ống........................................................................................... 14
3.3.5. Phương pháp nhuộm Gram................................................................................. 14
3.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử................................................................................ 15
3.4. Kỹ thuật nuôi cấy kỵ khí ....................................................................................... 15
3.4.1. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy kỵ khí ............................................................. 15
3.4.2. Thao tác nuôi cấy kỵ khí .................................................................................... 17
3.5. Phương pháp định lượng C. perfringens .............................................................. 17
3.6. Cách bố trí thí nghiệm khảo sát............................................................................. 19
3.6.1. So sánh hiệu quả của phương pháp định lượng C. perfringens đổ ống và
đổ đĩa ........................................................................................................................... 19
3.6.2. Xác định giới hạn định lượng của phương pháp ................................................ 20
3.6.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng C. perfringens ... 22
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................... 24
4.1. So sánh hiệu quả định lượng C. perfringens bằng phương pháp đổ đĩa ............... 24
4.2. Xác định giới hạn định lượng của phương pháp ................................................... 26

4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng C. perfringens ...... 28
4.4. Khảo sát tỉ lệ nhiễm C. perfringens trong các nhóm thực phẩm đang lưu hành
trên thị trường ............................................................................................................... 34
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 38
5.1. Kết luận.................................................................................................................. 38
vii

14


5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 39
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

Blood Agar

BHI

Brain Heart Infusion Broth

CFU

Colony Forming Unit

kDa

Kilo Dalton

LC

Critical level

LGM

Lactose Gelatin Medium

LOD

Limit of detection

LOQ

Limit of quantification

NMLG

Nitrate Motility Lactose Gelatin

NMM

Nitrate Motility Medium

PSD

Pepton Saline Diluent

TSC

Tryptose Sulphite Cycloserine Agar

UK

United Kingdom

UV

Ultraviolet

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Độc tố của các type C. perfringens............................................................ 4
Bảng 2.2. Giới hạn cho phép C. perfringens trong các nhóm thực phẩm theo
quy định của Bộ Y Tế ban hành tháng 12/2007 ....................................................... 10
Bảng 4.1. Kết quả so sánh hiệu quả phương pháp đổ đĩa và đổ ống (Chủng
C. perfringens 1)....................................................................................................... 24
Bảng 4.2. Kết quả so sánh hiệu quả phương pháp đổ đĩa và đổ ống. (Chủng
C. perfringens 2)....................................................................................................... 25
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát giới hạn định lượng C. perfringens trên nền mẫu

cá khô (khối lượng mẫu thí nghiệm là 25 g) ............................................................ 27
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát giới hạn định lượng C. perfringens trên nền mẫu
nước mắm pha sẵn (thể tích mẫu thí nghiệm là 50 ml) ........................................... .27
Bảng 4.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trên nền mẫu
cá khô (mật độ gây nhiễm 80 cfu/ml)....................................................................... 29
Bảng 4.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trên nền mẫu
cá khô (mật độ gây nhiễm125 cfu/ml)...................................................................... 30
Bảng 4.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trên nền mẫu
nước mắm pha sẵn ăn liền (mật độ gây nhiễm là 75 cfu/ml). .................................. 31
Bảng 4.8. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp trên nền mẫu
nước mắm pha sẵn ăn liền (mật độ gây nhiễm là 100 cfu/ml) ................................ .32
Bảng 4. 9. Kết quả khảo sát mật độ C. perfringens trong các mẫu thực phẩm ........ 35

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỐ
TRANG
HÌNH
Hình 2.1. Hình dạng tế bào vi khuẩn C. perfringens.................................................. 3
Hình 2.2. Bản đồ nhiễm sắc thể C. perfringens 13 .................................................... 6
Hình 2.3. Chu trình gây ngộ độc thực phẩm của C. perfringens type A ................... 7
Hình 2.4. Biểu hiện ở heo con bị nhiễm C. perfringens............................................. 7
Hình 2.5. Hoại tử cơ do nhiễm C. perfringens ........................................................... 8
Hình 3.1. Phương pháp pha loãng thập phân ........................................................... 13
Hình 3.2. Phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc.......................................................... 14
Hình 3.3. Canh thioglycollate................................................................................... 16
Hình 3.4. Bình ủ kỵ khí có chứa Gas Pak ................................................................ 16
Hình 4.1. Kết quả định lượng bằng phương pháp đổ đĩa và đổ ống ........................ 26
Hình 4.2. Kết quả nuôi cấy C. perfringens trên thạch ở điều kiện

hiếu khí và kỵ khí ..................................................................................................... 33
SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Định lượng C. perfringens bằng phương pháp đổ đĩa và đổ ống............ 20
Sơ đồ 3.2. Quy trình giới hạn định lượng của phương pháp .................................... 22
Sơ đồ 3.3. Quy trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp
định lượng C. perfringens trong thực phẩm ............................................................ 23
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ nhiễm C. perfringens trong các nhóm thực phẩm ....................... 36

xi


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu vật chất và tinh thần của con người ngày
càng cao và đa dạng. Ngày nay, con người không chỉ ăn ngon, ăn đủ dinh dưỡng mà
còn yêu cầu thực phẩm phải an toàn, vệ sinh.
Ngộ độc thực phẩm đã thật sự trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Nó
không chỉ ảnh hưởng đến nền kinh tế mà còn gây nguy hại đến sức khỏe và tính mạng
con người. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn
là do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay độc tố vi sinh vật trong thực phẩm,
nước uống. "Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực
phẩm với 7000 - 10000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Nhà nước phải chi trên 3 tỷ
đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra nguyên nhân" [23]. Trong đó, các vụ ngộ
độc do ăn thực phẩm nhiễm vi khuẩn Salmonella, E. Coli, C. perfringens chiếm tỷ lệ
33- 49%, do độc tố vi khuẩn Staphylococcus aureus, C. perfringens, C. botulinum
chiếm 20 - 30%.
Clostridium perfringens chỉ phát triển trong môi trường có rất ít hoặc không có

O2. Khi nấu chín, vi khuẩn bị tiêu diệt nhưng độc tố vẫn còn tồn tại trong thức ăn và
gây ngộ độc. Kháng sinh không có giá trị đối với những trường hợp ngộ độc do độc tố
C. perfringens.
Để hạn chế nguy cơ ngộ độc thực phẩm do C. perfringens, người dân cần nâng
cao nhận thức về vấn đề vệ sinh an toàn với từng loại thực phẩm đặc thù. Vì vậy, với
mục tiêu thăm dò và cảnh báo các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm C. perfringens
cao, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả định
lượng Clostridium perfringens trong thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy” với
sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông Lâm và cán bộ
hướng dẫn khoa học.

1


1.2. Nội dung thực hiện
Khảo sát ảnh hưởng của các kỹ thuật nuôi cấy đến kết quả định lượng
C. perfringens.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp định lượng C. perfringens
trong thực phẩm.
Khảo sát mật độ C. perfringens trong thực phẩm.
1.3. Mục tiêu và ý nghĩa
1.3.1. Mục tiêu
Tối ưu hoá phương pháp định lượng C. perfringens trong thực phẩm.
Tìm ra các nhóm thực phẩm có nguy cơ nhiễm C. perfringens cao.
1.3.2. Ý nghĩa
Chỉ ra yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích C. perfringens để có hướng khắc
phục và nâng cao hiệu quả phân tích của phương pháp, thực hiện những cải tiến
phương pháp cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
Đưa ra khuyến cáo về các nhóm thực phẩm có mối nguy nhiễm C. perfringens
cao để người tiêu thụ có biện pháp chế biến an toàn, hợp vệ sinh và cẩn thận khi sử

dụng những loại thực phẩm này.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Định nghĩa và phân loại C. perfringens [10]
2.1.1. Định nghĩa
Clostridium perfringens là vi khuẩn hình que ngắn, Gram dương, tù 2 đầu, kích
thước 1,0 – 1,5 x 3,0 – 8,0 µm, không di động, sống kị khí và có khả năng tạo bào tử.
C. perfringens sống ở khắp nơi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong rau quả hỏng,
cát biển, đường ruột của người và ở động vật có xương sống, côn trùng và trong đất.
2.1.2. Phân loại
Giới:

Vi khuẩn

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Clostridia

Bộ:

Clostridiales

Họ:

Clostridiaceae

Giống:

Clostridium

Loài:

Clostridium perfringens

Hình 2.1. Hình dạng tế bào vi khuẩn C. perfringens [14]
2.2. Lịch sử phát hiện [13]
Năm 1892, nhà vi khuẩn học Welch đã phân lập được vi khuẩn Bacillus Gram
dương từ vết thương bị hoại thư. Vi khuẩn này được gọi đầu tiên được gọi là Bacillus
aerogens capsulatus, sau đó đổi tên thành Bacillus perfringens, sau là Clostridium
welchii. Ngày nay, vi khuẩn này có tên là Clostridium perfringens.
2.3. Đặc điểm sinh học C. perfringens [11]
Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 35 – 370C, vẫn tăng trưởng ở 500C.

3


Không sinh indole, khử nitrate thành nitrite, không cố định nitrogen không khí,
thủy phân gelatin; lên men nhiều loại đường tạo acid và hơi, không lên men mannitol.
Gây đông tụ sữa, sinh acid và sinh hơi rất mạnh.
Trên bề mặt thạch, khuẩn lạc tròn, ẩm, tâm đục, nhô lên; trên thạch trứng,
khuẩn lạc tròn hoặc hơi bất thường, phẳng, có vùng tủa đục bao quanh. Tăng trưởng

tốt trong môi trường dịch thể, tạo các hạt sinh khối nhầy.
Sinh ngoại độc tố.
2.4. Các loại độc tố của C. perfringens [1, 11, 13]
C. perfringens có 17 nhân tố gây độc, trong đó có 12 độc tố mô và độc tố đường
ruột. C. perfringens được phân thành 5 type: A, B, C, D, E dựa trên khả năng tạo ra
các độc tố chính: alpha, beta, epsilon và iota [1].
Bảng 2.1. Độc tố của các type C. perfringens [13]
Các dòng C. perfringens

Độc tố

Type A

Alpha

Type B

Alpha, beta, epsilon

Type C

Alpha, beta

Type D

Alpha, epsilon

Type E

Alpha, iota

- Độc tố alpha: Được tạo ra cả ở 5 type, nhiều nhất là ở C. perfringens type A.
Độc tố alpha bản có chất là photpholipase C (lecithinase), enzym này tách lecithin ra
thành phosphorylcholine và diglyceride. Độc tố alpha là nhân tố gây ra hoại thư sinh
khí, làm tan máu, phá hủy tiểu cầu, bạch cầu đa nhân và làm mao mạch thương tổn lan
rộng. Khi tiêm độc tố vào tĩnh mạch sẽ gây nên hiện tượng tan huyết nội mạch ồ ạt và
thương tổn ti thể gan. Độc tố alpha có vai trò quan trọng trong giai đoạn khởi nhiễm
vào cơ và từ đó phát triển thành bệnh hoại thư sinh khí.
- Độc tố beta: Là độc tố gây chết chủ yếu ở type B và C của C. perfringens. Bản
chất là chuỗi polypeptide đơn khoảng 40 kDa, rất nhạy với trypsin. Độc tố này có vai
trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử ở người và động vật. Ở người,
bệnh này có tên là “pig-bell”, do nhiễm phải C. perfringens type C và có các biểu hiện
lâm sàng như nôn ói, đau bụng, tiêu chảy ra máu. Ngoài ra, C. perfringens type C còn

4


gây viêm ruột hoại tử ở bê, cừu, lợn con. C. perfringens type B là nguyên nhân gây
nhiễm độc máu hoặc viêm ruột hoại tử ở lừa, cừu và dê.
- Độc tố epsilon: Do C. perfringens type B và D tạo ra, khối lượng phân tử nặng
khoảng 32 kDa. Nó được tiết ra ở dạng tiền độc tố bất hoạt và được hoạt hóa khi cắt bỏ
gốc N- của đoạn polypeptide bởi trypsin. Độc tố này là nguyên nhân gây độc gan, tăng
áp suất máu. Đặc tính chính của độc tố xuất hiện khi nó gắn vào tế bào biểu mô làm
tăng tính thấm mao mạch, gây tổn thương mạch và phù nề các cơ quan như: não, tim,
phổi và thận.
- Độc tố iota: Là một trong những yếu tố gây chết chính, được tạo ra bởi
C. perfringens type E, gồm có 2 protein độc lập nhau là iota a (Ia, khối lượng phân tử
khoảng 47,5 kDa) là một ADP-ribosyltransferase và iota b (Ib, khối lượng phân tử
khoảng 94 kDa). Ib liên quan đến việc gắn kết với receptor trên màng tế bào và sau đó
Ia dễ dàng xâm nhập vào cytosol. Độc tố này có đặc tính làm tăng tính thấm mao mạch.

2.5. Đặc điểm cấu trúc bộ gen [9]
Năm 2001, các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc giải trình tự bộ
gene C. perfringens dòng 13. Genome C. perfringens có chiều dài 3031430 bp bao
gồm 2660 vùng mã hóa protein và 10 gen rRNA. Trong genome chứa những gen liên
quan đến quá trình lên men kỵ khí sinh hơi nhưng không có gene mã hóa các enzyme
tham gia vào chu trình Tricarboxylic acid (chu trình Krebs) và chuỗi hô hấp.
C. perfringens có thể sử dụng nhiều loại đường như: fructose, galactose,
lactose, maltose, manose, tinh bột và sucrose. C. perfringens có những gen mã hóa các
enzyme tham gia vào quá trình lên men đường như: α-galactosidase, β-galactosidase,
α-glucosidase, β-glucosidase, β-glucuronidase, β- fructofranosidase, α-mannosidase,
pullulanase, α-amylase, endo-1,4-beta-xylanase.
Khả năng sinh tổng hợp amino acid của C. perfringens rất hạn chế do thiếu các
gen cần cho quá trình tổng hợp arginine, acid amin thơm, acid amin mạch nhánh,
glutamate, histidine, lysine, methionine, serine, threonine.
Có 61 gen liên quan đến sự hình thành bào tử và nảy mầm trong chromosome
của C. perfringens. Chiếm phần lớn là các gen mã hóa cho các yếu tố sigma, liên quan
đến quá trình tạo bào tử và những tiến trình tạo protein chuyên biệt khác. Bộ gen
C. perfringens thiếu vài gen mã hóa protein vỏ bào tử, protein liên quan đến sự nảy

5


mầm và các protein tham gia vào giai đoạn đầu của quá trình tạo bào tử như: Spo0A,
Spo0B, KinA đến KinE.
Đặc điểm riêng biệt nhất trong bộ gen C. perfringens là sự hiện diện những gen
mã hóa cho các enzyme gây độc như nagH, nagF, nagJ nagK, nagL.

Hình 2.2. Bản đồ nhiễm sắc thể C. perfringens 13 [15]
2.6. Các bệnh do Clostridium perfringens gây ra [1, 13]
Clostridium perfringens là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm và viêm tiểu tràng

hoại tử.
- Ngộ độc thực phẩm: C. perfringens đứng hàng thứ hai hoặc ba trong những
nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm lớn nhất tại Hoa Kỳ. Nguồn thức ăn thường mắc
phải là thịt, các sản phẩm từ thịt và gia cầm. Tỷ lệ bộc phát bệnh lên đến 70%. Sau khi
tiêu thụ thức ăn nhiễm C. perfringens type A, các triệu chứng ngộ độc xuất hiện sau 8
đến 24 giờ, với các biểu hiện chủ yếu như đau vùng thượng vị, buồn nôn và tiêu chảy nước.

6


Thịt bị nhiễm bào tử C.
C. perfringens
perfringens

Chuẩn bị thức ăn không
kĩ, vi khuẩn phát triển

Thức ăn gia súc, gia cầm
C. perfringens type A
gây ngộ độc thực phẩm

Nông trại?

Theo thức ăn
vào ruột

Chuẩn bị thức ăn?

Phóng thích vào
môi trường?

Bào tử

Bệnh tiêu chảy

Hình thành bào tử trong ruột,
sản sinh ngoại độc tố

Hình 2.3. Chu trình gây ngộ độc thực phẩm của C. perfringens type A [13]
- Viêm tiểu tràng hoại tử hay còn gọi là Pigbel: Do nhiễm phải C. perfringens
type C, làm cho ruột non bị hoại tử, gây chết ở trẻ em và người lớn. Bệnh được ghi
nhận sau một bữa tiệc ở New Guinea. Những biểu hiện lâm sàng đặc thù gồm đau
bụng cấp, tiêu chảy máu, nôn, choáng và viêm phúc mạc. Tỷ lệ tử vong đến 40%.

A

B

Hình 2.4. Biểu hiện heo con bị nhiễm C. perfringens [17]
A – Triệu chứng ở thể cấp tính: Tiêu chảy xuất huyết và chết
B – Bệnh tích: Ruột xuất huyết, sưng to và sinh khí
7


- Hoại thư sinh hơi: 80% số ca là do C. perfringens gây ra, còn lại là do
C. novyi, C. septicum. Thời kỳ ủ bệnh ngắn, ít hơn 3 ngày và thường trong vòng 24
giờ. Triệu chứng ban đầu là đau đột ngột ở vùng vết thương, sau đó sưng nề và
kèm theo vết thương rỉ dịch loãng có lẫn máu. Ở những trường hợp không được điều
trị, khi vết thương tại chỗ phát triển, da trở nên đen sậm màu đồng thiếc, các nốt phỏng
xuất hiện, trong chứa đầy dịch đỏ nâu, kèm theo là những mảng thâm đen của da bị
hoại tử. Khí xuất hiện ở giai đoạn muộn. Bệnh nhân bị hoại tử cơ luôn nhận biết tỉnh

táo về sự vật quanh mình tới khi rơi vào tình trạng hôn mê và chết.

Hình 2.5. Hoại tử cơ do nhiễm C. perfringens
2.7. Cơ chế sinh bệnh
[4, 5] [18]
Bình thường, C. perfringens cư trú trong trong ruột người và động vật ở liều
lượng thấp, không gây bệnh và độc tố tiết ra sẽ nhanh chóng theo chiều nhu động ruột
thải ra ngoài. Khi cơ thể yếu đi, sự tăng trưởng của vi khuẩn cùng với sự giảm nhu
động ruột sẽ làm tăng liều lượng và độc lực của độc tố. Các độc tố này thâm nhập vào
các nội quan (chủ yếu là gan, thận) sau đó vào thần kinh gây ra hiện tượng hoại tử
nặng và trạng thái ngộ độc. Nhiều biến thể của các vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc
nhiễm khuẩn độc tố, ở thức ăn chúng phát triển và ăn phải thức ăn có số lượng lớn vi
khuẩn sẽ bị ngộ độc: do vi khuẩn tíếp tục phát triển trong cơ thể sinh độc tố, khi chết tế
bào bị phân hủy và giải phóng độc tố ra ngoài.
2.8. Tình hình nhiễm C. perfringens trong và ngoài nước
2.8.1. Trong nước
Tháng 4/2001, số công nhân, học sinh trên địa bàn huyện Thống Nhất bị ngộ
độc thực phẩm là 1736 người, theo thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng Đồng Nai
và Trung tâm Y tế huyện Thống Nhất. Trong đó, công ty giày Việt Vinh có hơn 950
8


người bị. Các mẫu được xét nghiệm ở Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và Viện
vệ sinh Y tế công cộng đều thấy có sự hiện diện của C. perfringens [25].
Tháng 6/2008, tại công ty Hoàng Gia tỉnh Tây Ninh xảy ra vụ ngộ độc thực
phẩm làm 1000 công nhân phải nhập viện với triệu chứng đau bụng, buồn nôn, khó
thở, chóng mặt…Đem kiểm nghiệm những mẫu thực phẩm dành cho công nhân: gà
kho, canh chua, cá ngừ… thấy hầu hết các loại thức ăn đều nhiễm khuẩn như: gà kho
nhiễm C. perfringens, canh chua nhiễm E. Coli [27].
Hàng năm, có khoảng 1000 trẻ chết vì bệnh Pig Bell mà tác nhân gây bệnh là

C. perfringens. Bệnh có sự phân bố chọn lọc về địa phương rõ rệt: nông thôn 86%,
thành phố và vùng ven 14%. Tuổi mắc bệnh thường gặp là 4 – 9 tuổi (61,45%). Bệnh
thường xảy ra vào mùa hè.
2.8.2. Ngoài nước
C. perfringens đứng thứ 3 về nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở Hoa Kỳ.
Hàng năm, có ít nhất từ 10 – 20 vụ bùng phát dịch được báo cáo ở Hoa Kỳ trong hai
thập kỉ qua. Tuy nhiên, số vụ xảy ra trong thực tế lớn hơn rất nhiều [26].
Theo thông tin từ Bộ y tế bang New South Wales cho biết tại nhà dưỡng lão
Endeavour Nursing Home thị trấn Springwood miền tây Sydney, 83 cụ cao niên mắc
bệnh tiêu chảy và các triệu chứng khác gây đau bụng. Trong đó, 10 cụ bị thiệt mạng vì
bệnh tiêu chảy. Kết quả xét nghiệm cho thấy có sự hiện diện của C. perfringens [24].
2.9. Phòng bệnh
- Rửa tay bằng xà phòng trước khi ăn, chế biến thức ăn và sau khi sử dụng nhà vệ sinh.
- Bảo quản thức ăn ở 40C.
- Nấu chín thức ăn, đặc biệt là thịt gia súc.
- Hâm nóng thức ăn trước khi dùng (ít nhất là ở 700C)
- Rửa sạch trái cây và rau trước khi ăn.
- Sử dụng dụng cụ, chén đĩa sạch trước khi ăn.
- Các dụng cụ để chế biến thịt, hải sản, gia súc đều phải được rửa sạch.
- Nếu bị tiêu chảy liên tục, có sốt hay không sốt, nên liên hệ bác sĩ hay trung
tâm sức khỏe để được hướng dẫn.
2.10. Tiêu chuẩn C. perfringens trong thực phẩm ở Việt Nam
Bảng 2.2. Giới hạn cho phép C. perfringens trong các nhóm thực phẩm theo quy định
của Bộ Y Tế ban hành tháng 12/2007 [2]
9


GIỚI HẠN
NHÓM THỰC PHẨM

C. perfringens
(trong 1 g hay 1 ml
sản phẩm)

 Nhóm thịt và sản phẩm thịt
Thịt tươi, thịt đông lạnh nguyên con hoặc cắt miếng

102

Thịt tươi , thịt đông lạnh xay nhỏ

102

Thịt và sản phẩm thịt dạng muối, xông khói (không xử lý
nhiệt)

102

Thịt và sản phẩm thịt lên men (không xử lý nhiệt)

102

Thịt và sản phẩm thịt đóng gói (xử lý nhiệt)

10

Thịt và sản phẩm thịt không đóng gói

102

Thịt khô

102

Thịt hộp

Không có

 Nhóm cá và thủy hải sản
Cá và thủy sản tươi: cá đông lạnh, cá tươi, các loại nhuyễn
thể, các sản phẩm của cá (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng).

102

Sản phẩm chế biến từ cá và thủy sản: tôm, cá hấp nóng, hun
khói, chả cá, chả mực, các loại giáp xác, nhuyễn thể luộc, hấp
(dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng).
Thủy sản khô sơ chế (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

10

20

 Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bột, miếm,
mì sợi (có sử lý trước khi sử dụng).
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bánh, bột
(dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

102

10

 Nhóm rau, quả và sản phẩm rau, quả
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: bánh, bột

Giới hạn bởi GAP

(dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Rau quả muối, rau quả khô

10

10


 Nhóm nước khoáng và nước giải khát đóng chai
Nước giải khát có cồn

Không có

Nước giải khát không cồn

Không có

Nước khoáng đóng chai

Không có

 Nước gia vị và nước chấm
Nước chấm có nguồn gốc động vật

10

Nước chấm có nguồn gốc thực vật

10

 Nhóm thức ăn đặc biệt
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

10

Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi

0

sử dụng)
 Nhóm kem và nước đá

10

 Nhóm đồ hộp
Sản phẩm chế biến từ thịt, cá đóng hộp, rau quả đóng hộp

11

Không có

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh
Học – Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện: Từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Ống nghiệm, que cấy vòng, que cấy sâu, túi PE vô trùng, bình ủ kỵ
khí, transfer pipette, đèn cồn, chai thủy tinh 500 ml và 1.000 ml, đĩa petri, ống đong,
kéo cắt, kẹp gắp kim loại, khay kim loại.
Thiết bị: Tủ ấm Memmert 370C, nồi hấp, cân phân tích, tủ cấy, tủ mát
2 – 80C, kính hiển vi quang học.
3.2.2. Môi trường và hóa chất
Môi trường: Peptone saline diluent, tryptose sulphite cycloserine agar, bufferrd
nitrate motility medium, lactose gelatine medium, blood agar, brain heart infusion broth.
Hóa chất: Hóa chất nhuộm Gram, hóa chất nhuộm bào tử, thuốc thử nitrite.
3.2.3. Nguyên vật liệu
Chủng C. perfringens đối chứng: 1 chủng do Trung tâm Chất lượng, An toàn vệ
sinh và Thú y thủy sản 4 cung cấp; 1 chủng phân lập từ mẫu ruốc khô và 1 chủng từ
mẫu mắm cá linh.
Mẫu thực phẩm: Lấy mẫu theo số lượng và các nhóm phân loại như sau
- Thịt gia súc (trâu, bò, lợn): 30 mẫu.
- Hàng khô (cá chỉ vàng, tôm khô, tép khô, khô mực…): 30 mẫu.
- Mắm (nước mắm, mắm tôm, mắm ruốc…): 30 mẫu.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu thực phẩm [6]
Mẫu được thu tại chợ và được chứa trong bao nylon sạch, bảo quản mẫu trong

nước đá cho tới khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Mẫu được phân tích
trong vòng 4 giờ sau khi thu mẫu.

12


3.3.2. Phương pháp pha loãng vi sinh vật [6]
Mẫu được pha loãng tuần tự thành các dãy nồng độ thập phân 1/10 bằng cách
dùng 1 ml mẫu (hoặc 1 ml dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9 ml nước
muối sinh lý và khuấy trộn để mẫu phân bố đều.

Hình 3.1. Phương pháp pha loãng thập phân [21]
3.3.3. Phương pháp đổ đĩa [12]
Về nguyên tắc cơ bản, phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc được thực hiện bằng
cách cấy 1 thể tích mẫu ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa và đổ 1 lớp môi trường đã
được làm nguội ở 450C – 500C. Xoay đều đĩa theo chiều kim đồng hồ và chiều ngược
lại để dịch mẫu phân bố đều với môi trường. Để yên đĩa cho thạch đông và ủ đĩa. Với
đối tượng nuôi cấy là C. perfringens, đòi hỏi môi trường nuôi cấy yếm khí tuyệt đối,
phương pháp đổ đĩa được cải tiến như sau:
- Đổ vào đĩa 1 lớp mỏng (5-10 ml) môi trường thạch TSC và dàn đều. Để thạch
đông lại.
- Cấy 1 thể tích mẫu ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa. Đổ 1 lớp dày TSC agar
(15-20 ml) đã làm nguội ở 450C – 500C vào đĩa và xoay đều đĩa. Để yên đĩa cho thạch
đông lại.
- Đổ tiếp 1 lớp mỏng TSC agar lên lớp thạch thứ 2 và để yên cho thạch đông.

13


Ủ ở nhiệt độ

thích hợp

Bơm
Bơm mẫu
mẫu vào
vào đĩa
đĩa

Đổ
Đổ môi
môi trường
trường vào
vào rồi
rồi xoay
xoay
đều
đĩa
trước
khi
đem
đều đĩa trước khi đem ủủ

Khuẩn lạc

Đếm khuẩn lạc trên đĩa

Hình 3.2. Phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc [20]
3.3.4. Phương pháp đổ ống
Phương pháp đổ ống có nguyên tắc cơ bản giống như phương pháp đổ đĩa.
Phương pháp đổ ống thường được áp dụng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí do tiết diện

bề mặt ống nhỏ và nhờ có chiều sâu nên hạn chế không khí khuếch tán vào môi trường
nuôi cấy. Các bước thực hiện:
- Cấy một thể tích mẫu đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào ống nghiệm vô trùng.
- Đổ 1 lớp môi trường TSC agar đã làm nguội ở 450C – 500C vào ống sao cho chiều
cao của lớp môi trường chỉ cách miệng ống khoảng 3 cm. Để yên cho thạch đông lại.
- Đổ tiếp 1 lớp TSC agar lên bề mặt lớp môi trường thứ nhất và để yên cho
thạch đông lại.
Ưu điểm của phương pháp này là cần không sử dụng bình kỵ khí vì bản thân
môi trường trong ống nghiệm đã yếm khí hoàn toàn nên giá thành phân tích thấp hơn
phương pháp đổ đĩa, thao tác đơn giản và ít chiếm diện tích tủ ấm hơn.
3.3.5. Phương pháp nhuộm Gram [7]
- Dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn huyền phù vào 1 giọt nước cất vô trùng
đặt trên lam. Cố định nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm với Cristal violet trong 1 – 2 phút. Đổ bớt thuốc nhuộm thừa trên lam.
- Nhuộm tiếp với Gram’s iodine trong 1 phút. Đổ bớt thuốc nhuộm thừa.
- Tẩy màu nhanh hỗn hợp thuốc nhuộm trên bằng acetone.
- Rửa lại bằng nước cất.
- Nhuộm với Safranin trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất và để lam khô tự nhiên.
- Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X.

14