PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN

 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ
ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

PHAN VĂN TUẤN

Niên khóa:

2011 – 2013

Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN ĐẤT TRỒNG LÚA BỊ NHIỄM MẶN

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

PHAN VĂN TUẤN

Tháng 12/2013


 

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin chân thành cảm ơn Ba Mẹ, người đã nuôi dạy con suốt 12
năm để bước vào giảng đường đại học và ngày hôm nay con chuẩn bị bước vào đời.
Chân thành cảm ơn ThS. Trương Phước Thiên Hoàng, cô đã tận tình hướng dẫn
cho em trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã
tạo điều kiện cho em được học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học và các thầy cô
đã trực tiếp giảng dạy em trong hơn 3 năm qua.
Chân thành cảm ơn TS.Lê Đình Đôn, thầy là người đã hướng dẫn cả Bộ môn
Công nghệ sinh học và tạo điều kiện cho chúng em được học tập và nghiên cứu.
Chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học và các thầy cô
đã trực tiếp giảng dạy em trong hơn 3 năm qua.
Mình chân thành cảm ơn các bạn sinh viên cùng làm đề tài tốt nghiệp và sinh viên

tại phòng Kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm, Viện công nghệ sinh học và môi trường,
trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Chân thành cảm ơn tập thể lớp LT11SH, chúng ta đã cùng nhau chia sẻ những khó
khăn khi bước vào giảng đường đại học và trong suốt thời gian học tập tại trường.
Sinh viên thực hiện
Phan Văn Tuấn

vii 


 

TÓM TẮT
Trong tự nhiên nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2), và cây trồng
không thể hấp thụ được ở dạng nitơ này. Vi sinh vật cố định nitơ là một nhóm bao
gồm rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau, có khả năng tương tác với thực vật theo
hướng có lợi và được xem như là những vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật.
Dưới tác động của nitrogenase, vi sinh vật có thể cố định đạm tự do từ khí quyển, làm
giàu nguồn đạm trong đất và cho cây trồng sử dụng. Trên cơ sở đóđề tài“Phân lập
tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn cố định đạm trên đất trồng lúa bị
nhiễm mặn” được thực hiện.
Từ các mẫu đất trồng lúa bị nhiễm mặn từ 3 tỉnh Tiền Giang, Kiên Giang, và
Bến Tre tiến hành phân lập được 30 chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm. Chủng
TG4, BT4, và KG5 có khả năng có định nitrogen cao nhất. Để nghiên cứu sự ảnh
hưởng của môi trường tới sự sinh trưởng và cố định nitrogen của các chủng vi sinh vật
phân lập, các chủng vi sinh vật được tiến hành nuôi cấy trên ba môi trường Ashby,
Fedorov, Jensen để tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát triển và khả năng cố định
đạm.
Kết quả cho thấy rằng, môi trường Fedorov là môi trường thích hợp cho sự sinh
trưởng và cố định nitrogen của chủng vi sinh vật phân lập. Chủng TG4 và BT4 cho

mật độ vi khuẩn lần lượt là 25,93 x 108CFU/ml, 25,80 x 108 CFU/ml và cho hàm
lượngnitơ tổng lần lượt là 26,7 mg/l, 44,5 mg/l. Chủng KG5 cho mật độ vi khuẩn là
24,77 x 108 CFU/ml, cho hàm lượngnitơ tổng là 29,03 mg/l. Sử dụng phương pháp
hóa sinh, quan sát hình thái, và phân tích 16S RNA định danh được các chủng TG4,
BT4, and KG5 có tên khoa học như sau: TG4 là Azotobacter vinelandii, BT4 là
Azotobacter vinelandii, KG5 có tên khoa học là Stenotrophomonas maltophilia.
Từ khóa: Azotobacter vinelandii, Stenotrophomonas maltophilia, vi sinh vật cố
định đạm.

viii 


 

SUMMARY
According to estimates, the Earth's atmosphere contains 78% of the nitrogen.
Nitrogen is animportance basic component of all living organisms in the world. It are
considered presently instructure of organic compounds, such as nucleic acids, proteins,
ATP. However,nitrogen is often presented in the form of molecular nitrogen (N2)
which plants can not absorb. Nitrogen fixing microorganisms (NFM) includes many
various species. These microorganisms areable to interact with plants in the beneficial
pathways, and thereby it stimulates the growth of plants. Under the impact of the
nitrogenase, microorganisms is able to fix free nitrogen source from the atmosphere,
then enriched nitrogen source in soils, and plants can use easily. Besides, there are a
larger number of nitrogen fixing microorganismsare also able to solubility of insoluble
phosphate source, to producethe growth stimulants in plant as indole 3-acetic acid,
giberrellins, and cytokinin. So, we conduct the subject: "Isolation, selection, and
identification nitrogenfixing bacteria on soil salinity in the paddy fields".
Thirty strains of nitrogen-fixing bacteria were isolated and selected from 30 of
soil salinity samplescollected from Tien Giang, Kien Giang, and Ben Tre province.

TG4, BT4, and KG5 strains were capable of nitrogen fixation highest in among the
isolated strains. To study the effect of medium to the growth and nitrogen fixation of
the isolates, we cultured bacterial strains on Ashby, Fedorov, and Jensen medium.
The result shown that, Fedorov medium is the best medium for the growth and
nitrogen fixation. TG4 and BT4 strainshad the total number of bacteria were
25.93×108 CFU/ml, and 25.80×108CFU/ml, respectively. The total content of nitrogen
of TG4 and BT4 strainswere 26.7 mg/l, and 44.5 mg/l, respectively. KG5 strain had
24.77x108CFU/ml, and 29.03 mg/l of the total content of nitrogen.Using
morphological, biochemistry, and 16S RNA analysis methods, TG4, BT4, and KG5
strain

were

identified

Azotobacter

vinelandii,

Azotobacter

vinelandii,

and

Stenotrophomonas maltophilia, respectively.
Key words: Azotobacter vinelandii, Stenotrophomonas maltophilia,nitrogenfixing bacteria
ix 

 

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................vii
TÓM TẮT.................................................................................................................... viii
SUMMARY.................................................................................................................... ix
MỤC LỤC ....................................................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ xiii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .........................................................................................xiv
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ xv
Chương 1MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2 Yêu cầu của đề tài ..................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................2
Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3
2.1 Tổng quan về nitơ ..................................................................................................3
2.1.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên ......................................................................................3
2.1.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên ..................................................................................4
2.1.3 Vai trò của nitơ đối với thực vật .............................................................................5
2.2 Tổng quan về vi sinh vật cố định nitơ ....................................................................6
2.2.1 Quá trình cố định nitơ sinh học ..............................................................................6
2.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ (NFB – Nitrogen fixing bacteria) .......................................6
2.2.2.1 Vi khuẩn sống cộng sinh .....................................................................................8
2.2.2.2 Vi khuẩn sống tự do ............................................................................................9
2.3 Quá trình cố định đạm của vi khuẩn ....................................................................17
2.3.1 Cấu trúc của enzyme nitrogenase .........................................................................18
2.3.2 Cơ chế hoạt động của nitrogenase ........................................................................18
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme nitrogenase ............................20
2.4 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ .........................................................................21

2.4.1 Khả năng hòa tan phosphate .................................................................................21
2.4.2 Sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật .........................................22
x 


 

2.4.3 Các ứng dụng khác ...............................................................................................25
2.5. Một số nghiên cứu trong và ngoài nướcvề vi khuẩn cố định đạm ......................25
2.5.1. Một số nghiên cứu trong nước.............................................................................25
2.5.2. Một số nghiên cứu trên thế giới...........................................................................27
Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 29
3.1. Thời gian và địa điểm..........................................................................................29
3.2. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm .................................................................29
3.2.1. Vật liệu ................................................................................................................29
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................30
3.2.3. Hóa chất ...............................................................................................................30
3.2.3.1. Thành phần một số môi trường ........................................................................32
3.3. Phương pháp thực hiện thí nghiệm nghiên cứu ..................................................33
3.3.1. Thí nghiệm 1: phân lập và quan sát hình thái vi khuẩn cố định đạm ..................33
3.3.1.1. Lấy mẫu ............................................................................................................34
3.3.1.2. Phân lập chọn lọc và làm thuần ........................................................................34
3.3.1.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào .......................................35
3.3.2. Thí nghiệm 2: Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ................35
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được ..........37
3.3.4. Thí nghiệm 4: ......................................................................................................38
3.3.4.1. Định danh loài ..................................................................................................38
3.3.4.2. Khảo sát môi trường tối ưu của ba chủng vi khuẩn cố định đạm cao nhất ......38
CHƯƠNG 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 39
4.1 Kết quả phân lập và làm thuần .............................................................................39

4.1.1 Mật độ vi khuẩn và giá trị pH mẫu .......................................................................39
4.1.2 Đặc điểm, hình dạng khuẩn lạc ............................................................................42
4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được.......................45
4.3 Kết quả định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ...............................47
4.4 Kết quả định danh loài của 3 chủng có khả năng cố định đạm cao nhất và khảo
sát môi trường tối ưu nhất của chúng .........................................................................48
4.4.1 Kết quả định danh loài của 3 chủng có khả năng cố định đạm cao nhất..............48
4.4.2 Khảo sát môi trường tối cho 3 chủng có khả năng cố định đạm cao nhất ...........49
xi 


 

Chương 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 51
5.1 Kết luận ................................................................................................................51
5.2 Đề nghị .................................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 53
PHỤ LỤC

xii 


 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU: Colony Forming Unit
OXI: Oxidase
GLU: Glucose
NIT: Nitrate

ONPG: Thủy giải ONPG
URE: Urease
PAD: Phenyl Alanine Deaminase
CIT: Citrate
ESC: Esculin
H2S: Hydrosulfite
IND: Indol
VP: Voges- Proskauer
MLO: Malonate
LDC: Lysin decarboxylase
MOB: Motility

xiii 


 

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu trong tự nhiên. .............................7
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu, địa chỉ thu thập mẫu .................................................................29
Bảng 3.2 Các phản ứng sinh hóa trong bảng nhựa của Kit IDS 14 GNR .....................31
Bảng 3.3Thành phần môi trường Fedorov ....................................................................32
Bảng 3.4Thành phần môi trường Jensen ......................................................................32
Bảng 3.5Thành phần môi trường Ashby .......................................................................33
Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn và giá trị pH đất ở tỉnh Bến Tre .........................................39
Bảng 4.2Mật độ vi khuẩn và giá trị pH mẫu đất ở tỉnh Kiên Giang .............................40
Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn và pH đất ở tỉnh Tiền Giang ...............................................41
Bảng 4.4 Đặc điểm, hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được trên
môi trường thạch đậu. ....................................................................................................42

Bảng 4.5Kết quả phản ứng sinh hóa .............................................................................45
Bảng 4.6 Kết quả nhuộm gram, quan sát hình thái và kích thước tế bào vi khuẩn ......46
Bảng 4.7 Hàm lượng nitơ tổng số của 30 chủng vi khuẩn đã phân lập được ...............47
Bảng 4.8Mật độ tế bào (CFU/ml) của ba chủng BT4, TG4 và KG5 trên môi trường
Ashby, Fedorov, Jensen .................................................................................................49
Bảng 4.9Hàm lượng nitơ cố định được (mg/ml) của ba chủng BT4, TG4 và KG5 trên
môi trường Ashby, Fedorov, Jensen ..............................................................................50

xiv 


 

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên. ..........................................................................4
Hình 2.2 Cấu trúc enzyme nitrogenase .........................................................................17
Hình 2.3Cơ chế hoạt động của enzyme nitrogenase .....................................................19
Hình 2.4 Sơ đồ khái quát các con đường tổng hợp IAA ở vi khuẩn ............................24
Hình 3.1 Sơ đồ xác định hàm lượng đạm tổng số.........................................................36
Hình 4.1 Kết quả nhuộm gram một số chủng tiêu biểu ................................................46

xv 


 

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, nông nghiệp vẫn là một ngành kinh tế mũi nhọn và chiếm vị trí quan
trọng không thể thay thế được ở nước ta.Phân bón, các chất bảo vệ thực vật, chất kích
thích tăng trưởng thực vật được tổng hợp hóa học làm tăng đáng kể năng suất cây
trồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng quá mức và sử dụng không hợp lý đã làm cho đất đai
ngày càng bạc màu, giảm độ phì nhiêu, tình trạng ô nhiễm môi trường tăng cao. Dư
lượng các chất hóa học tích lũy trong sản phẩm cũng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sức khỏe con người. Những năm gần đây, diện tích trồng lúa bị nhiễm mặn xảy ra trên
diện rộng và đã gây thiệt hại lớn cho nền nông nghiệp. Do đó, hướng nghiên cứu và
ứng dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã và đang được nhiều nước
quan tâm, trong đó có Việt Nam. Với những ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học
(không gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, góp phần cải tạo đất, cân bằng hệ sinh
thái, tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm), việc sản xuất các loại phân bón vi
sinh vật có tính ổn định, chất lượng tốt để phục vụ cho nông nghiệp là rất cần thiết,
trong đó, công tác nghiên cứu, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi sinh vật là bước đầu
và là tiền đề quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm.
Vi sinh vật cố định nitơ (NFB – Nitrogen fixing bacteria) là một nhóm bao gồm
rất nhiều loài có khả năng tương tác với thực vật theo hướng có lợi và được xem như
là những vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR - Plant growth-promoting
rhizobacteria – vi sinh vật vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật). Dưới tác động của
enzyme nitrogenase, vi sinh vật có thể cố định đạm tự do từ khí quyển, làm giàu nguồn
đạm trong đất và cho cây trồng sử dụng. Bên cạnh đó, một số chủng NFB còn có khả
năng hòa tan các nguồn phosphat khó tan, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật
như indole 3-acetic acid, giberrellins, cytokinin. Một số nghiên cứu đã chứng minh
khả năng kháng tác nhân gây bệnh trên thực vật khi có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn
này. Chính vì thế việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật cố định đạm trên

1 


 

vùng đất trồng bị nhiễm mặn để bổ sung vào chế phẩm vi sinh là rất cần thiết để mang
lại hiệu quả trong sản suất nông nghiệp. Trên cơ sở đó đề tài:“Phân lập tuyển chọn và
định danh một số chủng vi khuẩn cố định đạm trên đất trồng lúa bị nhiễm mặn” được
tiến hành.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Chọn lọc, tuyển chọn và định danh một số chủng vi sinh vật cố định đạmmạnh
nhất ở những vùng đất trồng lúa bị nhiễm mặn nhằm phục vụ sản xuất ra những chế
phẩm sinh học hoặc sản xuất phân vi sinh để phục vụ sản suất nông nghiệp và nâng
cao năng suất cây trồng.
1.3. Nội dung thực hiện
Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm.
Khảo sát khả năng cố định nitơ trên môi trường chọn lọc để chọn ra những chủng
có khả năng cố định đạm mạnh nhất.
Phân nhóm và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm mạnh nhất
dựa vào đặc điểm hình thái, nhuộm Gram và sinh hóa.
Định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng cố đinh nitơ mạnh nhất.

2 


 

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về nitơ
2.1.1 Nguồn nitơ trong tự nhiên
Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng và cần thiết cho mọi cơ thể sống.Dự trữ
nitơ trong tự nhiên rất lớn, chiếm khoảng 79% thể tích không khí.Ước tính có khoảng
386.1016 kg nitơ trong bầu khí quyển của Trái Đất, 80.000 tấn nitơ/ha đất.Lượng nitơ

này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm nếu như cây trồng có khả
năng đồng hóa nó(Dworkin và cộng sự, 2006).
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2), được cấu tạo bởi
liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N).Ở nhiệt độ và áp suất thông thường, phân tử nitơ
rất bền, có tính trơ và cần một lượng năng lượng rất lớn để bẻ gãy mối liên kết ba này.
Trong thực tế, để tận dụng hiệu quả nguồn nitơ lớn từ không khí, có hai biện
pháp được sử dụng phổ biến đó là cố định nitơ bằng con đường hóa học và con đường
sinh học (Hartmann và cộng sự,2006).
Con đường cố định đạm bằng phương pháp hóa họcđược thực hiện theoquy
trình Haber-Bosch, đòi hỏi nhiệt độ rất cao (450 – 500oC), áp suất lớn gấp 400 lần áp
suất khí quyển cùng với sự xúc tác của hợp chất sắt để tạo khí N2 thành NH3). Bằng
con đường hóa học, nhiều loại phân bón chứa nitơ khác nhau được tổng hợp như amon
sulfat, amon nitrat, amon carbonate, amon photphat. Nguồn phân đạm này cung cấp
một lượng lớn nitơ ổn định, góp phần tăng năng suất cây trồng. Tuy nhiên, cây trồng
chỉ hấp thu trung bình từ 40-60% lượng đạm, phần phân bón còn lại nằm trong đất gây
ra những tác hại đáng kể như ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người,
đất trồng bị bạc màu, mất cân bằng hệ sinh thái (www.newworldencyclopedia.org).
Lượng đạm được cố định theo con đường sinh học ước tính khoảng 175 triệu
tấn mỗi năm chủ yếu nhờ các vi sinh vật, tự dưỡng hoặc dị dưỡng. Quá trình cố định
đạm bằng con đường sinh học có thể thực hiện bởi vi khuẩn cộng sinh ở vùng rễ của
thực vật có mạch, Cyanobacteria cộng sinh với nấm hoặc thực vật, vi khuẩn dị dưỡng

3 


 

hoặc tự dưỡng sống tự do trong đất. Nhờ vào hoạt tính của enzyme nitrogenase mà các
vi sinh vật này có thể thực hiện quá trình cố định nitơ (Dworkin và cộng sự,2006).
Ưu điểm của phân bón chứa các vi sinh vật trên là vẫn đảm bảo tăng năng suất

cây trồng, góp phần hạn chế sử dụng phân bón hóa học, giúp cho sản phẩm sạch và an
toàn hơn. Đồng thời cũng tạo điều kiện cho hệ vi sinh vật trong đất hoạt động mạnh
nhằm cải tạo đất.
2.1.2 Chu trình nitơ trong tự nhiên
Chu trình nitơ là quá trình biến đổi của nitơ trong sinh quyển, trong đó nitơ xuất
hiện dưới nhiều dạng tự do hay kết hợp (nitơ phân tử, các hợp chất nitrit, nitrat, amoni,
acid amin). Chu trình nitơ xảy ra tương đối nhanh và liên tục nhưng phức tạp hơn so
với các chu trình khí khác.

Hình 2.1Chu trình nitơ trong tự nhiên (Iwata và cộng sự, 2012).
Chu trình nitơ bao gồm 3 quá trình:
- Quá trình cố định nitơ: chuyển đổi nitơ phân tử (N2) từ khí quyển thành
những hợp chất chứa nitơ mà cây trồng sử dụng được theo con đường hóa học hoặc
sinh học nhờ các vi sinh vật có khả năng cố định đạm.
- Quá trình nitrit và nitrat hóa: biến đổi nitơ ở dạng amonia NH3, NH4+ thành
NO2-, NO3- với sự tham gia của vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Nitrosomonas và
Nitrobacter.
4 


 

- Quá trình phản nitrat hóa: tách nitơ ra khỏi nitrat và nitrit dưới tác dụng của
các vi khuẩn kị khí. Nitơ được tách ra thông qua các cơ chế đồng hóa, dị hóa để trở về
dạng khí như N2, NO, N2O và bay trở lại bầu khí quyển (Iwata và cộng sự, 2012).
2.1.3 Vai trò của nitơ đối với thực vật
Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động khoảng từ
1-3%.Tuy chỉ chiếm hàm lượng thấp nhưng nitơ lại có vai trò đặc biệt quan trọng đến
sự sinhtrưởng, phát triển của cây trồng. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ
như acid nucleic, protein, ATP là những hợp chất cao phân tử có chức năng lưu giữ

thông tin di truyền, tham gia xây dựng cấu trúc trong thành phần của tế bào, thực hiện
các hoạt động trao đổi năng lượng. Bên cạnh đó, nitơ còn là thành phần quan trọng của
chlorophyll, có liên quan đến hoạt động quang hợp ở thực vật. Nitơ có mặt trong các
thụ quan phytochrome, điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển có liên quan đến
ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nẩy mầm, tính hướng quang.
Thiếu nitơ cây sinh trưởng kém, lá vàng do chlorophyll không được tổng hợp
đầy đủ, hoạt động quang hợp giảm, dẫn đến năng suất cây trồng giảm.
Thừa nitơ sẽ làm cho các cây sinh trưởng quá mạnh, thân, lá tăng nhanh nhưng
mô cơ hình thành kém nên cây rất yếu, dễ đổ. Ngoài ra lượng đạm thừa làm cho vỏ tế
bào cây trở nên mỏng, tạo điều kiện dễ dàng cho một số vi sinh vật gây bệnh xâm
nhập, gây hại và ảnh hưởng đến năng suất của cây (Bùi Trang Việt ,2000).
Mặc dù rất cần nguyên tố này nhưng thực vật chỉ hấp thu nitơ ở dạng NO3- và
NH4+. Các dạng hợp chất này có thể được cung cấp thông qua phân bón hoặc qua các
quá trình khoáng hóa của vi sinh vật đất.

5 


 

2.2 Tổng quan về vi sinh vật cố định nitơ
2.2.1 Quá trình cố định nitơ sinh học
Bản chất của quá trình cố định nitơ sinh học được hai nhà bác học Hellriegel và
Uynfac tìm ra vào năm 1886. Quá trình này được thực hiện nhờ các vi sinh vật cố định
đạm sống cộng sinh với thực vật (chủ yếu ở vùng rễ) hoặc sống tự do trong đất. Chúng
sẽ biến đổi phân tử N2 trong không khí thành NH3 theo phản ứng N2 + 3H2  2NH3,
trong điều kiện kị khí (do enzyme nitrogenase rất nhạy cảm với oxy), lực khử mạnh và
cần năng lượng (Dighe và cộng sự, 2010).
Trong tự nhiên, sự cố định đạm xảy ra bằng con đường sinh học có ý nghĩa hơn
vì có thể cung cấp một khối lượng lớn đạm dễ tiêu cho cây trồng và môi trường đất.

Bằng con đường hóa học, lượng nitơ được cố định trung bình hằng năm chỉ khoảng
7,6 triệu tấn (4-10kg/ha/năm), trong khi đó, bằng con đường sinh học có thể cung cấp
đến khoảng 54 triệu tấn nitơ trong một năm (300-400 kg N/ha/năm)(Hartmann và cộng
sự, 2006).
2.2.2 Vi khuẩn cố định nitơ (NFB – Nitrogen fixing bacteria)
Vi khuẩn cố định nitơ, còn được biết đến với tên gọi là diazotrophs, có khả
năng khử phân tử nitơ tự do trong không khí và trong đất mà cây trồng không hấp thu
được tạo thành đạm amon NH4+ dưới tác dụng của enzyme nitrogenase.
Hellrigel và Uynfac đã tìm ra bản chất của quá trình này bằng cách chứng minh
khả năng hấp thu nitơ khí quyển của thực vật thuộc cây họ Đậu (Fabaceae) là nhờ vi
khuẩn nốt sần sống ở vùng rễ và đặt tên cho loài này là Bacillus radicola. Năm 1889,
Pramovskii đổi tên thành Bacterium radicicola. Cuối năm 1889, Frank đề nghị đổi tên
thành vi khuẩn Rhizobium. Kể từ đó các nghiên cứu về vi sinh vật cố định đạm ngày
càng phổ biến và đã phát hiện thêm nhiều nhóm vi sinh vật hoạt động vùng rễ khác
cũng có khả năng cố định nitơ. Quá trình cố định đạm sinh học bởi vi sinh vật mỗi
năm đạt khoảng 139.109 kg, trong đó 65% (89.109 kg) là nhờ vi khuẩn tạo nốt sần
cộng sinh ở cây họ Đậu (Dworkin và cộng sự, 2006).
Hầu hết các nhóm vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ hoặc gần vùng rễ của
thực vật vì đây là vị trí tiếp xúc trực tiếp với đất, tập trung nhiều chất hữu cơ, đặc biệt
là các chất do rễ tiết ra. Dịch tiết ở rễ thường có tỷ lệ carbon : nitơ cao nên có khả năng
dẫn dụ các vi khuẩn cố định đạm. Các vi sinh vật này có mối quan hệ tương tác với
6 


 

thực vậtthông qua quá trình trao đổi dinh dưỡng và có thể làm biến đổi hình thái, cấu
trúc rễ. Vi sinh vật vùng rễ nói chung, trong đó có nhóm vi khuẩn cố định đạm được
xem như là những vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR - Plant
growth-promoting rhizobacteria) (Foster, Rovira và cộng sự, 1983).

Vi khuẩn cố định nitơ được chia thành hai nhóm: vi khuẩn sống cộng sinh với
thực vật chủ và vi khuẩn sống tự do (dị dưỡng hoặc tự dưỡng). Tuy nhiên, sự phân biệt
giữa các nhóm vi khuẩn cố định đạm vẫn chưa được mô tả rõ ràng, vẫn có một số vi
khuẩn được phân loại vào nhiều nhóm khác nhau (Verma và cộng sự, 2010).
Bảng 2.1 Các nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu trong tự nhiên.
Phương thức

Cây họ Đậu
Thực vật khác

Hiếu khí, dị
dưỡng

Hiếu khí, tự
dưỡng

Vi khuẩn
Cộng sinh

Thực vật chủ

Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium.
Alnus, Myrica,
Casuarina, Ceanothus,
Comptonia.

Frankia
Tự do
Azotobacter, Klebsiella, Beijerinckia,

Azospirillum, Bacillus, Mycobacterium,
Methylotrophs, Pseudomonas, Azospirillum,
Herbaspirillum, Burkholderia,
Gluconacetobacter, Enterobacter.
Cyanobacteria (Nostoc, Anabaena, Aulosira,
Cylindrospernum, Calothrix).

Kị khí,
dị dưỡng

Clostridium spp., Desulfovibrio

Kị khí,
dị dưỡng

Clostridium spp., Desulfovibrio

Kị khí,
tự dưỡng,

Chromatium, Chlorobium,
Rhodopseoudomonas

7 

Mía, khóm, lúa mì, lúa
nước và một số thực
vật khác thuộc họ Hòa
bản…

 

2.2.2.1 Vi khuẩn sống cộng sinh
Nhóm vi khuẩn cộng sinh sống tương tác với thực vật chủ, trong đó cả hai bên
cùng có lợi. Vi khuẩn sẽ tiến hành trao đổi chất dinh dưỡng và có thể làm thay đổi cấu
trúc mô thực vật nơi chúng định cư, ví dụ như sự cộng sinh tạo nốt rễ ở thực vật. Hai
giống vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm này là
Rhizobia và Frankia.
Frankia có khả năng hình thành nốt rễ ở hơn 280 loài cây gỗ thuộc 8 họ khác
nhau, tuy nhiên mối quan hệ cộng sinh này vẫn chưa được hiểu rõ ràng (Schwintzer và
cộng sự,1990). Frankia được biết đến từ sự cộng sinh có hiệu quả với chi Alnus và
Casuarina. Nhiều loài trong giống Frankia có ảnh hưởng đến sự phát triển của thực
vật nhờ vào hoạt tính tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, siderophore,
hợp chất hydrogen cyanid và khả năng phân giải phosphate khó tan .
Rhizobia là vi khuẩn cộng sinh có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu.
Việc phân loại vi khuẩn Rhizobia đến nay vẫn chưa hoàn thiện. Ban đầu những loài vi
khuẩn này được phân loại thành giống Rhizobium(Antoun và cộng sự,1998).
Theo Jordan (1984), vi khuẩn nốt sần thuộc họ Rhizobiaceae gồm 7 loài:
Rhizobium leguminosarum, Rhizobium phaseoli, Rhizobium trifolii, Rhizobium
meliloti, Rhizobium japonicum, Rhizobium vigna, Rhizobium lupine. Năm 1996, các
nhà khoa học phân loại vi khuẩn nốt sần thành 2 nhóm với 4 giống: Sinorhizobium
feradii, Bradyrhizobium, Agrobacterium, Phyllobacterium. Chỉ có 2 giống
Sinorhizobium feradii, Bradyrhizobium có khả năng cố định nitơ phân tử trong nốt sần
rễ cây họ Đậu. Ngày nay, vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu được phân thành nhiều
giống, trong đó hầu hết các loài thuộc 4 giống Rhizobium, Sinorhizobium,
Mesorhizobium và Bradyrhizobium.
Nhiều nghiên cứu tại Ấn Độ đã cho thấy việc sử dụng vi khuẩn Rhizobia trong
nông nghiệp có thể tiết kiệm đến gần 50% lượng phân đạm và năng suất cây trồng tăng
đáng kể. Bên cạnh hoạt tính cố định nitơ, những vi khuẩn thuộc nhóm Rhizobia còncó

khả năng phân giải phosphate vô cơ và hữu cơ khó tan thành dạng dễ tan, cung cấp
nguồn dinh dưỡng cho cây trồng.

8 


 

2.2.2.2 Vi khuẩn sống tự do
Vi khuẩn cố định nitơ thuộc nhóm tự do tham gia vào quá trình trao đổi dinh
dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ. Trong mối quan hệ này, cả
cây trồng và vi khuẩn đều có lợi nhưng không bắt buộc. Chúng bao gồm những vi
khuẩn sống tự do trong vùng lân cận rễ thực vật đến những vi sinh vật nội sinh trong
mô tế bào thực vật. Một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm này như: Azoarcus,
Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillium, Azotobacter (Vessey và cộng sự
2003),

Achromobacter, Acetobacter, Arthrobacter, Azomonas, Azospirillum,

Azotobacter,

Bacillus,

Beijerinckia,

Clostridium,

Corynebacterium,

Derxia,

Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodo Pseudomonas và
Xanthobacter (Saxena và cộng sự,1998).
-

Azospirillum

Vào năm 1922, Beijerinck nhà vi sinh vật học và thực vật học người Hà Lan
đã phát hiện một vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có
nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn. Ban đầu ông đặt chủng mới này là
“Azotobacter spirillum”, nhưng sau đó đổi tên thành “Spirillum lipoferum”. Năm
1932, Schroder đãtiến hành nghiên cứu lại về S.lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi
chứng minh sự cố định nitơ bởi những chủng vi khuẩn thuần. Vì thế chủng này đi vào
quên lãng trong nhiều năm. Vào năm 1963 Becking đã phân lập được một số vi khuẩn
tương tự với S.lipoferum có khả năng cố định nitơ rõ rệt. Cách mười năm sau đó
Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ phân lập được từ mẫu đất lấy từ
Italya là Spirillum lipoferum và chứng minh được khả năng cố định nitơ của chủng này
trong canh trường lỏng có bổ sung một lượng nhỏ cao nấm men. Vào năm 1978
Tarrand và cộng sự đã công bố trong tài liệu nghiên cứu khóa phân loại di truyền một
loài vi khuẩn “Azospirillum lipoferum “, bởi vì loài này có độ tương đồng di truyền
cũng như có nhiều đặc điểm tương ứng vói mô tả của Beijerinck về S.lipoferum, đặc
biệt, chúng hình thành những tế bào có hình dạng giống với Spirillum trong điều kiện
nhất định. Cũng trong năm 1978, Tarrand và cộng sự cũng đã phát hiện thêm loài
Azospirillum brasilense.

9 


 

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Spirillaceae. Tế bào có dạng hình
cầu, hình que hay xoắn từ nửa vòng đến vài vòng, kích thước trung bình 0,9 – 1,2 µm,
tế bào đôi khi có Gram thay đổi. Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn bề mặt khuẩn
lạc rắn và khô sau vài ngày để trong tủ ấm. Khuẩn lạc của một số dòng có màu hồng
sáng đến hồng đậm trên môi trường phân lập có bổ sung đỏ công-gô trong tế bào có
những hạt poly – β – hydroxybutyrate hiện diện.
Theo bảng phân loại của Bergey thì Azospirillum gồm 5 loài:


Azospirillum lipoferum: được phân lập đầu tiên bởi Beijerinck (1925) từ

đất cát nghèo nitơ ở Netherlands và được đặt tên là Spirillum lipoferum. Loài vi khuẩn
này được phân lập trễ hơn từ đất (Schroder, 1932) và từ rong biển ướt (Derx,1949 trích
dẫn bởi Becking, 1963) và là vi khuẩn hình cầu có ở cây nhiệt đới (Becking, 1963).
Được mô tả chi tiết lần đầu tiên bởi Tarrand: khuẩn lạc có màu hồng, gồ cao, có rìa.
Khi cấy trên môi trường khoai tây, tế bào có kích thước trung bình 1.3 – 5 μm. A.
lipoferum có hình xoắn, di động bằng lông roi, có khả năng sử dụng glucose, α-aceto
glutarate, citrate làm nguồn carbon khi nuôi trên môi trường vô đạm, cần biotin cho sự
phát triển.


Azospirillum brasilense: có đặc điểm hình thái giống A.lipoferum, có khả

năng sử dụng glucose, sucrose, α-aceto glutarate. Tế bào không có nhiều hình dạng khi
môi trường trở nên kiềm.


Azospirillum irakense: tế bào có chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, có khả năng sử

dụng glucose, sucrose. Trên môi trường dịch thể khong sử dụng được myo-inosytol, có

khả năng phân giải pectin.


Azospirillum halopraeferens: tế bào có chiều rộng 0,7 – 1,4 μm, có khả

năng sử dụng α-aceto glutarate như nguồn carbon. Trên môi trường vô đạm không sử
dụng glucose, sucrose, cần biotin cho sự phát triển trên môi trường có áp suất cao.


Azospirillum amzonense: khuẩn lạc màu trắng, lớn, gồ cao, tế bào có

chiều rộng 0,8 – 1 μm, có khả năng sử dụng glucose, sucrose trên môi trường vô đạm.
Cho đến tháng 6 năm 2008, đã có 12 loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum được
định danh theo nguồn tử ngân hang dữ liệu gene NCBI.
Các loài của giống Azospirillum phân bố rất rộng rãi và được phân lập từ vùng
đất xung quanh rễ của các loài cây hoang dại và một số cây nông nghiệp như cây thân
10 


 

thảo, ngũ cốc, thực phẩm và đất ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt ở các vùng đất khác nhau
trên khắp thế giới.
Tất cả các dòng Azospirillum hoang dại đều có khả năng cố định nitơ như các
sinh vật tự do có mối liên hệ với cây trồng và chúng còn tham gia vào sự chuyển hóa
trong chu trình nitơ. Azospirillum là sinh vật hóa tự dưỡng (chemoorganotrophic) với
oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi trao đổi chất của sự hô hấp, tuy nhiên
cũng có một vài dòng có thể tự dưỡng nhờ hydro tự nhiên.
Nhiệt độ phát triển tối ưu nằm trong khoảng 34 – 37oC và một vài loài có thể
phát triển tốt ở pH 7, một số khác lại phát triển tốt trong điều kiện pH ở mức thấp

hơn.Chúng đều có phản ứng oxydase dương tính. Hầu hết chúng phát triển tốt trong
môi trường có chứa nguồn gốc carbonhydrate sau: malate, succinate, lactate và
pyruvate.
Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn sản sinh ra các hormone ngoại tiết có
khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật như: IAA, ILA, cytokinin, GA3. Thêm vào
đó, chúng còn có khả năng khử nitrat, tạo ABA, sản xuất siderophore (hợp chất nhỏ có
ái lực với sắt cao) và những phân tử tín hiệu không xác định có thể giúp cho quá trình
trao đổi chất và khả năng hút NO3-, P2O5 và K+ của thực vật bằng cách làm cho rễ cây
phát triển dài ra. Điều này có thể do Azospirillum có thể sử dụng enzyme pectinase
phân giải pectin để làm mềm lớp phiến mỏng trên rễ cây nên tăng khả năng hút
khoáng.
Bên cạnh đó, Holguin và Glick (2001) đã chứng minh được loài A.brasilense có
thể biểu hiện gene ACC – deaminase, kích thích sự phát triển của cây cải dầu và cà
chua.ACC – deaminase là enzyme phân cách l – aminocyclopropan – tiền chất
ethylene, giúp giảm hàm lượng ethylene ở thực vật. Theo Glick và cộng sự (1998), sự
thay đổi nồng độ hormone ethylene ở cây trồng là một cơ chế hữu hiệu kích thích thực
vật tăng trưởng.

11 


 

-

Azotobacter

Năm 1901, nhà khoa học Beijerincki đã phân lập lần đầu tiên loài vi khuẩn này
từ đất và đặt tên là Azotobacter chrococcum. Kể từ đó, các vi khuẩn thuộc chi
Azotobacter được nghiên cứu nhiều hơn. Chúng được tìm thấy trong đất và xung

quanh vùng rễ thực vật, một số ít được phát hiện trong môi trường nước.
Azotobacter là vi khuẩn gram âm, kích thước từ 1,6-2,7 x 3,0-70 µm. Tế bào có
dạng hình que, hình cầu hoặc hình trứng tùy loài, tùy thuộc vào môi trường và thời
gian nuôi cấy. Azotobacter thường tồn tại ở dạng tế bào riêng rẽ, kết thành từng đôi
hoặc từng nhóm không đều và hiếm khi ở dạng chuỗi dài. Không sinh nội bào tử
nhưng tạo bào xác, giúp chống chịu với các điều kiện khô hạn và bất lợi. Di động nhờ
tiên mao hoặc không có khả năng di động. Khuẩn lạc của Azotobacter thường trơn,
bóng, đục, lồi và nhầy. Khi còn non khuẩn lạc có màu trắng đục, sau đó dần chuyển
sang màu vàng hoặc nâu đen. Azotobacter có khả năng tạo sắc tố trên môi trường nuôi
cấy, thường có màu nâu đến đỏ, có loài tạo sắc tố phát huỳnh quang.
Hầu hết các loài Azotobacter đều có lông roi (flagella) nhưng chỉ có A.agile và
A.vinelandii là có sự di động rõ ràng. Sự sắp xếp của lông roi rất nhiều tranh cãi nhưng
theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết
Azotobacter có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A.insique có lông roi nằm ở một cực và
A.nigricans có lông roi dạng hình nhẫn đặc biệt (peculiar ring- shaped configuration).
Khi già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành
dạng hình cầu. Sinh chất xuất hiện nhiều hạt, đó làcác hạt volutin, granulose, các giọt
mỡ. Quan sát dưới kính hiển vi, cho thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi
một lớp vỏ nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng 75% là chất hydrid của uronic acid
và chỉ khoảng 0,023% nitơ. Ngoài ra, trong các bình nuôi cấy có thể thấy xuất hiện
những dạng khổng lồ của tế bào Azotobacter; cũng có khi xuất hiện những dạng nhỏ
bé đến 0,2 µm, thậm chí đôi khi xuất hiện cả những dạng qua lọc hết sức nhỏ bé. Khi
gặp điều kiện thuận lợi, các dạng này có thể nhanh chóng phát triển thành các tế bào
bình thường. Tóm lại, hình dạng tế bào Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ
thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển.

12 


 

Theo Becking (1974), Azotobacter có 4 loài: A.chroococcum, A. beijerinckii,
A.vinelandii, A. agilis
 Azotobacter chroococcum: có kích thước tế bào 2,0 x 3,1 µm, tạo nang xác, có
khả năng di động được, có tiên mao. Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không
khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose...
 Azotobacter beijerinskii: có kích thước tế bào 2,4 x 5,0 µm, có khả năng tạo
nang xác, không có lông roi, không di động được. Khi già có màu vàng hoặc vàng nâu,
sắc tố không khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol không đồng
hóa tinh bột nhưng đồng hóa benzoat natri.
 Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng tạo nang
xác, có tiên mao, có khả năng di động. Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh
quang, sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và
benzoat natri.
 Azotobacter agilis: tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm. Không tạo nang xác, có
lông roi, có khả năng di động được. Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang,
sắc tố khuếch tán vào môi trường. Không có khả năng đồng hóa benzoat natri,
mannitol.Nhưng theo khóa phân loại Bergey (2005), Azotobacter gồm có 5 loài: A.
chroocuccum, A. beijerincki, A. vinelandi, A. agilis, A. paspali .
Azotobacter có khả năng cố đinh nitơ, sự cố định nitơ của chúng có liên quan
tới sự tăng nhanh số lượng tế bào, thông thường cố định được 15 – 20 mg nitơ trên
mỗi gram glucose, sucrose hay mannitol dưới điều kiện tối ưu. Thí nghiệm của Fischer
với 48 dòng A. chroococcum trong 7 ngày đã thu được lượng nitơ nằm trong khoảng
13 – 19,5 mg (trung bình là 17,8 mg) trên gram mannitol. Đối với các nguồn carbon
khác như acetic acid, lactic acid và gluconic acid trong môi trường có bổ sung đầy đủ
molypden thì Azotobacter có thể cố định được 10 – 13 mg trên mỗi gram carbon. Khi
sống trong môi trường có nguồn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất
thấp hoặc không có.Trên các môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc Azotobacter có
dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo.Một số chủng có khả năng sử dụng nitrit, nitrat.Hai
loại amino acid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là

glutamic acid và asparaginic acid.
13 


 

Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí có khuynh hướng phát triển trên bề mặt của
môi trường nuôi cấy.
Azotobacter rất mẫn cảm với pH, chúng có thể phát triển được ở pH 4,5 – 9,0,
nhưng thích hợp nhất là pH 7,2 –8,2. Đối với A.chroococcum và A. vinelandii pH tối
ưu là gần 7,5 với Azotobacter beijerinskii là gần 6,8.
Một đặc điểm nữa rất quan trọng đó là chúng cần độ ẩm rất cao của đất để phát
triển, ngưỡng thích hợp nhất là 75 – 80 %.
Ngoài khả năng cố định đạm tthì chúng còn có khả năng tiết ra hormone thực
vật (IAA), các vitamin (B1, B6, nicotinic acid, pentotenic acid, biotin).Bên cạnh đó nó
còn có thể tiết ra các loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomixin để chống nấm. Một số
chủngA.chroococcum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có phổ tác dụng khá
rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria).
-

Beijerinckia

Quá trình cố định nitơ của nhóm vi khuẩn này được phát hiện đầu tiên ở vùng
rễ của cây mía tại Brazil bởi Dobereiner và Alvahydo (1959) và Dobereiner (1961). Vi
khuẩn Beijerinckia phân bố rộng trong tự nhiên, đặc biệt là gần vùng rễ của những loài
thực vật nhiệt đới. Trước khi phát hiện ra vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus
thì Beijerinckia được xem như là giống vi khuẩn quan trong nhất trong việc cố định
nitơ ở cây mía.
Beijerinckia thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, sống hiếu khí, tế bào hình cầu,
hình bầu dục hoặc hình que, kích thước 0,5 – 20 x 1,0 – 45 µm, không sinh bào tử và

bào xác. Một số loài có thể di động nhờ sự hình thành tiêm mao.
Vi khuẩn Beijerinckia có khả năng phát triển tốt trên môi trường có chứa các
loại đường đơn và đường đa, nhưng lại phân giải yếu đối với tinh bột và acid hữu cơ.
Có tính chống chịu cao với pH acid, có thể phát triển trên môi trường pH trung tính
hoặc kiềm yếu. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là ở 25 – 30oC (Mechaz, 2011).
- Burkholderia
Yabuuchi và cộng sự tìm ra vi khuẩn Burkholderia vào năm 1992. Đến năm
2009, Spilker đã phân loại được hơn 40 loài thuộc giống Burkholderia ở nhiều môi
14