ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT CỦA NẤM Phytophthora spp. Ở MIỀN NAM VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ITSrDNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT
CỦA NẤM Phytophthora spp. Ở MIỀN NAM
VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SO SÁNH TRÌNH TỰ ITS-rDNA

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRỊNH ĐÌNH HƯNG

Niên khóa

: 2004 - 2008

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT
CỦA NẤM Phytophthora spp. Ở MIỀN NAM
VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SO SÁNH TRÌNH TỰ ITS-rDNA

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

TRỊNH ĐÌNH HƯNG

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Con kính gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, những người thân đã sinh ra con, nuôi
dưỡng con và luôn bên cạnh đông viên con trong học tập.
Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến:
TS. Lê Đình Đôn, người luôn tân tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian
làm đề tài.
KS. Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng giúp đỡ suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Các anh chị làm việc tại trung tâm phân tích CNSH và Môi Trường,
cũng như các anh chị phòng 105.
Tập thể lớp DH04SH đã luôn sát cánh bên tôi chia sẻ vui buồn trong 4

năm trên giảng đường đại học.
Những người bạn thân quanh tôi luôn động viên, chia sẻ niềm vui nỗi buồn.

Sinh viên thực hiện
Trịnh Đình Hưng

i


TÓM TẮT
Nấm phytophthora là một trong những nấm gây hại nghiêm trọng trên cây trồng vì nó
có thể gây hại trên nhiều loại cây cũng như trên nhiều bộ phận của cây, làm sản lượng
nông nghiệp ở nước ta giảm hàng năm, gây ảnh hưởng đến đời sống của người
dân.Việc phát hiện kịp thời và tiêu diệt sớm loài nấm này có ý nghĩa quan trọng trong
nông nghiệp. Trên cở sở những kết quả đạt được từ việc nghiên cứu về hình thái và
sinh thái của nấm Phytophthora, chúng tôi đã đưa ra một qui trình định danh nấm
Phytophthora . Quy trình định danh bao gồm quá trình tăng và nhân sinh khối, ly trích
DNA tổng số sau đó sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 nhằm khuếch đại vùng trình tự
đặc trưng ITS1-5,8S-ITS2. Kết hợp kết quả định danh hình thái và sự tương đồng di
truyền với các loài tương ứng trên NCBI để xác định chính xác tên loài của 9 mẫu
nấm. Tiến hành phân nhóm những mẫu Phytophthora đã định danh được thông qua
trình tự vùng ITS-rDNA, phân nhóm những mẫu nấm này dựa vào trình tự vùng ITS1
và trình tự vùng ITS2 để xác định vùng bảo tồn đặc trưng cho Phytophthora. Sau quá
trình thực hiện nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình ly trích DNA đối với nấm
Phytophthora. Đã thiết lập và hoàn thiện qui trình phản ứng PCR khuếch đại được
vùng ITS – rDNA (ITS1– 5.8S – ITS2) bằng cặp primer ITS4 và ITS5. Xác định được
tên chính xác của 8 mẫu nấm Phytophthora thu thập ở Miền Nam Việt Nam. Xây dựng
cây phân nhóm của 8 mẫu nấm Phytophthora định danh được với các loài nấm trên
NCBI. Xác định được trình tự vùng ITS2 có tính bảo tồn cao đối với Phytophthora (82100%), có ý nghĩa trong việc phân biệt nấm Phytophthora ở mức độ loài. Việc phân
nhóm dựa vào trình tự vùng ITS1 đặc trưng cho từng loài hơn, cho độ tin cậy cao.

ii


SUMMARY
Phytophthora is once of fungus, which undermine plants seriously, reduced
agriculture yield every year in our country.The timely detection to wipe out early this
fungus is important solve in agriculture. Acording to obtained resultsfrom stydies of
form and ecological Phytophthora, we were suggested a process of identifying for
Phytophthora. The process includes using of PCR (Polymerase Chain Reaction) and using
of sequence technology to amplifies ITS1-5,8S-ITS2 sequense region with two primer, ITS4
( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) and ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’).
Then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA
(Internal Transcribed Space – rDNA) stable with their data on NCBI to identifying
species of Phytophthora. The result show that:
- To optimize DNA isolated protocol for Phytophthora fungus.
- To perfect PCR protocol, with purpose amplify ITS – rDNA region (ITS1– 5.8S
– ITS2) by ITS4 and ITS5 primers.
- Detective actually name of eight species Phytophthora.
- Establishing and clearing the genetic relationship of 8 Phytophthora samples
Included : C2V3,S2, NL, A4, BT, SR500, 503 Cacao and PB235 with Phytophthora
genus in NCBI.
- Compare difference between eight species of Phytophthora throught compare
with the same of ITS – rDNA sequence ( ITS1 and ITS2). ITS2 is the best conserve
region of Phytophthora fungal (82-100%). Establishing and clearing the genetic
relationship base on ITS1 region will give confidence higher. It have benefit for
defication of Phytophthora.

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .........................................................................................................................iii
Tóm tắt ............................................................................................................................... iv
Summary ............................................................................................................................. v
Mục lục .............................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ...............................................................................................viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................... ix
Danh sách các hình ............................................................................................................. x
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về Phytophthora ......................................................................................... 3
2.1.1. Vị trí phân loại .......................................................................................................... 3
2.1.2. Chu kì sống ............................................................................................................... 4
2.1.3. Phân biệt nấm Pythium và Phytophthora ................................................................. 6
2.1.4. Triệu chứng của một số loại cây nhiễm Phytophthora ............................................ 7
2.1.4.1. Trên ớt ................................................................................................................... 7
2.1.4.2. Trên cà tím ............................................................................................................. 8
2.1.4.3. Trên cà chua ........................................................................................................... 8
2.1.4.4. Trên dưa hấu .......................................................................................................... 9
2.1.4.5 Trên sầu riêng ....................................................................................................... 10
2.2. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA ...........................................................11
2.3. Phương pháp thường dùng trong phát hiện và định danh Phytophthora .................. 12
2.3.1. Kỹ thuật quan sát đặc điểm hình thái của Phytophthora ........................................ 12
2.3.2. So sánh sự tương đồng về sinh sản và sinh dưỡng ......................................................................... 13
2.3.3. Izozymes ................................................................................................................. 13

2.3.4. Huyết thanh học và kít chuẩn đoán ........................................................................ 14
iv


2.3.5. Kĩ thuật dùng probe , DNA fingerprinting, Molecular karyotyping ..................... 14
2.3.6. Kỹ thuật PCR( Polymererase Chain Reaction) RAPD .......................................... 15
2.4. Một số công trình nghiên cứu về nấm Phytophthora ................................................ 16
2.4.1. Một số nghiên cứu ngoài nước ............................................................................... 16
2.4.2. Một số nghiên cứu trong nước ................................................................................ 17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 19
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 19
3.2 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 19
3.2.2 Dụng cụ và hóa chất ................................................................................................ 19
3.2.2.1 Ly trích DNA ........................................................................................................ 19
3.2.2.2 Kỹ thuật điện di .................................................................................................... 20
3.2.2.3. Kỹ thuật PCR ....................................................................................................... 20
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 20
3.3.1. Tăng sinh và nhân sinh khối ................................................................................... 20
3.3.2. Ly trích DNA .......................................................................................................... 21
3.3.3. Phản ứng PCR ........................................................................................................ 21
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................... 22
3.4.1. Xử lý trình tự .......................................................................................................... 22
3.4.2. Vẽ cây phát sinh loài .............................................................................................. 22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 23
4.1. Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối ........................................................................... 23
4.2. Kết quả ly trích DNA tổng số Phytophthora ............................................................. 23
4.3. Kết quả chạy PCR ...................................................................................................... 24
4.4. Kết quả giải trình tự ................................................................................................... 25
4.5. Kết quả phân nhóm của các mẫu nấm Phytophthora ................................................ 31
4.5.1 Kết quả phân nhóm dựa vào vùng trình tự ITS – rDNA ......................................... 31

4.5.2 So sánh sự khác nhau giữa các mẫu nấm dựa vào trình tự vùng ITS1 và ITS2 ...... 33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 36
5.1. Kết luận ...................................................................................................................... 36
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................... 36
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................ 37
Phụ lục
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
dATP

deoxyadenosine triphosphate

dCTP

deoxycytidine triphosphate

dGTP

deoxyguanosine triphosphate

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

3’- Deoxyribonucleoside-5’- triphosphate

dTTP

deoxythymidine triphosphate

ETDA

ethylenediamine tetraacetic acid

ITS

Internal Transcribed Spacer

Kbp

kilobase pair

P. citricola

Phytophthora citricola

P.bostryosa

Phytophthora bostryosa

P.capsici

Phytophthora capsici

P.Cinnamomi

Phytophthora cinnamomi

P.infetans

Phytophthora infestans

P.Palmivora

Phytophthora palmivora

Pb

base pair

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Radom Amplified Polymorphism DNA

rDNA

ribosome deoxynucleotide acid

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

UV

Ultraviolet

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bảng ký hiệu các chủng nấm Phytophthora...................................................... 20
Bảng 3.2 Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 μl .................................................. 23
Bảng 3.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ....................................................................... 24
Bảng 4.1 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A1 với các loài trên NCBI ........................ 26
Bảng 4.2 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A2 với các loài trên NCBI ........................ 27

Bảng 4.3 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A3 với các loài trên NCBI ........................ 27
Bảng 4.4 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A4 với các loài trên NCBI ........................ 28
Bảng 4.5 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A5 với các loài trên NCBI ........................ 28
Bảng 4.6 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A6 với các loài trên NCBI ........................ 29
Bảng 4.7 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A7 với các loài trên NCBI ........................ 29
Bảng 4.8 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A8 với các loài trên NCBI ........................ 30
Bảng 4.9 Độ tương đồng di truyền (%) mẫu A9 với các loài trên NCBI ........................ 30
Bảng 4.10 Kết quả định danh tên loài các mẫu trong đề tài ............................................ 31
Bảng 4.11 Độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS1 giữa các mẫu nấm .................................. 34
Bảng 4.12 Độ tương đồng di truyền (%) vùng ITS2 giữa các mẫu nấm ........................... 35

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Nấm Phytophthora inundata sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch V8 .... 3
Hình 2.2 Chu kì sống của Phytophthora ............................................................................ 5
Hình 2.3 Các dạng sống của Phytophthora ....................................................................... 6
Hình 2.4 Hình dạng túi bào tử của Pythium và Phytophthora ........................................... 7
Hình 2.5 Triệu chứng bệnh do P.capsici gây ra trên ớt ..................................................... 8
Hình 2.6 Thối rữa trái trên cà tím do nấm Phytopthora ................................................... 8
Hình 2.7 Bệnh héo rũ cây cà chua do Phytophthora ......................................................... 9
Hình 2.8 Các giai đoạn khác nhau của bệnh thối rữa trái trên cây dưa hấu do Phytophthora .... 10
Hình 2.9 Bệnh thối gốc chảy mủ do nấm Phytophthora palmivora trên sầu riêng ......... 11
Hình 2.10 Vùng trình tự ITS – rDNA .............................................................................. 12
Hình 4.1 Sản phẩm của qui trình ly trích DNA ............................................................... 25
Hình 4.2 Kết quả PCR điện di trên gel agarose 1% ......................................................... 26
Hình 4.3 Kết quả phân nhóm nấm Phytophthora với loài tương ứng trên NCBI ........... 32
Hình 4.4 Kết quả phân nhóm 8 mẫu nấm Phytophthora dựa vào vùng ITS – rDNA ............ 33

Hình 4.5 Kết quả phân nhóm 8 mẫu nấm Phytophthora dựa vào vùng trình tự ITS ................... 34

viii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vào giữa thế kỷ XIX, một loại bệnh lạ đã xuất hiện trên khoai tây, giống như
nấm, đã biến tất cả khoai tây thành bột đen, dẫn tới nạn đói khủng khiếp cho hơn một
triệu người Ireland. Cách đây ba năm, khi một nhóm nghiên cứu đưa ra bằng chứng
DNA lấy từ mẫu lá khoai tây cách đây 150 năm. Phát hiện này đã giải thích được
nguyên nhân gây ra thảm họa chết đói khoai tây của người Ireland: chủng mầm bệnh
Phytophthora, hay còn gọi là hyplotype Ib (gây bệnh tàn rụi muộn ở cây). Theo Jean
Ristaino, nhà bệnh học thực vật thuộc ĐH Bắc Carolina tại Raleigh (Mỹ), trưởng
nhóm nghiên cứu, một chủng Phytophthora khác có tên haplotype Ia mới chính là thủ
phạm. Các nhà khoa học đã lần theo nguồn gốc của mầm bệnh đến tận dãy Andes ở
Nam Mỹ. Bệnh tàn rụi muộn vẫn tiếp tục huỷ hoại những cánh đồng khoai tây và cà chua
trên khắp thế giới. Năm 2001, một trận dịch đã quét sạch vụ khoai tây của nước Nga nguồn thực phẩm quan trọng của phần lớn dân nghèo trên đất nước này. Những trận dịch
với quy mô nhỏ hơn vẫn thường xuyên xảy ra tại Mexico, Ireland, Ecuador, và Mỹ
( />Ở miền Bắc nước ta đã phát hiện được hai loài nấm gây bệnh này, là
Phytophthora citrophthora và nấm Phytophthora citricola. Bệnh làm thối rữa các cánh
hoa, chết nhụy, làm rụng hoa hàng loạt; gây hiện tượng thối nâu trên quả. Đây cũng là
một trong các nguyên nhân gây mất mùa các vùng bưởi đặc sản Phúc Trạch (Hà Tĩnh),
Đoan Hùng (Phú Thọ) và nhiều vùng cam quýt khác. Nấm Phytophthora được xem là
một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho thực vật do sức tàn phá mãnh liệt của nó. Ở
Miền Nam, hàng năm nấm Phytophthora cũng gây ra những hậu quả to lớn, tàn phá
mùa màng, giảm năng suất và sản lượng của cây trồng. Chúng gây ra rất nhều căn
bệnh cho cây trồng như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn rụi lá, thối trái và đặc
biệt nguy hiểm là bệnh mốc sương trên khoai tây. Nhìn chung nấm Phytophthora gây

bệnh trên nhiều loại cây: bưởi, tiêu, khoai tây, sầu riêng, cà chua, và gây hại trên nhiều
bộ phận: thân, lá, rễ, quả. Vì vậy, nhiều nghiên cứu về nấm Phytophthora ở Việt Nam
nhằm mục đích tìm ra phương pháp phòng trừ thật hiệu quả là vô cùng cấp thiết, nhằm
1


để phát hiện sự lây lan, phát triển của bệnh và phát hiện được những chủng đột biến
mới để có phương pháp phòng trừ tốt nhất.
Ngày nay với những tiến bộ của khoa học công nghệ, nhất là công nghệ sinh
học với các kỹ thuật sinh học phân tử, thì việc xác định chính xác tên loài của các
chủng nấm Phytophthora dựa vào vùng DNA bảo tồn không còn là điều vô cùng khó
khăn như trước đây. Với mục đích trên, được sự hướng dẫn của TS.Lê Đình Đôn,
chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Định danh và nghiên cứu sự khác biệt của các loài nấm
Phytophthora spp. ở Miền Nam Việt Nam bằng phương pháp so sánh trình tự vùng
ITS - rDNA ”.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Định danh nấm Phytophthora bằng các kĩ thuật sinh học phân tử. Cụ thể là sử
dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1-5,8S-ITS2
trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để
xác định tên loài và so sánh về sự tương đồng di truyền của vùng ITS-rDNA giữa các
mẫu nấm thu thập ở Miền Nam Việt Nam.
Phân nhóm những mẫu nấm định danh được dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA,
vùng ITS1, vùng ITS2, để từ đó xác định vùng nào có tính bảo tồn, vùng nào có tính
biến động đối với nấm phytophthora.
Hoàn thiện quy trình định danh nấm Phytophthora giúp phát hiện nhanh và kịp
thời sự lây lan của mầm bệnh.
1.3. Nội dung thực hiện
- Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây
trồng ở một số vùng khác nhau.
- Phát hiện gen ITS1-5,8S-ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5.

- So sánh sự tương đồng di truyền vùng ITS-rDNA của các mẫu nấm với loài
tưng ứng với chúng trên NCBI.
- So sánh sự khác nhau giữa các dòng Phytophthora thu thập được thông qua
so sánh sự tương đồng trình tự vùng ITS1 và ITS2.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Phytophthora
2.1.1. Vị trí phân loại
Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (Phyto có
nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại). P.infetans còn được biết như một
loài nấm gây nên bệnh mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện rộng
những vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh này đã
gây nên những tác hại nghiêm trọng cho đất nước, đó là nạn đói và sự ra đi của 2 triệu
cư dân. Sau đó vài thập kỷ lại gây nên một cuộc tranh cãi lớn về bệnh tàn lụi muộn.
Bệnh Phytophthora đã được nghiên cứu ở Châu Âu. Tuy nhiên, đây là một bệnh khá
phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại
ăn quả quan trọng như: bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét than, tàn lụi và thối trái.
Những loài Phytophthora có thể tìm thấy trong đất và nước mà chúng có thể
gây ra những triệu chứng của bệnh thối rễ và cuối cùng là chết. Có ít nhất 300 loài
Phytophthora trên toàn thế giới và ít nhất 13 loài được tìm thấy ở Miền Nam Australia,
bao gồm P. cinnamomi, P. cactorum, P. citriccola, P. megasperma, P. cryptogea và P.
parasitica.

Hình 2.1 Nấm Phytophthora inundata
sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường
thạch V8 (Venche Talgo và ctv, 2007).

3


- Cây tiến hóa của Phytophthora

Ngành

Lớp

Bộ

Chomista

Oomycetes

Lagenidiales

Họ

Giống

Leptomitale
Saprolegnial

Saprolegniace

Achlya
Saprolegnia

Peronosporales Pythiaceae

Pythium
Phytophthora

Peronosporaceae Bremia
Peronospora
Albuginaceae

Albugo

2.1.2. Chu kì sống
Bào tử nấm Phytophthora không nhìn thấy được bằng mắt thường. Dưới kính
hiển vi, hình dạng chính của chúng là hệ sợi, trông giống như những sợi tóc bạc. Bào
tử túi (sporangia) được tạo ra trên những sợi nấm trong những điều kiện ẩm ướt và di
động ở nhiệt độ thích hợp 22 - 280C. Trong mỗi túi bào tử chứa 30 - 40 bào tử động,
có hình dạng xác định và được giải phóng khi có điều kiên thích hợp. Những bào tử
động có thể di chuyển nhờ 2 roi, nó cho phép nấm Phytophthora có thể xâm nhiễm
vào những chóp rễ mới và khỏe mạnh. Những bào tử động có thể sống sót trên 4 ngày.
Khi những điều kiện cho sự phát triển của nấm trở nên ít thuận lợi hơn (thường
là khi đất trở nên khô), những sợi nấm có thể hình thành nên dạng bào tử khác,
chlamydospore (bào tử đảm hay bào tử chống chịu), đây là giai đoạn nghỉ ngơi của
bào tử. Giai đoạn bào tử nghỉ ngơi có thành tế bào dày và có khả năng sống sót trong
đất hoặc mô vật chủ trong nhiều năm, đến khi gặp điều kiên phát triển thuận lợi thì
chúng trở lại hoạt động. Sợi nấm cũng có thể sống sót trên những mảnh thực vật hoặc
trong đất (Robyn Bromley, June 2004).

4

Hình 2.3 Chu kì sống của nấm Phytophthora
( />Khi nấm Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty
(Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào
tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi
bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng
phóng thích ra những bào tử động (Zoospore) với hệ lông roi không đều nhau. Những
bào tử động sau khi được phóng thích ra sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối cùng ngừng
bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở
giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử chống chịu
(Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc
hữu tính bào gồm túi giao tử đực (Antheridium- bộ phận sinh sản đực) và túi noãn
(oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực
và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của nấm Phytophthora. Giai
đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ
tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi
5


thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một
hay nhiều ống giao tử đực. Giống nấm Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản
(Heterothallic) (có hai kiểu lai A1và A2) như P. infestans. Số còn lại là những loại
nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri.

Hình 2.3 Các dạng sống của nấm Phytophthora. (A): Sporangia;
(B): Zoospore ; (C): Chlamydospore ;(D): Oospore)
( />
2.1.3. Phân biệt nấm Pythium và Phytophthora
Khi phân lập các loài nấm Phytophthora, một trong những vi sinh vật mà chúng
ta thường đối mặt là nấm Pythium. Nấm Phytophthora và nấm Pythium đều thuộc họ
Pythiaceae và chúng có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Sự khác nhau giữa hai

giống này bao gồm sự khác nhau về cách tạo ra bào tử động: ở Phytophthora bào tử
động thường sản xuất bên trong túi bào tử, ở nấm Pythium bào tử động phát triển bên
trong nang được sản xuất bởi túi bào tử. Đây là đặc điểm quan trọng nhất dùng để
phân biệt nấm Phytophthora và nấm Pythium.
Ngoài ra, Pythium và Phytophthora spp. có quá trình tái sinh cấu trúc sinh
dưỡng tương tự nhau. Một túi noãn (oogonium) sẽ được thụ tinh bởi một túi giao tử
6


đực (antheridium). Kết quả tạo ra một túi bào tử hai vách dày. Quá trình tái sinh cấu
trúc sinh dưỡng là túi bào tử (sporangia) và cho phép dễ dàng thấy được sự khác nhau
giữa Pythium và Phytophthora. Túi bào tử của Pythium có dạng hình cầu đến oval
hoặc có thể có hình thù không theo quy luật, trong khi túi bào tử của Phytopthora có
hình thù đặc trưng của quả chanh. Đó là những hình dạng chung có thể được dùng để
xác định Pythium và Phytophthora, tuy nhiên sự đa dạng di truyền bên trong mỗi
giống có thể xác định phức tạp hơn nhiều (Jason H. Broc và Glenn H. Beard, 2002)

(b)

(a)

(c)

Hình 2.4 Hình dạng túi bào tử của nấm Pythium và nấm Phytophthora. (a): Pythium
oogonium (O) và Antherridium (A); (b): Pythium Sporagium; (c): Phytophthora Sporangia
(o/pdf/40-02/9-158-07291.pdf).

2.1.4. Triệu chứng của một số loại cây nhiễm nấm Phytophthora
2.1.4.1. Trên ớt
Rễ, thân, lá và trái của những cây ớt trưởng thành rất dễ bị tổn thương. Mặc dù

sự lây nhiễm có thể xuất hiện ở những vùng cao nhất của cây hầu như bệnh thường
xuất hiện vùng gần mặc đất, những vùng tối, và đẫm nước. Nơi thân cây bị thương tổn
trở nên nâu đen rồi đen và cuối cùng thân bong vỏ và cây chết. Những rễ nhiễm bệnh
thường có màu nâu đen và xốp.
Những đốm trên lá đầu tiên nhỏ, không đồng đều sau đó lan rộng toàn bộ lá.
Khi lan rộng, những đốm bệnh có màu nâu sáng và có thể rạn nứt. Những vùng nhiễm
bệnh được phân chia bởi sự phát triển của những sợi nấm trắng trong suốt mùa mưa.
Sự thối rữa nhanh chóng của các lá non và sự thay thế toàn bộ chồi non.
Những quả ớt bị nhiễm bệnh thông qua thân cây. Sự thối rữa quả xuất hiện ở
những vùng có màu xanh đen, ẩm ướt và được phủ lên trên một một lớp sợi nấm màu nâu
đen như bông. Những quả ớt nhiễm bệnh khô, trở nên co quắt lại, nhăn nheo, có màu nâu
và vẫn còn những tàn tích giống như thân cây. (Amanda J. Gevens và ctv, 1994).

7


(a)

(c)

(b)

Hình 2.5 Triệu chứng bệnh do P.capsici gây ra trên ớt(a): Sự tổn thương thân;
(b): Tổn thương ngọn ớt; (c): Thối rữa trái.( />
2.1.4.2. Trên cà tím
Mặc dù toàn bộ cây rất dễ nhiễm bệnh, nhưng thối rữa quả là triệu chứng đầu
tiên gây ra bởi P. capsici trên cây cà tím. Triệu chứng khởi đầu từ một vùng tròn nâu
đen trên bất kì phần nào của trái ở bất kì giai đoạn phát triển nào. Những tổn thương
ban đầu là đường viền bao quanh bởi sự lan rộng nhanh chóng vùng màu nâu sáng.
Phát triển từ trắng đến xám trong suốt mùa mưa, giai đoạn ẩm ướt, bắt đầu trên phần

già nhất của trái bị tổn thương. Nấm Phytophthora gây thối rữa trái trên quả cà tím. Bệnh
thối rữa trái cà tím cũng có thể do các loài nấm như Phytophthora spp. và Phompsis sp.

Hình 2.6 Thối rữa trái trên cà tím do nấm
Phytopthora.( />2.1.4.3. Trên cà chua
Nấm Phytophthora có thể gây nhiễm bệnh trên ngọn, đốm lá và tàn rụi lá ở cây
cà chua. Những ngọn cây nhiễm bệnh có màu nâu và mềm, những cây nhiễm bênh này
thường dễ bị héo và ngã đổ phần trên. Triệu chứng chung khác thường gặp là thối rữa
trái. Những trái không bị tổn thương ở bất kì độ tuổi nào cũng có thể bị nhiễm bệnh.
Sự thối rữa hầu như phổ biến ở những vùng trái tiếp xúc với đất và bắt đầu có bóng
tối, hoặc những vùng ẩm ướt. Những đốm bệnh lan rộng nhanh chóng trong suốt thời
tiết ấm áp và bao phủ 50% hoặc hơn trên bề mặt trái, với sự xuất hiện của những vùng
đồng tâm. Đầu tiên, những trái bị nhiễm bệnh vẫn còn trơn mượt và rắn chắc mặc dù
8


sự bạc màu đã lan rộng đến trung tâm trái. Sau thời gian đó và dưới điều kiện ẩm ướt,
trái nhiễm bệnh được phủ một lớp nấm trắng và thối rữa hoàn toàn khi bị sự xâm
nhiễm của một vi sinh vật thứ hai. Những triệu chứng của bệnh thối rữa trái trên cây cà
chua gây ra bởi loài nấm khác Phytophthora spp. , P. dreschlera và P. parasitica về cơ
bản giống nhau. Sự thối rữa trái cà chua gây ra bởi P.infestans (tàn rụi muộn) thì nhăn
nheo, bờ mép lõm hóp.

Hình 2.7 Bệnh héo rũ cây cà chua do nấm
Phytophthora.( />2.1.4.4. Trên dưa hấu
Triệu chứng bệnh tàn rụi trên lá dưa hấu là khô và trở nên nâu và chết muộn.
Tuy nhiên, tất cả các giai đoạn của cây dưa hấu có nguy cơ nhiễm bệnh cao. Triệu
chứng sớm của bệnh thối rữa trái bao gồm sự lan rộng nhanh chóng, không đều của
những vùng tổn thương màu nâu rồi lan rộng thành hình oval. Những vòng tròn đồng
tâm có thể xuất hiện trong phạm vi vùng bị tổn thương. Những vùng trung tâm thối rữa

được phủ lên một màng nấm trắng, trong khi ở mép ngoài xa hơn của vùng nhiễm
bệnh có màu nâu đen và ướt. Cuối cùng toàn bộ trái bị thối rữa. Những triệu chứng
ban đầu của vi khuẩn gây sưng trái dưa hấu cũng tương tự như P. capsici. Tuy nhiên,
sau khi những vùng tổn thương lan rộng, thì hai bệnh này có thể dễ phân biệt vì sự lan
rộng ra ngoài, sự hiện của màng nấm và những triệu chứng khác liên hệ với vi khuẩn
gây sưng trái, Phytophthora gây thối rữa.

9


Hình 2.8 Các giai đoạn khác nhau của bệnh thối rữa trái trên cây dưa hấu do nấm Phytophthora.
( />
2.1.4.5. Trên cây sầu riêng
Nấm Phytophthora palmivora gây hại trên sầu riêng từ giai đoạn vườn ươm đến
cây trưởng thành và cây đang cho trái, trên rễ, thân, lá và trái. Trên rễ: cây sầu riêng
trồng trên vùng đất thấp, ẩm độ cao thì rễ dễ nhiễm nấm Phytophthora và thường thấy
các rễ non bị thối có màu nâu đen, rễ chết dần làm cây phát triển chậm, sau đó nấm lây
lan dần đến phần thân cây phía trên làm chảy nhựa thân, bộ lá chuyển màu vàng cây
không phát triển và chết dần. Trên thân, cành: cây nhiễm bệnh có bộ lá không còn
bóng mượt và chuyển màu vàng, sau đó rụng theo từng cành hay một phía của cây, bộ
rễ phía dưới bị thối. Trên thân có dấu hiệu chảy nhựa ra trên bề mặt vỏ cây, vết bệnh
ướt và nhựa có màu nâu, nấm thường tấn công xung quanh gốc và các cành của cây
sầu riêng. Nếu cây bị hại nặng vết bệnh sẽ phát triển xung quanh thân chính và cành
làm cho bộ lá biến màu vàng úa cuối cùng làm cây chết vì không được cung cấp dinh
dưỡng. Khi cạo lớp vỏ bị bệnh ra thấy phần gỗ có màu nâu sẫm chạy dọc theo thân và
cành. Trên lá: vết bệnh đầu tiên là những đốm đen nâu nhỏ trên mặt lá và lan rất
nhanh, sau 2 ngày lá chuyển thành màu nâu và bào tử nấm lây sang lá kế cận, lá bị
nhũng rồi khô dần và sẽ rụng sau vài ngày, khi có mưa kèm theo gió mạnh sẽ là điều
kiện tốt cho bệnh lây lan khắp cả vườn. Trên trái: vết bệnh khởi đầu là một vài chấm
nhỏ màu nâu đen thường xuất hiện ở vị trí dọc theo chiều từ cuống trái sầu riêng trở

xuống xung quanh trái, hiếm thấy vết bệnh ở phần cuối trái, sau đó phát triển thành
hình tròn hay loang lỗ và có màu nâu trên vỏ trái. Khi trái già vết bệnh nứt ra và phần

10


thịt bên trong bị thối, có rất nhiều sợi nấm màu trắng trên vết bệnh và làm trái sầu
riêng rụng trước khi chín. (KS. Nguyễn Văn Đức Tiến và Nguyễn Thị Lệ Thoa, 2008)
a)

b)

c)

Hình 2.9 Bệnh thối gốc chảy mủ do nấm Phytophthora palmivora trên sầu riêng
( />
2.2. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA
rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome, có nhiều bản sao
và không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ
sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay
khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hoá, phát sinh
loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật cũng như các dòng
nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc
vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không chính xác và cần
khoảng thời gian dài (Guarro và cs, 1999).
rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer là vùng kém
bảo tồn nhất của rDNA). Vùng 5.8S – rDNA có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi
(Szymanski và cs, 2001). Vùng ITS – rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù
chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn
các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hoá trong cùng loài để lập phổ

hệ di truyền (Guarro và cs, 1999).
Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho
tất cả sinh vật cùng giới nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh,
tạo phổ hệ di truyền. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các
vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và cs,
1996). Các primer chúng tôi sử dụng trong đề tài này cũng được thiết kế theo hai dạng
trên. Vùng ITS, các primer được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn 18S, 5.8S và 28S.
Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế, sàng lọc dựa trên vùng 5.8S – rDNA của N.
11


crassa, Schizosaccharomyces pombe và S. cerevisiae, Vicia faba chuột. Vùng 28S –
rDNA của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế
ITS4. Primer ITS5 có trình tự dựa vào vùng 18S – rDNA của N. crassa, có đầu 5’ chỉ
cách primer ITS1 25 bp (White và cs, 1989).

Hình 2.10 Vùng trình tự ITS – rDNA
2.3. Phương pháp thường dùng trong phát hiện và định danh Phytophthora
2.3.1. Kỹ thuật quan sát đặc điểm hình thái của Phytophthora trên môi trường nuôi cấy
Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử
dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh.
Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm:
hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng, sự hiện diện của bào tử vách dày và sợi
nấm trương phồng, sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức hữu tính là cùng tản
hay khác tản.
Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8
juice, cà rốt agar, lima bean agar.
Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái
đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ
phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường

nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora
Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài
P.capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự
hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm

12


xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi
trường nuôi cấy .
Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức. Nó không phải là
giải pháp tốt cho kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và Irwin,
2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng thời
kỹ thuật quan sát hình thái với các kĩ thuật hiện đại về sinh học phân tử.
2.3.2. So sánh sự tương đồng về sinh sản và sinh dưỡng
Kĩ thuật so sanh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định
và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kĩ thuật so
sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu quần
thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không nhiều về di
truyền và cơ chế.
Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó
khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường
thuần khiết. Tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác
nhau của các loài định sẵn có thể không có giá trị, một số cá thể trong quần thể nấm có
thể không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kỳ những chủng
kiểm tra đã biết.
So sánh về sinh dưỡng hay dị thể hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về mối
liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa vào
khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau.
Kỹ thuật này được sử dụng như một kĩ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong

các loài nấm, đột biến dinh dưỡng- sinh trưởng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit).
2.3.3. Izozymes
Trong phân tách Izozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các
mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có
rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các
enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacryamide, hoặc màng cellulose acetate
cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa
enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện
13


diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ trong cấu hình acid amino có thể thay đổi trong
cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những enzyme
này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau bao gồm những điều kiện trên sinh vật như: tốc
độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm
và chuẩn bị mẫu.
Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian
chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột (Miroslav Zeidler, 2000).
2.3.4. Huyết thanh học và kít chuẩn đoán
Việc ứng dụng kháng thể trong kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có nguồn
gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản
xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần phải hiểu
biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hòa tan)
đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặt biệt. Vấn đề gặp phải với kháng thể sử dụng
là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mô cây hay đất.
Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chuẩn đoán và phát hiện
ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài hay các
chủng đặc biệt.
Các kit chuẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mần bệnh từ đất dựa vào
kĩ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự

cần thiết của các chuẩn đoán nhanh và chính xác.
2.3.5. Kĩ thuật dùng probe acid nucleic, DNA

fingerprinting và Molecular

karyotyping
Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn
DNA giới hạn được tạo dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica
(Goodwin và cs, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi xác định các loài nấm
phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện
trong các loài đã biết.
Một số ứng dụng khác của probe acid nucleic gần đây là việc sử dụng các probe
DNA Minisatellite trong kĩ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cs, 1985). Các probe
rất nhỏ được sử dụng trên rất nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo dõi phả hệ,
14


chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm. Minisatellite probe,
probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới loài và cả những
dòng clone (Rodriguez, 1989).
2.3.6. Kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt
Đây là kỹ thuật quan trọng của nghiên cứu vì quá trình PCR có khả năng
khuếch đại đoạn DNA cần thiết lên số lượng lớn với cặp mồi đặc trưng. Trong nghiên
cứu này chúng tôi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng trình tự ITS –
rDNA.Trong kỹ thuật này chúng ta cần phải lưu ý đến các yếu tố như: nồng độ DNA
mẫu, nồng độ của những thành phần tham gia phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản
úng vì chúng có ảnh hưởng lớn lên kết quả phản ứng PCR.
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA sẽ nối

dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc
tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp mồi chuyên biệt bắt cặp
bổsung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm
giữa hai mồi đó. Vì thế, ta có thể sử dụng cặp mồi riêng biệt để khuếch đại vùng đặc
trưng của một loài, từ đó có thể định danh được tên loài.
Phản ứng PCR gồm 3 bước:
(1) Biến tính phân tử DNA
(2) Bắt cặp mồi với mạch khuôn
(3) Tổng hợp mạch mới.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR:
+ DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng
nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt đối với DNA thu nhận trực tiếp
từ dịch chiết tế bào
+ Enzyme: Enzyme phải không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự
tổng hợp từ đấu đến cuối quá trình phản ứng, enzyme thường được sử dụng là Taq
polymerase.
+ Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại
đặc trưng và có kết quả cao. Trình tự mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp
15