ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––
LÊ THỊ THU HÀ
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT
SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS
TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG
(NESTED - PCR)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
–––––––––––––––––
LÊ THỊ THU HÀ
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT
SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS
TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG
(NESTED - PCR)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh
học
Mã số: 60 42 02
01
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đắc
Trung
THÁI NGUYÊN - 2017
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn
là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết
quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên
cứu khác.
Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả
Lê Thị Thu Hà
ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đắc Trung và TS.
Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên
cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Vi sinh, trường
Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong
quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ
sinh học, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy
dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp
đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học
tập và nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên, tháng 4 năm
2017
Tác giả
Lê Thị Thu Hà
iii
MỤC LỤC
LỜI
CAM
ĐOAN
.............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN
................................................................................................... ii MỤC LỤC
........................................................................................................
iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT................................................................................
v DANH MỤC CÁC BẢNG..............................................................................
vii
DANH
MỤC
CÁC
..............................................................................viii
HÌNH
MỞ
ĐẦU
.......................................................................................................... 1
1.
Đặt
đề...................................................................................................... 1
2.
Mục
tiêu
cứu...................................................................................... 2
vấn
nghiên
3.
Nội
dung
nghiên
..................................................................................... 2
cứu
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................
3
1.1. Đại cương về bệnh
................................ 3
viêm
gan
B
và
1.1.1.
Lịch
sử
phát
hiện
B......................................................... 3
1.1.2. Tình hình bệnh
Nam........................... 3
viêm
gan
B
virus
bệnh
trên
1.1.3.
Virus
HBV
virus)................................................................ 5
viêm
gan
viêm
thế
giới
B
gan
và
Việt
(Hepatitis
B
1.2. Các kiểu gen của HBV và tình hình nghiên cứu về kiểu gen của
HBV
trong
và
nước......................................................................................... 13
ngoài
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17
2.1.
Vật
liệu
nghiên
.................................................................................. 17
cứu
2.1.1.
Mẫu
bệnh
phẩm
.................................................................. 17
cứu
nghiên
2.1.2.
Thiết
bị,
dụng
cụ
................................................................ 17
và
2.2.
nghiên
Địa
điểm
hóa
chất
cứu
iv
................................................................................ 19
2.3.
Phương
pháp
cứu.......................................................................... 20
2.3.1.
Phương
pháp
thu
phẩm.................................. 20
nhận
2.3.2.
Phương
pháp
tách
...................................................... 21
và
xử
chiết
nghiên
lý
mẫu
HBV
bệnh
DNA
2.3.3. Định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật real-time PCR ..........................
21
v
2.3.4. Xác định kiểu gen HBV bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR).......
22
2.3.5. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di
.................................... 27
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................
28
3.1. Kết quả tách chiết HBV-DNA tổng số.....................................................
28
3.2. Kết quả xác định kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B bằng kỹ
thuật PCR lồng (Nested – PCR)......................................................................
34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................
39
vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
AFLP
Amplified Fragment Length
Polymorphism ATP
Adenosin triphosphat
Bp
Base pair
CS
Cộng sự
CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide ddNTP
Dideoxy Nucleotide
Triphosphate DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxy Nucleotide Triphosphate
EDTA
Ethylene Diamin Tretraaxetic
Acid HBV
Hepatitis B virus
HBcAg
Hepatitis B Core Antigen
HBeAg
Hepatitis B Early Antigen
HBsAg
Hepatitis B Surface
Antigen HCC
Hepatocellular
carcinoma IgM
Immuno
Globulin M
Kb
Kilobase
KDa
Kilodalton
LiPA
Line probe assay
LMA
Kết hợp kháng thể
LTC
Lympho T cytotoxic
MHR
Major Hydrophilic Region
ORF
Open - reading frame
PCR
Polymerase Chain Reaction
RAPD
Random Amplified Polymorphism DNA
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism RNA
SDS
Ribonucleic Acid
Sodium Doecyl Sulphat
vi
i
SGOT
Serum Glutamo-oxalo
transaminase SGPT
Serum Glutamo-
pyruvic transaminase SSR
Simple
Sequence Repeats
TAE
Tris - Acetate - EDTA
TE
Tris - EDTA
Tris
Trioxymetylaminometan
WHO
World Health Organization
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các
nước trong khu vực
......................................................................... 13
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
........................... 17
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................
18
Bảng 2.3. Cặp mồi khuếch đại vùng gen S của HBV .....................................
23
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vòng ngoài..........................................
24
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng ngoài ..............................
24
Bảng 2.6. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm 1) ..................
25
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR vòng trong nhóm I..............................
25
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm I) ...............
25
Bảng 2.9. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) .................
26
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR vòng trong (nhóm II)........................
26
Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) ............
26
Bảng 3.1. Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại
tỉnh Thái Nguyên
............................................................................ 36
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới
.......................................................... 4
Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh
......................................................................... 6
Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử HBV
.......................................................... 6
Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các
protein (B)
........................................................................................ 7
Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV
.................... 8
Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV ......................
9
Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan
............................... 11
Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu ...........
20
Hình 2.2: Sơ đồ xác định kiểu gen của HBV bằng phản ứng nested-PCR
sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (nt, nucleotide) ...............................
22
Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính)
của một bệnh nhân nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR .....
29
Hình 3.2: Kết quả thông số của các phản ứng Realtime-PCR đã thực hiện ...
30
Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương
và chứng âm
.................................................................................... 31
Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của một mẫu xét
nghiệm dương tính
.......................................................................... 32
Hình 3.5: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của
bệnh nhân Trần Văn H. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real- time
PCR ......................................................................................... 33
Hình 3.6: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của
bệnh nhân Tô Văn Kh. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real- time
viii
PCR ......................................................................................... 33
Hình 3.7: Sản phẩm PCR vòng 2 với nhóm I (kiểu gen A, B, C) trên bản
gel điện
di........................................................................................ 35
1
2
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn
đề
Hiện nay, tình trạng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus HBV) là vấn đề đang được quan tâm trên thế giới nói chung và Việt nam
nói riêng. Virus viêm gan B là nguyên nhân chủ yếu gây xơ gan, ung thư
gan [7], [8]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (World Health
Organization - WHO), có khoảng hơn 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan
B; trong đó có 350 triệu người mang virus viêm gan B mạn tính. Những
người mang virus viêm gan B mạn tính là nguồn lây nhiễm quan trọng
trong cộng đồng và có nguy cơ cao mắc các bệnh về gan nguy hiểm liên
quan đến nhiễm vi rút viêm gan B như bệnh viêm gan hoại tử
(necroinflammatory) cấp hoặc mạn, xơ gan và đặc biệt là ung thư biểu mô
tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC), làm cho khoảng 5 trăm đến
2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm [46], [47]. Tại Việt Nam có khoảng
15% - 20% người nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ
gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4].
Kiểu gen của HBV được phát hiện lần đầu tiên năm 1988 bởi
Okamoto và cs dựa vào sự khác biệt trên 8% trình tự nucleotide trên toàn
bộ bộ gen của HBV [37]. Ở các vùng địa lý khác nhau có sự phân bố khác
nhau về kiểu gen của HBV [12], [13].
Để xác định genotype HBV có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân
tử khác nhau như phân tích đa hình của các đoạn giới hạn (restriction
fragment length polymorphism - RFLP) [6], phương pháp PCR đa mồi
(multiplex - PCR) [9,28,30], phương pháp realtime - PCR [49], phương
pháp oligonucleotide microarray [41]... Sự hiểu biết về sự phân bố giữa
các kiểu gen của virus HBV có vai trò rất quan trọng trong công việc
điều trị và theo dõi diễn tiến của bệnh, phòng ngừa được các biến chứng
của bệnh. Đặc biệt điều này cũng rất có ý nghĩa trong công tác quản lý và
giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm
gan siêu vi B. Xuất phát từ
thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định kiểu gen của virus
viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng
phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)”.
2. Mục tiêu nghiên
cứu
Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm
virus viêm gan B tại Thái Nguyên.
3. Nội dung nghiên
cứu
3.1. Tách chiết HBV DNA tổng số từ mẫu huyết thanh của các
bệnh nhân nhiễm HBV (có kết quả xét nghiệm HBsAg dương
tính). Xác định hàm
lượng HBV DNA trong mẫu bằng kỹ thuật Real-time
PCR
3.2. Xác định kiểu gen của virus viêm gan B bằng kỹ thuật
PCR lồng
(Nested
PCR)
-
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B
Năm 1964 Baruch Blumberg đã mô tả một loại kháng nguyên
(KN) đặc trưng ở thổ dân châu Đại Dương gọi là “KN Australia”. Đến năm
1968, phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B mãn tính có tiểu
thể hình cầu và hình sợi, đường kính 27nm không chứa DNA. Đó chính là
KN bề mặt HBsAg (hepatitis B surface antigen). Hai tiểu thể này không
phải là HBV (Hepatitis B virus) hoàn chỉnh vì thiếu genome. Năm 1970,
người ta phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B có các thể hình
cầu, đường kính 42nm, bên trong chứa ADN kép gọi là tiểu thể Dane.
Nghiên cứu sau này xác định chính tiểu thể Dane mới là HBV thực sự [13].
1.1.2. Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam
1.1.2.1. Trên thế giới
Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề có tính chất toàn cầu bởi HBV
xuất hiện ngay cả ở các quần thể dân chúng sống cách biệt và những người
sống trên các hòn đảo. Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và cách thức lây
truyền có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng khác nhau trên thế giới. Trên
cơ sở điều tra huyết thanh học các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B
đặc biệt là HBsAg, Tổ chức Y tế Thế giới chia mức độ nhiễm virus viêm gan
B thành 3 mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp [45], [46], [47].
Vùng lưu hành dịch cao
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg 8% và tỷ lệ người đã
nhiễm virus viêm gan 60%. Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng
này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn
Độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông
Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và
một số dân tộc sống ở Bắc
cực như Eskimo, Maoris. Việt Nam là nước được xếp là vùng lưu hành
dịch cao [20].
Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới [50]
Vùng lưu hành dịch trung bình
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng
nhiễm virus viêm gan B từ 20-60%, 43% dân số thế giới nằm trong vùng
này bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga,
Đông Âu, hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ. Phương thức lây truyền rất
đa dạng, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn. Hay gặp
những trường hợp nhiễm cấp virus viêm gan B do phần lớn nhiễm trùng
xảy ra ở lứa tuổi thanh niên và người lớn [34], [45].
Vùng lưu hành thấp
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg 2% và tỷ lệ người đã
từng nhiễm virus viêm gan B 20%. 12% dân số thế giới nằm trong vùng
này bao gồm các nước như Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand, Bắc
Mỹ, Nam Mỹ. Phương thức lây truyền chính là lây truyền ngang ở lứa
tuổi trưởng thành, chủ yếu xảy ra ở các nhóm người có nguy cơ cao như
tiêm chích ma
tuý, đồng tính luyến ái, nhân viên y tế, người được truyền máu hoặc
lây nhiễm trong gia đình người nhiễm virus viêm gan B [16], [46].
1.1.2.2. Tại Việt Nam
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành viêm gan B cao. Tỷ
lệ
mang HBV trong cộng đồng dân cư là 15% - 25%. Hàng năm, có
khoảng
20.000 người mắc viêm gan và tỷ lệ tử vong từ 0,7% - 0,8% [6].
Giai đoạn từ năm 1988 đến năm 1996, ở Việt Nam đã có hàng chục
nghiên cứu về tỉ lệ mang HBsAg ở người bình thường. Mặc dù vậy nhưng
các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một vài nhóm đối tượng tại địa
phương cụ thể, phân bố tại nhiều vùng trên cả nước. Theo nghiên cứu của
Hoàng Thủy Nguyên, Phạm Song, giai đoạn 1990-1997, tỉ lệ nhiễm HBV
trong cộng đồng người Việt Nam: Cộng đồng người khỏe mạnh là 15%
mang HBsAg và người bệnh có HBV là 45% (IgM anti-HBc) [8]. Nhìn
chung, các nghiên cứu đều cho kết quả tỉ lệ nhiễm HBsAg của các đối
tượng nghiên cứu ở mức 2 con số.
Theo nghiên cứu về tình hình viêm gan virus B ở Việt Nam (Chương
trình Quốc gia - Mã số KY 01 - 09), tại Hà Nội, tỉ lệ mang HBV trong cộng
đồng dân cư là 11,35 %. Tỉ lệ nhiễm HBV tại thành phố Hồ Chí Minh
là
19,7% [6].
1.1.3. Virus HBV (Hepatitis B virus)
1.1.3.1. Hình thái HBV
HBV thuộc loại siêu vi trùng (virus):
Nhóm VII (dsDNA-RT)
Họ (familia): Hepadnaviridae.
Chi (genus):
Orthohepadnavirus. Loài
(species): viêm gan B.
Các nghiên cứu hiển vi điện tử đã xác định hình thái của HBV. Về cấu
tạo, hạt virus HBV hoàn chỉnh (Virion) có hình cầu nhỏ, đường kính 2245
nm, gồm 3 lớp: lớp bao ngoài dày khoảng 7 nm, lớp vỏ Capsit hình hộp,
có
đường kính khoảng 27 - 28 nm và lõi chứa bộ gen của virus.
Trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi
virus, dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 tiểu thể khác nhau của
virus: Tiểu thể
hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm; Tiểu thể hình ống
(hình que) có đường kính 20-22 nm, dài 40-400 nm; Tiểu thể hình cầu
lớn có đường kính
42-45 nm còn gọi là tiểu thể Dane, đây chính là virus hoàn chỉnh [17].
Hình 1.2: Hạt virus hoàn
chỉnh
Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện
tử
(tiểu thể Dane) của HBV
[17]
HBV [17]
1.1.3.2. Cấu trúc HBV
Cấu tạo của virus HBV cũng giống đại đa số các virus khác. Chúng
có lớp vỏ ngoài bằng protein, có chứa trên bề mặt nhiều kháng nguyên
HBs, và cấu trúc DNA bên trong. HBV là chủng virus duy nhất có cấu trúc
DNA có khả năng lây truyền qua đường máu. Quá trình sao chép DNA là
quá trình phiên mã ngược nhờ một RNA trung gian. Protein kháng nguyên
được lắp ráp một cách đồng dạng DNA từng phần, trình tự protein tương
đồng và phản ứng chéo về huyết thanh học [25], [26].
Bộ gen của HBV là một phân tử DNA mạch kép, dạng vòng
không hoàn chỉnh, kích thước khoảng 3,2Kb, được cấu tạo bởi hai chuỗi
đơn ngược dấu và có chiều dài không bằng nhau. Chuỗi dài (chuỗi âm)
nằm ngoài tạo
nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3,2Kb mang toàn bộ
thông tin di truyền của HBV. Chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong có kích
thước thay đổi chỉ chiếm khoảng 50-80% chuỗi dài.
Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA
(A)
và với các protein (B)
[37]
Hệ gen của HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối
lên nhau hoàn toàn hoặc không hoàn toàn nhằm giảm thiểu chiều dài của
bộ gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P. Các
gen này mã hóa cho toàn bộ các protein của virus [44]. Sự bắt cặp bổ
sung của các nucleotide trên vùng gối của hai sợi (âm và dương) được
giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép
vòng của hệ gen xảy ra khi protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị
với đầu 5’ của sợi âm (hình 1.4) [37].
Gen S là gen mã hóa cho các cấu trúc vỏ và bề mặtcủa HBV gồm 3
vùng: pre S1 (108 axít amin) và pre S2 (55 axít amin); hai vùng này mã
hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa
các kiểu gen bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa các kiểu gen.
Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV
[37]
Gen C mã hóa cho các cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29
axít amin) mã hóa cho HBeAg và vùng C (183 axít amin) mã hóa cho
HBcAg. Gen P (832 axít amin) là gen dài nhất mã hóa cho DNA
polymerase và cùng với RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép
ngược của virus.
Gen X gồm 154 axít amin mã hóa cho hai protein của HBV mà
chức năng của chúng là tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao
chép trong quá trình nhân đôi của HBV, cũng như đóng một vai trò chủ
yếu trong sự phát triển thành ung thư gan trên bệnh nhân.
Sự thay đổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn đến sự thay
đổi trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến có
các sự khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên
nhân tạo thành 6 kiểu gen khác nhau của virus này [37].
1.1.3.3. Thành phần cấu trúc kháng nguyên
HBV có ba loại kháng nguyên chính: kháng nguyên bề mặt là HBsAg,
kháng nguyên lõi là HBcAg và HbeAg [15], [43].
HBsAg (Hepatitis B surface antigen) được tìm thấy ở huyết thanh
và trong tế bào gan của người bị nhiễm HBV dưới dạng hoàn chỉnh hay
không hoàn chỉnh. Kháng nguyên bề mặt này có hai dạng hình cầu và
hình ống. Thành phần cấu tạo của hai dạng này gồm protein, lipid,
carbonhydrat, nhưng không có acid nucleic nên được xem là dạng không
hoàn chỉnh của HBV. HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được
dùng để xác định nhiễm HBV [15], [43].
Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV
[15]
HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng
cao dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6
tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang
HBsAg mạn tính [15].
Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus
HBV trong tế bào gan. Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, nếu
trong giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trị số
ban đầu thì có nguy cơ trở thành người mang virus mạn tính [12].
HBcAg (Hepatitis B core antigen) tìm thấy trong tế bào gan của người
nhiễm HBV. Trong huyết thanh, HBcAg hiện diện như một thành phần của
virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do [43].
1.1.3.4. Cơ chế nhân lên của
HBV
Quá trình sao chép của HBV có thể được chia làm nhiều bước: 1.
Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; 2. Xâm nhập của virus vào tế bào (sự
nhập bào);
3. Phóng thích bộ gen virus; 4. Biểu hiện các sản phẩm gen virus; 5. Sao
chép bộ gen virus; 6. Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh); 7.
Phóng thích virus [2].
Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt, xác
định tính hướng cơ quan của virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ
thể tương ứng trên bề mặt tế bào. Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong
máu tìm cách gắn kết vào tế bào chủ. Nhiều bằng chứng cho thấy, một
vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể. Sự gắn kết
cũng có thể qua trung gian albumin huyết thanh người đã biến đổi. Vì thế,
HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi như một phương tiện
chuyên chở để vào tế bào gan [2].
Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ
ngoài HBV có protein dung hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã
kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung hợp màng virus với
màng tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc
virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [2].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân
là
25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy nhiên, hạt lõi
có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl
hóa. Vì kích cỡ của hạt lõi lớn nên sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy
ra khi bộ gen của virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase
virus nối đồng hóa trị [3].
Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]
Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên
mã không qua xử lí ghép nối. Không có protein nào được mã hóa
bởi mạch dương. Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không
bằng nhau được chui vào nhân và chuyển thành dạng cccDNA. Dạng này
được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích thước khác
nhau 3,5; 2,4; 2,1; và
0,7Kb. Trong đó, mRNA 3,5Kb gọi là RNA tiền genome, dùng làm khuôn
để tổng hợp bộ gen. Các mRNA còn lại được gọi là dưới genome, dùng để
tổng hợp các protein khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein
lõi C và preC, polypeptide X, protein bề mặt S và protienkinase. Các
mRNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất [13].