Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế
phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” là kết quả của quá trình
học tập và nghiên cứu của bản thân tôi tại trường Đại học Dược Hà Nội trong
suốt hơn hai năm qua. Để có được kết quả cuối cùng này, tôi xin chân thành
cảm ơn các thầy cô tại trường đại học Dược Hà Nội, những người đã truyền đạt
những kiến thức làm nền tảng cho tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người đã
dành rất nhiều tâm huyết, trí tuệ và thời gian giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Phạm Thị Thanh
Hà, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người đã nhiệt
tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Phân tích - Độc chất trường Đại học
Dược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòng
Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ,
giúp đỡ tôi tận tình.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2009
Đỗ Lan Phương


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................1

Chương 1: TỔNG QUAN......................................................................................3
1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN.....................................................3

1.1.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản ................................3
1.1.2. Đặc điểm của điện di mao quản ....................................................4
1.1.3. Phân loại điện di mao quản............................................................4
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM................................................................................5

1.2.1. Cấu trúc hóa học............................................................................5
1.2.2. Tính chất vật lý ............................................................................5
1.2.3. Tác dụng dược lý và phổ tác dụng.................................................6
1.2.4. Dược động học .............................................................................6
1.2.5. Chỉ định ........................................................................................7
1.2.6. Thực trạng chất lượng của các chế phẩm chứa cefixim trên thị
trường Việt Nam hiện nay..............................................................7
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM......................................................9

1.3.1. Các phương pháp dược điển..........................................................9
1.3.2. Các phương pháp ngoài Dược điển ............................................13
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG
THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG....................................................................16

1.4.1. Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction) .................16
1.4.2. Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng ..............................................16
1.4.3. Phương pháp kết tủa protein .......................................................17


Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.............................................................................18

2.1.1. Các chế phẩm có chứa cefixim....................................................18
2.1.2 Mẫu huyết tương chứa cefixim.....................................................18
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU.....................................................................................18

2.2.1. Chất chuẩn đối chiếu...................................................................18
2.2.2. Hóa chất, dung môi.....................................................................19
2.2.3 Thiết bị và dụng cụ.......................................................................19
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................20

2.3.1. Nội dung nghiên cứu...................................................................20
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................20
Chương 3: KẾT QUẢ.........................................................................................23

3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP...................................................................23
3.1.1. Khảo sát quy trình chiết cefixim trong huyết tương ...................23
3.1.2. Lựa chọn chất chuẩn nội..............................................................25
3.1.3. Xác định điều kiện điện di...........................................................26
3.1.4. Kết luận........................................................................................32
3.2. XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG CHẾ PHẨM..........................................................32

3.2.1. Xác định điều kiện phân tích.......................................................32
3.2.2. Xử lý mẫu....................................................................................33
3.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích..............................................34
3.2.4. Kết quả định lượng cefixim trong chế phẩm...............................40
3.2.5. So sánh kết quả phương pháp định lượng đã xây dựng với
phương pháp HPLC (BP 2008)...................................................43
3.3. XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG....................................................46

3.3.1. Xử lý mẫu huyết tương................................................................46
3.3.2. Thẩm định phương pháp..............................................................46

3.3.4. Định lượng cefixim trong huyết tương thỏ..................................52
Chương 4: BÀN LUẬN.......................................................................................56
4.1. VỀ ỨNG DỤNG CE TRONG KIỂM SOÁT ĐIỀU TRỊ ..............................................56

4.1.1. Độ nhạy.......................................................................................56
4.1.2. Hiệu ứng nền...............................................................................56
4.1.3. Độ chính xác và độ lặp lại...........................................................57
4.2. VỀ QUY TRÌNH CHIẾT LOẠI BỎ PROTEIN TRONG HUYẾT TƯƠNG.......................57

4.2.1. Chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn..................................................57
4.2.2. Loại protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ...............58
4.3. VỀ SO SÁNH 2 KỸ THUẬT HPLC VÀ CE VỚI PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG CHẾ
PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG.................................................................59

4.3.1. Trong chế phẩm...........................................................................59
4.3.2. Trong huyết tương......................................................................59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................62
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AUC

: Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve)

BP

: Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)

Cmax

: Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration)

CZE

: Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

CE

: Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CPDASP

: 3-[(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulphonat

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perfomance Liquid
Chromatography)

IS

: Chuẩn nội (Internal Standard)

LOQ

: Giới hạn định lượng ( Limit of Quantification)

LOD

: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

MEKC

: Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic
Chromatography)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

PA

: Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis)

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD

: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SDS

: Sodium dodecyl sulfat

SKS

: Số kiểm soát

S/N

: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

STT

: Số thứ tự


TBAOH

: Tetrabutyl amoni hydroxyd

Tmax

: Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

TLTK

: Tài liệu tham khảo

USP

: Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia)


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản................................................................4
Bảng 1.2:Một số thuốc cefixim bị đình chỉ lưu hành do không đạt tiêu
chuẩn về hàm lượng cefixim trong năm 2008, 2009.......................8
Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng
kỹ thuật HPLC...............................................................................11
Bảng 1.4: Một số chương trình định lượng cefixim trong huyết tương bằng
HPLC..............................................................................................14
Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim bằng điện di mao quản..
.........................................................................................................15
Bảng 3.6: Xác định sự phù hợp của hệ thống điện di......................................34
Bảng 3.7: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định khoảng nồng độ tuyến tính........37
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính................................................37
Bảng 3.9: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định độ đúng của phương pháp.........39
Bảng 3.10: Kết quả xác định độ đúng..............................................................39
Bảng 3.11: Kết quả xác định độ lặp lại............................................................40
Bảng 3.12: Kết quả định lượng cefixim trong viên nén .................................43
Bảng 3.13: Kết quả định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg...............42
Bảng 3.14: Các bước tiến hành định lượng.....................................................43
Bảng 3.15: So sánh hai phương pháp HPLC và CE........................................45
Bảng 3.17: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trong huyết tương
.........................................................................................................50
Bảng 3.18: Nồng độ tìm lại được của mẫu chuẩn cefixim tại các thời điểm
trong ngày....................................................................................51
Bảng 3.19: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết....................................................52
Bảng 3.20: Kết quả định lượng cefixim trên huyết tương thỏ.........................54

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di.......................................................................3
Hình 3.2: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim pha trong huyết tương trắng tại
các pH khác nhau: a) pH 6,0, b) pH 6,8, c) pH 9,0.....................28
Hình 3.3: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim tại các nồng độ đệm khác nhau: a)
10 mM, b) 20 mM, c) 30 mM, d) 50 mM....................................29
Hình 3.4: Phổ UV của cefixim.........................................................................31
Hình 3.5: Điện di đồ mẫu trắng (Đệm phosphat 50 mM điều chỉnh đến pH
6,8 bằng acid phosphoric 0,1M).....................................................35
Hình 3.6: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim và IS...............................................35
Hình 3.7: Điện di đồ mẫu thử cefixim và IS....................................................35
Hình 3.8: Điện di đồ của cefixim trong sự có mặt của các cephalosporin khác......36
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tỉ số diện
tích pic............................................................................................38
Hình 3.10: Điện di đồ thu được từ viên nén Fimabute 200 mg.......................41
Hình 3.11: Điện di đồ định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg............42
Hình 3.12: Cefixim và IS pha trong hỗn hợp MeOH và đệm Natri phosphat
50mM, pH 6,80 ( tỷ lệ 2:8 theo thể tích)........................................47
Hình 3.13: Huyết tương trắng..........................................................................47
Hình 3.14: Huyết tương trắng có pha chuẩn cefixim và nội chuẩn IS.............47
Hình 3.15: Điện di đồ của cefixim trong sự có mặt của một số thuốc khác
........................................................................................................48
Hình 3.16: Đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic và nồng
độ cefixim pha trong huyết tương trắng.......................................48
Hình 3.17: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim nồng độ 1,0 µg/mL ở 283 nm.......49
Hình 3.18: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 1h uống thuốc.............................55
Hình 3.19: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 2h uống thuốc.............................55

Hình 3.20: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 3h uống thuốc.............................55


Hình 3.21: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 4h uống thuốc.............................55


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có nhiều ưu điểm
nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn với
các chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả
năng khuyếch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập
vào được và có thời gian bán hủy lâu hơn. Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và
đạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng
đường tiêm như nhiều kháng sinh khác nên rất dễ sử dụng. Chính vì thế trong
vài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới
nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch. Tuy nhiên,
cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao
nhất. Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ
lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime
(cefixim 200 mg, Ấn Độ), viên nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viên
nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc).
Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về Cefixim, việc
kiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở. Trong các dược điển BP 2008 và
USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC. Việc định lượng
Cefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu
trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả
năng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chi
phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại.

Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiên
cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểm
như hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại. Cho đến
nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnh
vực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế.


2
Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và
trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu:
1. Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim
trong chế phẩm và trong huyết tương.
2.

Định lượng hoạt chất này trong một số chế phẩm đang lưu hành trên
thị trường cũng như xác định nồng độ hoạt chất này trong mẫu huyết
tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN

Điện di mao quản (capillary electrophoresis: CE) là một kỹ thuật tách các
chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các tiểu phân trong mao quản
chứa dung dịch chất điện ly nền dưới tác dụng của điện trường
1.1.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản [4], [6], [25], [37]

Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di
Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm,
đường kính trong 25 - 100 µm, đường kính ngoài 300 - 400 µm. Sử dụng áp
suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản. Điện thế một
chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách: các chất phân tích được
phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di chuyển về một đầu mao quản.
Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD. Vị
trí phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”. Cửa sổ này có được
bằng cách đốt đi một đoạn lớp bao polyimid để mao quản đó trở thành ống
thủy tinh trong suốt.
1.1.2. Đặc điểm của điện di mao quản [4], [6], [25], [37]


4
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong ống mao quản thủy tinh hoặc
Teflon có đường kính trong 25 - 100 µm.
- Điện thế rất cao, thường từ 10 - 30 kV (200 - 500 V/cm) được đặt ở hai
đầu ống mao quản.
- Số đĩa lý thuyết của cột mao quản rất lớn, thường từ 10 5 - 106 nên có
khả năng tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp.
- Thể tích mẫu tiêm rất nhỏ, cỡ 5 - 50 nl nên tiết kiệm mẫu.
- Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt
của chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại.
- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn.
1.1.3. Phân loại điện di mao quản [4]
Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau. Mỗi kiểu có cơ chế tách
riêng. Bảng 1.1 tóm tắt 4 kiểu điện di hay được sử dụng trong phân tích.

Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản
Kiểu điện di
1. Điện di mao quản vùng

Cơ chế tách
Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc

(capillary zone elctrophoresis)
điện tích và kích cỡ ion).
2. Sắc ký điện động mixen MEKC Tương tác phân cực / không phân cực với
(micellar electrokinetic

hạt mixen trong dung dịch và linh độ của

chromatography)
3. Điện di mao quản gel CGE

chất.
Linh độ của chất và tương tác loại cỡ với

(capillary gel electrophoresis)

hạt gel.
Sự phân bố chất phân tích vào pha tĩnh

4. Điện sắc ký mao quản CEC
(capillary electrochromatography)

(hạt nhồi) hoặc pha động (dung dịch điện

ly nền) và linh độ khác nhau của các chất.
Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất,

được sử dụng khá rộng rãi. Kỹ thuật CZE được sử dụng trong nghiên cứu này.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM


5
1.2.1. Cấu trúc hóa học [3], [14]
O

HO

1S
H2 N

O
O

4

2
N

3

1

2

N
H

N

8
7
H

N

1

6
H

2

3

5

CH2

.

3H2O

4

S

O
OH
O

- Công thức phân tử: C16H15N5O7S2.3H2O
- Khối lượng phân tử: 507,5
- Tên khoa học:
- Acid (6R,7R)-7-[(Z)-(2-amino-4-thiazolyl)-2(carboxymethoxyimino)acetamido]-8-oxo-3-vinyl-5-thia-1azabicyclo[4,2,0]-oct-2-ene-2-carboxylic trihydrat.
1.2.2. Tính chất vật lý [3], [14]
Bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm, nóng chảy ở
khoảng 220°C kèm phân hủy. Dễ tan trong methanol, propylen glycol,
dimethyl sulfoxid, glycerin. Rất ít tan trong aceton, ethanol, nước. Không tan
trong diethyl ether, ethylacetat, aceton và hexan. Dung dịch chứa 0,7 mg
cefixim trong 1mL H2O có pH từ 2,6 đến 4,1.
Hệ số phân bố octanol/nước của cefixim trihydrat là 0,0029.
Theo [14] cefixim trihydrat có 3 hằng số ion hóa:
pKa1 = 2,10 do nhóm -COOH của cephem ở vị trí số 2,
pKa2 = 2,69 do nhóm -NH2 ở vị trí số 4 của nhóm amino-thiazol ,
pKa3 = 3,73 do nhóm -COOH của mạch nhánh gắn vào vị trí số 7.
Cefixim trihydrat có 2 đồng phân Z và E trong đó đồng phân Z có phổ


6
hấp thụ cực đại ở 288nm, còn đồng phân E có phổ hấp thụ cực đại ở 233nm.
1.2.3. Tác dụng dược lý và phổ tác dụng [14]
Cefixim là kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được dùng theo đường
uống. Nó có tác dụng diệt khuẩn do ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.
Cefixim có phổ tác dụng đối vi khuẩn Gram âm rộng hơn so với kháng

sinh cephalosporin thế hệ 1 và 2. Do bền vững cao với beta-lactamase nên
nhiều chủng vi khuẩn kháng penicillin và một số kháng sinh cephalosporin do
tiết ra beta-lactamase vẫn có thể nhạy cảm với cefixim.
Hiệu lực lâm sàng đã được chứng minh trên nhiều bệnh nhiễm khuẩn gây
ra bởi những chủng gây bệnh phổ biến như: S. pyogennes; S. agalactiae, S.
pneumoniae; E. coli; P. mirabilis; K. species; H. influenzae; M.catarrhalis
(kể cả những chủng tiết ra beta-lactamase); N. meningitidis; N. gonorrhoeae
(kể cả những chủng tiết ra penicillinase)...
1.2.4. Dược động học [14]
Chỉ có khoảng 40-50% liều dùng cefixim được hấp thu qua đường tiêu
hóa. Thức ăn không ảnh hưởng tới tỷ lệ hấp thu mà chỉ làm chậm hấp thu. Sự
hấp thu cefixim qua đường tiêu hóa không bị ảnh hưởng bởi việc dùng đồng
thời antacid. Nồng độ đỉnh của cefixim trong huyết tương thay đổi tùy theo
dạng viên hay dạng hỗn dịch. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của dạng hỗn
dịch uống cao hơn 20-50% của dạng viên nén. Diện tích dưới đường cong
(AUC) của hỗn dịch uống cao hơn 10-25% của dạng viên nén. Do đó thuốc
viên và hỗn dịch uống không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg. Ở
người trưởng thành khi uống cefixim dạng viên nén, nồng độ đỉnh trong huyết
tương đạt được là 2,0 - 3,0 µg/mL sau 2 giờ khi uống liều 200 mg và 4,0 - 6,5
µg/mL khi dùng liều 400 mg.
Có khoảng 65 - 70% cefixim trong hệ tuần hoàn liên kết với protein
huyết tương. Sự phân bố của cefixim vào các mô và dịch cơ thể là có giới hạn.


7
Cefixim được phân bố vào đờm, amidan, xoang hàm trên, tuyến tiền liệt
nhưng đặc biệt có nồng độ cao trong mật. Thể tích phân bố biểu kiến ở người
lớn khỏe mạnh nằm trong khoảng từ 0,095 - 0,11 L/kg. Thuốc qua được nhau
thai nhưng không thấy bài tiết qua sữa mẹ.
Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tương (T 1/2) từ 3-4 giờ ở người

trưởng thành có chức năng thận bình thường nhưng kéo dài hơn ở trẻ sơ sinh
và người bị suy thận.
Khoảng 20% liều dùng (tương đương khoảng 50% liều hấp thu) được đào
thải dưới dạng không đổi trong nước tiểu trong vòng 24 giờ. Khoảng 60% liều
không được đào thải qua cơ chế hoạt động của thận. Probenecid ức chế thải
trừ cefixim qua ống thận làm tăng nồng độ và kéo dài T1/2 của cefixim trong
huyết tương.
1.2.5. Chỉ định [14]
Cefixim được chỉ định điều trị với các nhiễm khuẩn sau đây gây ra bởi
các vi khuẩn nhạy cảm:
- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính,
- Nhiễm khuẩn đường niệu (có biến chứng và không biến chứng),
- Viêm niệu đạo do lậu cầu.
1.2.6. Thực trạng chất lượng của các chế phẩm chứa cefixim trên thị
trường Việt Nam hiện nay [11]
Theo ông Nguyễn Viết Hùng, Phó Cục trưởng Cục Quản lý dược Việt
Nam, công tác quản lý chất lượng thuốc ở Việt Nam vẫn gặp không ít hạn chế
do trình độ, cơ sở vật chất, nhân lực kiểm nghiệm mỏng và sự lỏng lẻo trong
khâu quản lý.
Thực trạng này khiến số lượng thuốc không đạt chất lượng được tung
ra thị trường vẫn chiếm một tỷ lệ khá cao và tỷ lệ thuốc không đạt tiêu chuẩn


8
chất lượng bị thu hồi ngày càng gia tăng. Nếu như năm 2001 chỉ có 55 loại
thuốc không đạt chất lượng thì năm 2008, con số này tăng lên 99 loại. Chủ
yếu là các dạng thuốc kháng sinh, các chế phẩm enzym. Trong đó thuốc
kháng sinh cefixim chiếm số lượng đáng kể, đặc biệt là các thuốc có nguồn
gốc từ Ấn Độ, Hàn Quốc.
Bảng 1.2: Một số thuốc cefixim bị đình chỉ lưu hành do không đạt tiêu

chuẩn về hàm lượng cefixim trong năm 2008, 2009
STT Tên biệt dược
Xuất xứ
Số đăng ký
Số lô
Kwangmyungcefex Huons Co.Ltd Hàn Quốc VN-8823-04
6003
1
(cefixime 100 mg)
Odazipin
Flamingo
VN-1232-06
130
2
(cefixime 200 mg) Pharmaceuticals
Ceftrimini
Minimed Laboratories
VN-1236-06
119
3
(cefixime 100mg)
Massime
Swiss Pharma, Ấn độ
VN-3245-07
120
4
(cefixim 200mg)
Panazme
SRS Pharmaceutical Pvt, VN-2008-06
PE01

5
(cefixim 200mg),
Ltd Ấn độ
Swetacefix
Sweta Pharmaceutical VN-3838-07 B1801
6
(cefixim 100mg)
Pvt., Ltd Ấn độ
Ngày 01-10-2008, Sở Y tế Khánh Hòa đã ra công văn số 1872/SYTQLD về việc tăng cường kiểm tra chất lượng thuốc chứa cefixim, yêu cầu các
cơ quan đơn vị trực thuộc chú ý đến chất lượng của các loại thuốc kháng sinh
cefixim đang lưu hành trên thị trường. Điều đó cho thấy chất lượng của các
chế phẩm chứa cefixim đang là một vấn đề đáng được quan tâm.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM

1.3.1. Các phương pháp dược điển
a/ Phương pháp hóa học [22]
*Phản ứng tạo phức: Phản ứng của hydroxylamin với các dẫn chất hữu


9
cơ có chứa nhóm chức amin, amid, ester, hydrazid tạo ra acid hydroxamic,
acid này phản ứng với ion Fe3+ trong môi trường acid tạo phức màu đỏ.
b/ Phương pháp hóa lý
*Xác định phổ UV [20], [22]
Nhóm Cephalosporin có liên kết π ở C2 tạo ra phổ UV đặc trưng có cực
đại λmax xác định. Hòa cefixim 0,1 mol/L trong đệm phosphat pH 7. Đo phổ
UV, so sánh với phổ chuẩn, cả 2 phổ phải cùng hấp thụ cực đại tại cùng 1
bước sóng. Với cefixim λmax trong khoảng 246 - 290 nm.
Nhận xét: Phương pháp này nhanh, đơn giản nhưng chịu ảnh hưởng của
nhiều yếu tố nên chỉ thích hợp cho kiểm nghiệm nguyên liệu.

*Phổ cộng hưởng từ hạt nhân [20]
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc hạt nhân của một số nguyên tố
trong từ trường có thể bị phân thành các mức năng lượng khác nhau. Sự hấp
thụ một số bức xạ điện từ thích hợp làm thay đổi sự phân bố của chúng trong
các mức. Bằng các biện pháp thích hợp người ta làm xuất hiện các tín hiệu
tương ứng với các nguyên tố đặc biệt trong nhóm chức, cũng như tương tác
giữa các nhóm chức.
Hòa tan 0,05g Cefixim trong 0,5 mL hỗn hợp deuterated dimethyl
sulfoxid và H2O (4:1). Xác định phổ, dùng tetramethyl sulfoxid làm chất
chuẩn đối chiếu cho tín hiệu đơn bội A tại δ=4,7 ppm và cường độ tín hiệu
đơn bội B tại δ= 6,5 ppm và 7,4 ppm ( tỉ lệ cường độ 2 tín hiệu 1:1)
Nhận xét: Phương pháp này có thể được ứng dụng trong cả định tính và
định lượng, có ưu điểm là không phân hủy mẫu và tốn ít thời gian.Tín hiệu
cộng hưởng tỉ lệ với số hạt nhân cộng hưởng tại tần số đó cho phép xác định
tỷ lệ tương đối giữa các thành phần trong hỗn hợp. Nếu có chất đối chiếu có
thể xác định được nồng độ các chất.
* Đo năng suất quay cực [20]


10
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc một số chất có khả năng quay
mặt phẳng của các chùm tia phân cực đi qua nó. Những chất như vậy được gọi
là chất hoạt quang . Các chất hoạt quang phải có ít nhất 1 cacbon bất đối. Góc
quay cực của các chất lỏng hay dung dịch được đo bằng phân cực kế. Căn cứ
vào góc quay cực đo được, so sánh với các chỉ tiêu nêu trong tài liệu ta có thể
định tính, thử tinh khiết và định lượng.
Với Cefixim khi hòa tan 0,45 g cefixim trong NaHCO3 khan (tỉ lệ 1:50)
đo năng suất quay cực thu được [α]D20 : - 75 đến -88o, bề dày dung dịch 10 mm.
Nhận xét: Phương pháp này tiến hành đơn giản, có thể ứng dụng để định
tính, thử tinh khiết và định lượng cefixim.

*Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trong hầu hết dược điển các nước đều đưa ra quy trình định lượng cefixim
trong chế phẩm. Các dược điển đều dùng sắc ký lỏng pha liên kết C18 có chiều
dài khác nhau trong pha động TBAOH có pH 6,5 được điều chỉnh bằng H3PO4
và MeCN. Bảng sau trình bày 1 số phương pháp trong các dược điển:


11
Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC

STT

Cột

Pha động
25 mL TBAOH + H2O đủ 100 mL,

C18
1

chỉnh pH đạt 6,5 bằng H3PO4 0,1 M(dung

(250-300
mm

x

mm, 7 µm)

4

dịch A),
290 mL dung dịch A + 110 mL MeCN
bằng pha động.

Lưu lượng
(mL/phút)
Điều

chỉnh

sao cho thời
gian lưu là 9
phút

V mẫu

λ

Chuẩn nội

Acid
10 μl

254 nm naphtalen
sulfonic

TLTK

2[22]

12
25 mL TBAOH+H2O đủ 100 mL, chỉnh

C18
2

(125 mm x
4,6 mm, 4
µm)
C18

3

pH đạt 6,5 bằng H3PO4 0,1 M(dung dịch
A),
300 mL dung dịch A + 100mL MeCN
bằng pha động.
250 mL TBAOH +H2O đủ 1000 mL,

(125 mm x chỉnh pH đạt 6,5 bằng
4

mm,

µm)

H3PO4 0,1 M

5 (dung dịch A), 300 mL dung dịch A +100
mL MeCN bằng pha động.

Điều

chỉnh

sao cho thời 10 μl
gian lưu là 10

254 nm -

[40]

phút

1,0 mL/phút

[20],

10 μL

254 nm -

[13]


13
1.3.2. Các phương pháp ngoài Dược điển
Bên cạnh các phương pháp chính thức quy định trong các dược điển cho

định lượng Cefixim đã có nhiều phương pháp khác được sử dụng trong các
tiêu chuẩn cơ sở hoặc được công bố trên các sách chuyên khảo và tạp chí. Các
phương pháp này được gọi chung dưới tên các phương pháp ngoài dược điển.
*Vôn –Ampe [18]
Đây là một nhóm các kỹ thuật phân tích điện hóa mà thông tin về chất
phân tích được lấy ra từ sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế
trong quá trình điện phân dung dịch phân tích. Sự phụ thuộc trên được biểu
diễn dưới dạng đường cong von-ampe. Đường cong này được xây dựng trên
hệ tọa độ E-I, I là cường độ dòng điện qua mạch điện phân, E là điện thế đặt
lên hai điện cực
Phân tích cefixim theo kỹ thuật Vôn-ampe trên nguyên tắc oxi hóa
cefixim và quá trình khuyếch tán có kiểm soát phụ thuộc vào pH. Dùng đệm
phosphat pH 4,5 cho phép phát hiện cefixim nồng độ 6.10 -6 đến 2.10-4 trong
huyết tương, 8.10-6 đến 2.10-4 trong nước tiểu và 6.10-6 đến 10-4 trong sữa.
Nhận xét: Kết quả phân tích bằng phương pháp vôn-ampe thu được
tương tự như kết quả thu được bằng phân tích quang phổ UV. Tuy cả hai
phương pháp đều đơn giản, phương pháp vôn-ampe ưu điểm hơn do không bị
ảnh hưởng bởi hiệu ứng nền, có độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn do có khả
năng pha loãng mẫu cao hơn. Phương pháp này có thể ứng dụng trực tiếp
trong phân tích các chế phẩm thuốc và dịch sinh học mà không cần phải phân
tách và xử lý mẫu phức tạp vì không bị ảnh hưởng bởi tá dược và các tạp chất.
Phương pháp này còn có ưu điểm là rất nhanh chóng, chỉ mất dưới 5 phút cho
một mẫu do đó đây là phương pháp phân tích tốt để phân tích cefixim trong
chế phẩm và trong dịch sinh học và có thể dùng thay phương pháp HPLC
trong kiểm soát điều trị.


14
*Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Đây là phương pháp thông dụng nhất trong các nghiên cứu định lượng

Cefixim trong dịch sinh học do tính chất phổ biến của phương pháp và của
thiết bị. Do hàm lượng hoạt chất trong dịch sinh học rất thấp, mặt khác phải
loại protein ra khỏi mẫu trước khi phân tích nên so với phương pháp định
lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC thì định lượng trong
huyết tương có một số khác biệt: nếu định lượng trong chế phẩm, pha động là
hỗn hợp của MeCN và TBAOH, pH của pha động thường trung tính thì định
lượng trong huyết tương, pha động thường là hỗn hợp của đệm phosphat và
dung môi hữu cơ (MeOH hoặc MeCN), pH của pha động thường acid.
Bảng 1.4 trình bày 1 số quy trình định lượng cefixim trong dịch sinh học

bằng HPLC


15

STT
1

2

3
4
5

Cột
Zorbax SB C8

Pha động
MeCN – H2O – acid formic

(150mm x 4,6mm, 5µm) (40: 60: 0,5; v/v/v)
Hibar Lichrospher RP 8

KH2PO4 0,025 M, pH 2,2 –

(250mm x 4,0mm, 5µm) MeOH (75: 25, v/v)
Nucleosil C18

MeOH–

Đệm

phosphat

(200mm x 4,0mm,5µm)
Ultraspher C8

57,4mM pH 5,2 (15: 85, v/v)
MeCN – đệm phosphat 0,01

(150mm x 4,6 mm,5µm) M, pH 2,7 (15: 85, v/v)
TSK-LS410 ODS,
MeCN – đệm phosphat 0,01
(150mm x 4,6mm, 5µm) M, pH 2,7 (15:85, v/v)

Lưu lượng

LOQ

(mL/phút)

(µg/mL)

0,5

0,05

1,2

0,2

1,5

0,229

1,5

0,3

1,5

0,2

Detector
LCMS/MS
UV 280
nm
UV 230
nm
UV 280

nm
UV 295
nm

Chuẩn nội

TLTK

Cefetamet

[28]

-

[43]

-

[21]

7- hydroxy
coumarin

[30]

-

[34]