Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP
GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP
VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Sơn đã tận tình chỉ
bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận
văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học đã
trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình
giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và
biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Công nghệ
DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin cám ơn Phòng
thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã cung cấp kinh phí, thiết bị cũng như cho
phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu thuộc đề tài NV07-PTNTDD2015.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo thuộc
Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
bp

Tên tiếng Anh
Base Pairs

CS

Tên tiếng Việt
Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleoside Triphosphate

E.coli

Escherichia coli

EtBr

Ethidium Bromide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GP5

Glycoprotein 5

IPTG

Isopropylthio-β-Galactoside

kb

Kilobase

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

MES

2-(N-morpholino)Etansulfonic acid

OD

Optical Density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Porcine Reproductive and

Hội chứng rối loại hô hấp

Respiratory Syndrome

và sinh sản ở lợn

Porcine Reproductive and

Virus gây hội chứng rối loại

Respiratory Syndrome virus

hô hấp và sinh sản ở lợn

PRRS

PRRSV
RNA

Ribonucleic Acid

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TBS

Tris-Buffered Saline

TTBS

Tween Tris-Buffered Saline

v/p

Môi trường dinh dưỡng cơ
bản nuôi cấy vi khuẩn

Vòng/ phút

X-gal

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-BetaD-Galacto-Pyranoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................i LỜI CẢM
ƠN ..................................................................................................ii DANH MỤC CÁC TỪ
VIẾT

TẮT

...............................................................

iii

MỤC

LỤC

......................................................................................................iv

DANH

MỤC

HÌNH........................................................................................vi

MỞ

ĐẦU

......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu: .................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................. 3
1.1. Tổng quan về PRRS ................................................................................. 3
1.1.1. Khái niệm PRRS................................................................................. 3
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ..................................... 3
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV).............. 8
1.2. Protein tái tổ hợp .................................................................................... 11
1.2.1. Giới thiệu .......................................................................................... 11
1.2.2. Glycoprotein (GP5) .......................................................................... 12
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 ...................................... 13
1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ................. 14
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 16

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


v

2.1. Vật liệu.................................................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất và môi trường .................................................................... 18

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 19
2.2.1. Tạo dòng gen gp5 ............................................................................. 19
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 ................................................ 21
2.2.3. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ........................... 25
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 29
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 29
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5...................... 32
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41
1. Kết luận...................................................................................................... 41
2. Đề nghị....................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT .......................................................... 16
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 17
Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 ...... 30
Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 31
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 32
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 34
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái

tổ hợp ………. ........................................................................................ 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha
loãng 1:1000 lần) ........................................................................................... 36
Hình 3.7. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ...................... 38
Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA..... 39

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm .................................................................. 19
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 20
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 22
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 22
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 24
Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 26

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn tai xanh” (Blue Ear), được
xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên lợn từng được ghi nhận trên thế

giới và được ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc Mỹ năm 1987, do lợn mắc bệnh thường bị
xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trưng của bệnh, với lợn cái,
PRRS gây hậu quả nghiêm trọng như sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết
non, tình trạng bệnh âm ỉ gây rối loạn sinh sản như động dục kéo dài, chậm động dục
trở lại. Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lượng tinh dịch, chất lượng tinh dịch
kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con [9]. “Lợn tai xanh” là bệnh
truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ
Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh [1].
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nước trên thế giới, gây tổn
thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Hoa Kỳ vào năm
1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 và tại châu Á vào đầu những
năm 1990 [36]. Tại Việt Nam, PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm
1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên
tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng
trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn
virus lây nhiễm [7].
Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi. Hệ gen
của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dương, có cấu trúc tương tự cấu trúc của
Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7 protein của virus
gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5)
được mã hoá bởi ORF5, là một protein được

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên
mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.
Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào cơ chế
“lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tượng
trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền

miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (CMI-cell
mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện tượng “chết theo chương
trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là
một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của
PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng
bệnh của các vaccine phòng bệnh đang lưu hành.
Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực sự cần
thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp thế hệ mới
nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra.
Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa học
trong và ngoài nước chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện
và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối
loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5. Biểu hiện và tinh
sạch được protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome virus.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa trên thông tin về trình
tự nucleotide của gen gp5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để phân lập kiểm
tra và nhân gen bằng PCR.


- Nghiên cưu thi ết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa
cho protein GP5.
- Biểu hiện GP5 trong E. coli BL21 và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 )
bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về PRRS
1.1.1. Khái niệm PRRS

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndome, PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu hiện đặc
trưng là các rối loạn sinh sản ở lợn cái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sinh ra chết yểu,
cũng như lợn con theo mẹ và lợn cái hậu bị còn thể hiện viêm đường hô hấp rất nặng
như: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao [6], [20]…
Bệnh còn được gọi bằng một số tên khác như:
Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome). Hội chứng vô sinh và hô hấp ở
lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde). Hội chứng hô hấp và
sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome). Hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome). Bệnh lợn tai xanh (Blue- ear Disease).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota
(Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và được
tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh được gây ra bởi virus PRRS, tồn tại dưới
dạng hạt virion gây nhiễm.
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
* Cơ chế gây bệnh và các phương pháp lan truyền


Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm
hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm
virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn cái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm
sang bào thai và gây bệnh.
Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đường hô hấp, tiêu hóa
và đường âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus là các đại
thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt của
virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong loại tế bào này
và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi
bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc
đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thực bào nhưng sau 2-3 ngày,

virus này sẽ giết chết chúng, các virion được giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế
bào khác, tiếp tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm
do mắc PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống
miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên
thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn dịch
không xảy ra được, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng
mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo
chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế
phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô

hấp

như

Mycoplasma

hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A. pleuropneumoniae... Tiêu Quang An và
Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn
trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn
mắc PRRS thường kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đường hô hấp và đường
ruột như A.


pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium
perfringens. Kết quả phân lập được vi khuẩn A. pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất
63.33% và thấp nhất là P. multocida
10%[2]. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho
dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn.
* Các biện pháp phòng bệnh

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng
bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện
pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động phòng chống dịch, cần thực
hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch như: Phát hiện sớm, bao
vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành,
các cấp và người dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính
quyền các cấp từ Trung ương tới các địa phương. Trường hợp có tỷ lệ lợn trong đàn
kiểm tra huyết thanh dương tính cao thì tiêu hủy là phương pháp hiệu quả. Tuy nhiên,
phương pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần. Điều
này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà
chưa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách. Các biện pháp quản lý
không được kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn
sẽ tồn tại [35].
* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
+ Trên thế giới
Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục
trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai
xanh lưu hành.
Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước
trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế
cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Như hàng năm Mỹ phải
chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD. Các nước trong khu vực
có tỷ lệ bệnh Tai xanh lưu hành rất cao. Ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là
97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5].
Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của

Trung Quốc đã được phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của
Trung Quốc đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn" do nhiều
nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng
triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc
đã khẳng định chủng virusPRRS gây bệnh tại nước này là chủng độc lực cao, đặc biệt
có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh
Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh
hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan.
Trước diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung Quốc đang
thực hiện chương trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chương trình nghiên cứu,
sản xuất vaccine đã được cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tương đương với
36,5 triệu USD [25].
Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ
cùng lưu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã xác định nhiễm cả
hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng được thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000
- 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh Tai xanh được phân lập từ nhiều địa
phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong
đó, số virus thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng
dòng Bắc Mỹ chiếm

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


33,58%. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lưu hành virus gây bệnh Tai
xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển độc lực thấp [13].
Tháng 9/2007, Nga là nước thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh
Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16].
+ Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập
từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dương tính với PRRS

và cả đàn được tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc
thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có
kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và
5/15 trại (chiếm 33%) có lưu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm
2003, tỷ lệ huyết thanh dương tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung
ở Cần Thơ là 66,86%. Như vậy, PRRS đã được phát hiện ở Việt Nam từ năm
1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa phát hiện
các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc
có liên quan đến tình hình dịch ở các nước láng giềng. Theo thông báo của các tổ
chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu
vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa
phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải
tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chưa có những
nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của virus, nhưng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần
thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dương
có dịch thì sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hưng Yên, Quảng Ninh,
Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn
chết và xử lý 7.296 con [15].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các
chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tương đồng về amino acid từ 99% đến 99,7% so
với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin.
Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nước ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực
cao giống chủng ở Trung Quốc [16].
Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nước từ năm 2009 đến nay đã nhận
định PRRSV tại Việt Nam hiện nay được xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung

Quốc [3], [8], [10], [14].
 Đặc tính sinh học của virus
Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào
hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ
và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của
lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc PRRS thường dễ bị nhiễm
khuẩn thứ phát. Virus không gây ngưng kết với các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột,
hồng cầu type O của người. Virus phát triển tốt trên môi trường tế bào đại thực bào
phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế
bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng
bong ra [17]. Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhưng các chủng virus
Bắc Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô
hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thương
đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, người ta chia ra hai nhóm virus là
nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp. Nhóm virus có độc lực cao
thường gây ra các tổn thương ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực
thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của
PRRSV tại Trung Quốc cho

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ
lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34].
 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus
+ Sức đề kháng của virus.
Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70

o

C;

o
trong điều kiện 4 C virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở
o
o
37 C chịu được 48 giờ, 56 C bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -7. Với
các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu
diệt. Dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng
[10], [12].
+ Khả năng gây bệnh của virus
Người và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ
cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân lên ở loài
động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó
khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhưng lợn con và lợn cái
mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật mang trùng và có thể coi là
nguồn dịch thiên nhiên [12]. Về độc lực, các nghiên cứu cho thấy virus gây PRRS tồn
tại dưới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng biến thể độc lực cao. Dạng cổ điển có độc
lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng
đàn. Dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và
chết nhiều [34].
+ Cấu trúc và chức năng của virus
Cấu trúc:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS
Dưới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích
thước từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thước từ 25 - 35 nm, trên bề

mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17]. Virus gây PRRS là ARN virus với bộ gen là
một phân tử ARN sợi đơn dương, có những đặc điểm chung của nhóm Arterivirus.
Sợi ARN này có kích thước khoảng 15 kilobase, có chín ORF (open reading
frame) mã hoá cho chín protein cấu trúc. Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính
có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử
protein xuyên màng (M) và một protein nucleocapsid (N) [12]. Qua các nghiên cứu
cho thấy sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9
ORFs [7]. Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen ORF1a và ORF1b là polymerase và bẩy
gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75%
bộ gen của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch
thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phát sinh các protein không cấu
trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Polymerase. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein
glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng. Các ORF2b mới
được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định
GP2b. ORF7 mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N) [24].
- Chức năng:
ORF1a và ORF1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gen
và mã hóa cho RNA Polymerase của virus được xem là protein chịu trách nhiệm trong
quá trình nhân lên của virus.
ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF1b, ở đầu 3’ của genome,
mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion.
Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus. Cho đến
nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của PRRS đó là: Protein nhân
(N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa định

bởi ORF7, protein

màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định bởi ORF6 và protein
vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng
lượng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus có lẽ mã
hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là:
29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33].
1.2. Protein tái tổ hợp
1.2.1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán bệnh lý
cũng như sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thường khó nuôi trên môi
trường tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thực bào túi phổi heo
(PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


người ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy
nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả các chủng virus
PRRS. Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV là hướng đi
đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5
mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm như dùng làm vật liệu trong các kit
chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra
khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất
là khi dịch bệnh bùng phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục
được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trường tế bào như đã nêu ở
trên.
1.2.2. Glycoprotein (GP5)
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thước khoảng

25 kDa. GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV khi nó
nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phong phú và đa dạng
nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trung hòa trong cơ thể. Nó
bao gồm ba vị trí glycosylation được cho là N-linked N34, N44, N51 nơi mà vị trí trung
hòa virus được đặt tại đó [21]. Plagemann và cs (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để
chỉ ra rằng các vị trí trung hòa virus chính của PRRSV được đặt tại vị trí giữa của GP5
từ acid amin 36 đến 52. GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại
PRRSV. Vì vậy GP5 rất được quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và
tiến hóa phân tử cũng như biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này. Điển hình là
các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùng nội bào virus,
các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R
 Q), 151 (R  G). Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay đổi yếu tố
ảnh hưởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5 được xem là chỉ thị cho độc lực
của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


R151 thành G151. Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định là trình tự
sẽ bị loại bỏ sau dịch mã. Đột biến này có thể ảnh hưởng đến sự vận chuyển GP5 đến
màng của mạng lưới nội chất. Sự thay đổi G151 nằm trên phần ưa nước

của

glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biến liên quan đến sự suy yếu
của PRRSV.
Protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết, xâm lấn, phản ứng
miễn dịch của bệnh lợn tai xanh. Đây là một đối tượng được dùng để nghiên cứu và
đã được một số công trình phân lập, thiết kế biểu hiện thành công trên E.coli [27],
[32].

1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5
Protein tái tổ hợp được sản xuất bằng cách chèn gen ORF5 mã hóa cho
protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+). Kết quả tạo ra plasmid tái tổ hợp là
pET 32a(+)/GP5, có thể biểu hiện được protein có kích thước
25kDa trong tế bào E.coli chủng BL21. Protein này có kích thước tương tự
với kích thước protein GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữ
được cấu trúc kháng nguyên của Protein GP5 tự nhiên. Hiện nay người ta tập trung
hướng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus PRRS trong
sản xuất vaccine vì protein GP5 được quy định bởi ORF này có chứa những epitope
trung hòa chính quan trọng của PRRSV [25].
Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên của
PRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắn với các
protein khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus cùng lúc. Chuột
tiêm GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective adenovirus có hàm lượng
kháng thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột chỉ tiệm vector biểu hiện GP5 hoặc
M riêng rẽ [35].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21
- Vector biểu hiện pET 32a(+)
Hệ thống vector hiểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ
hợp ở dạng dung hợp với một homo oligohistidine (6xHis) trong tế bào E. coli. Sự biểu
hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt tính của T7
RNA Polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7. Vector biểu hiện này
chứa đoạn DNA mã hóa oligohistidine gọi là His-tag, đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc
10 acid amin. Vector biểu hiện pET
32a(+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của một plasmid
như: sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào. Ngoài ra, hệ vector

pET 32a(+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, vượt trội hơn so với các hệ biểu hiện
khác.
Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7 – đây là promoter mạnh và
có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn chiếm 10 – 30 %
tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng nên có thể điều khiển dễ
dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai. Không giống như các promoter khác có nguồn
gốc từ tế bào E. coli, T7 RNA Polymerase là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc
độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các RNA Polymerase có nguồn gốc từ E. coli.
Trên vector đã thiết kế một đoạn gen Trx mã hóa protein Thioredoxin.
Thioredoxin được phân lập đầu tiên từ E. coli và tìm thấy ở nấm, virus, vi khuẩn, thực
vật…Trong hệ biểu hiện E. coli, Thioredoxin chiếm khoảng
40% tổng protein của tế bào, là một protein oxi hóa khử có khối lượng phân tử
19,5kDa, được biết đến trong tất cả các sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong
nhiều quá trình sinh học bao gồm cả tín hiệu oxi hóa khử.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại lai khi dung
hợp. Ngoài ra vị trí cắt của enterokinase được thiết kế trước vùng đa điểm cắt tách
protein tái tổ hợp ra khỏi Thioredoxin.
Tất cả các ưu điểm trên cho thấy pET 32a(+) không chỉ thiết kế riêng cho việc
biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong quá trình thu
nhận protein tái tổ hợp.
- Chủng biểu hiện E.coli BL21 [31]
Hệ gen của chủng E. coli BL21 đã được cải biến một số gen là opmT, hsdS, gal,
dcm, λ DE3:
Gen ompT: là một gen mã hóa cho protease nằm trên màng ngoài tế bào,
chủng khuyết gen ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy ngay trong
tế bào.

Gen hsdS: là một gen có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập tế
bào chủ, chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ hợp được hiệu
quả hơn.
Gen gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gen gal giúp tránh việc tế bào sử
dụng galactose làm nguồn cacbon cho sinh trưởng.
Gen dcm: là gen methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết gen
dcm tránh việc trình tự gen ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác trong việc biểu
hiện protein tái tổ hợp.
T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter lacUV dùng
để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là promoter đã được đột biến, và được tạo ra từ
phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên
nào.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Gen mã hóa cho glycoprotein (GP5) của vius Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome (PRRSV) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công
nghệ sinh học cung cấp.
Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Vector biểu hiện pET 32a(+) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+)

Tế bào khả biến E.coli chủng DH5 (α) và chủng BL21 (DE3) do Viện
công nghệ sinh học cung cấp.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN