Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch tiểu phần bám dính (receptor binding domain) của protein FimH dung hợp với GFP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ PHƯƠNG LINH

TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
TIỂU PHẦN BÁM DÍNH (RECEPTOR BINDING DOMAIN)
CỦA PROTEIN FIMH DUNG HỢP VỚI GFP

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

ThS. Nguyễn Thanh Thảo
CN. Nguyễn Thị Thanh Hòa

Thành phố Hồ Chí Minh - 2016


Lời cảm ơn
Tháng 10/2015 – tháng 7/2016, quãng thời gian tám tháng tuy không quá dài,
nhưng cũng vừa đủ để viết nên câu chuyện của tôi, một câu chuyện đối với tôi là hoàn
mỹ và bây giờ nó đang đi đến hồi kết. Khi một câu chuyện cũ kết thúc là một câu
chuyện mới sắp được viết ra, có thể nó tươi mới hơn và hấp dẫn tôi hơn. Nhưng trong
những cái gọi là sự “kết thúc”, bao giờ cũng có chút gì đó nuối tiếc.
Quãng thời gian được học tập và làm việc trong nhóm nghiên cứu GMIF đối
với tôi là điều tuyệt vời mà cuộc đời đã cho tôi, là điều quý giá mà mọi người dành

cho tôi.
Trước hết, con xin cảm ơn ba mẹ, tuy không sống gần con, tuy không thể lúc
nào cũng kề vai sát cánh bên con, nhưng con biết ba mẹ luôn luôn ủng hộ những bước
đi của con và con chưa một lần nào nghi ngờ về điều đó.
Em xin cảm ơn Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, TP. HCM đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành
Khóa luận.
Có một người Thầy mà em luôn kính trọng và yêu quý, không chỉ bởi những
tận tình Thầy dành cho Sinh viên chúng em, mà còn bởi cái cách Thầy gần gũi, vui
tươi với chúng em phía ngoài phòng thí nghiệm. Em xin cảm ơn Thầy, Thầy Trần
Văn Hiếu – Trưởng nhóm nghiên cứu GMIF. Cảm ơn Thầy đã cho em cơ hội được
học tập, làm việc và giúp đỡ em hoàn thiện bản thân.
Em xin cảm ơn chị Nguyễn Thanh Thảo, người luôn vui vẻ giúp đỡ em mọi
lúc có thể, cho em những lời khuyên bổ ích và hướng đi đúng đắn.
Em xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thanh Hòa đã luôn bên cạnh em trong suốt
thời gian thực hiện Khóa luận. Cảm ơn chị vì những kiến thức và kĩ năng quý giá chị
đã truyền dạy cho em. Cảm ơn chị vì những hôm “đi sớm về trễ” cùng em làm thí
nghiệm. Cảm ơn chị vì tất cả thời gian chị dành cho em. Những hiểu lầm hay xích
mích dù lớn hay nhỏ cũng không thể nào làm mờ nhạt đi kết quả cuối cùng rằng, chị
và em, chúng ta đã cùng nhau hoàn thành Khóa luận này, điều mà nếu không có chị,
một mình em chẳng bao giờ dám mơ tưởng đến.


Em xin cảm ơn các anh chị, anh Minh Thượng, chị Bảo Châu, anh Mạnh
Cường, anh Công Thuận, chị Xuân Mai, anh Hoàng An, anh Minh Quân, anh Hiếu
Nghĩa, anh Minh Vũ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện Khóa luận, cho em
được học tập thêm nhiều kiến thức từ các anh chị.
Linh xin cảm ơn tất cả các bạn Việt Anh, Thùy Dung, Hoàng Phương, Văn
Hảo, Kiến Quang, Kim Tuyền, Minh Tâm, Phương Thảo, Minh Thư, Cẩm Nhung,
Lê Văn đã giúp đỡ Linh, cùng Linh trải qua quãng thời gian đáng nhớ khi làm việc

tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng, em xin cảm ơn Anh, người tuy không cùng máu mủ, nhưng lại xem
em như là ruột thịt. Cảm ơn Anh đã luôn sẵn sàng giúp đỡ em, động viên em. Cảm
ơn Anh đã không những cho em những bài học về kiến thức, mà còn giúp em trưởng
thành hơn qua những câu chuyện về cuộc sống. Trăm câu nghìn chữ viết ra cũng
không thể nào diễn tả hết lòng biết ơn của em đối với Anh.
Một lần nữa, em xin cảm ơn mọi người.
Xin cảm ơn, cảm ơn, cảm ơn…
“Những gì đã qua em sẽ để dành suốt đời”
Đinh Thị Phương Linh


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... iii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................................4
1.1. VẮC XIN ĐƯỜNG UỐNG .............................................................................5
1.1.1. Hiện trạng các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa .................................5
1.1.2. Vắc xin đường uống ................................................................................6
1.2. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH THÔNG QUA TẾ BÀO M ...................................10
1.2.1. Khái quát hệ thống miễn dịch ở ruột non ..............................................10
1.2.2. Tế bào M ................................................................................................13
1.3. PROTEIN FIMH ............................................................................................16
1.3.1. Cấu trúc protein FimH ...........................................................................17
1.3.2. Protein FimH gắn định hướng tế bào M thông qua thụ thể
Glycoprotein 2 ...................................................................................................19
1.4. PROTEIN PHÁT HUỲNH QUANG LỤC GFP ...........................................20
1.4.1. Khái quát về protein GFP ......................................................................20

1.4.2. Ứng dụng của GFP ................................................................................20
1.5. BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN Escherichia coli ...................21
1.6. TINH SẠCH PROTEIN.................................................................................22
1.6.1. Các phương pháp sắc ký ........................................................................23
1.6.2. Sắc ký ái lực (Affinitive Chromatography – AC) .................................23
2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ..........................................................................25
2.1. VẬT LIỆU .....................................................................................................26
2.1.1. Thiết bị - Dụng cụ ..................................................................................26
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................27
2.1.3. Môi trường .............................................................................................30
2.1.4. Nguyên vật liệu ......................................................................................30
2.2. PHƯƠNG PHÁP............................................................................................31
2.2.1. Tạo dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET22b-fimHrb-gfp ...32
2.2.2. Biểu hiện protein dung hợp FimHrb-GFP .............................................39
2.2.3. Tinh sạch protein FimHrb-GFP .............................................................42


3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ...................................................................................45
3.1. TẠO DÒNG TẾ BÀO E. coli MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP
pET22b-fimHrb-gfp...............................................................................................46
3.1.1. Thu nhận gen fimHrb và thu nhận plasmid pET22b-gfp .......................46
3.1.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 mang sản phẩm nối
pET22b-fimHrb-gfp bằng kĩ thuật PCR khuẩn lạc ...........................................47
3.1.3. Kiểm tra plasmid pET22b-fimHrb-gfp bằng giải trình tự......................49
3.2. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP FimHrb-GFP ...........49
3.2.1. Sàng lọc tế bào BL21 (DE3) mang plasmid pET22b-fimHrb-gfp .........49
3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện protein FimHrb-GFP ..........................................50
3.2.3. Quan sát protein FimHrb-GFP bằng kính hiển vi huỳnh quang ............52
3.3. TINH SẠCH PROTEIN FimHrb-GFP ..........................................................53
4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .....................................................................................56

4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................57
4.2. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................57
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................58
6. PHỤ LỤC ............................................................................................................. iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CD40

Cluster of differentiation 40

CD80

Cluster of differentiation 80

CD86

Cluster of differentiation 86

DC

Dendritic Cell

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxynucleoside Triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

GFP

Green Fluorescent Protein

GP2

Glycoprotein 2

IgA

Immunoglobulin A

IL-4

Interleukin 4

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LBS

Lipopolysaccharides

M

Microfold

MCS

Multiple cloning site

MHC II

Major Histocompatibility Complex

OD

Optical Density

PBST

Phosphate buffered saline – Tween

PCR

Polymerase Chain Reaction

PPs

Peyer’s Patch

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamide gel
electrophoresis

SED

Subepithelial Dome

THP

Tamm Horsfall

TLR-2

Toll-like Receptors 2

UEA-1

Ulex europaeus agglutinin – 1
i


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tác động của vắc xin đối với một số bệnh nhiễm khuẩn thường gặp ........7

Bảng 1.2. Một số vắc xin đang được sử dụng hiện nay ..............................................9
Bảng 1.3. Ligand và thụ thể đặc hiệu trên tế bào M .................................................15

ii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc các lớp trong ruột non.................................................................11
Hình 1.2. Cấu trúc biểu mô ruột non.........................................................................11
Hình 1.3. Cấu trúc Peyer’s Patch ..............................................................................12
Hình 1.4. Đáp ứng miễn dịch màng nhầy sản sinh kháng thể IgA ...........................13
Hình 1.5. Tế bào M ...................................................................................................14
Hình 1.6. Cấu trúc gồm nhiều tiểu phần của lông roi loại 1 .....................................17
Hình 1.7. Cấu trúc protein FimH và cấu trúc tiểu phần bám dính của protein FimH
...................................................................................................................................18
Hình 2.1. Plasmid pET22b-gfp .................................................................................31
Hình 2.2. Plasmid pET22b ........................................................................................31
Hình 2.3. Thang phân tử lượng .................................................................................31
Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình tạo dòng E. coli mang vector pET22b-fimHrb-gfp
...................................................................................................................................32
Hình 3.1. Thu nhận, xử lý gen fimHrb và plasmid pET22b-gfp với enzyme cắt giới
hạn NdeI/BamHI........................................................................................................46
Hình 3.2. Biến nạp sản phẩm nối giữa gen fimHrb và pET22b-gfp vào vi khuẩn
E. coli DH5 .............................................................................................................47
Hình 3.3. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5 mang pET22b-fimHrb-gfp bằng mồi
đặc hiệu trên gen fimHrb ...........................................................................................48
Hình 3.4. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5 mang pET22b-fimHrb-gfp bằng mồi
trên plasmid ...............................................................................................................48
Hình 3.5. Biến nạp plasmid pET22b-fimHrb-gfp vào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) 50
Hình 3.6. Sàng lọc thể biến nạp E. coli BL21(DE3) mang pET22b-fimHrb-gfp bằng

mồi trên plasmid ........................................................................................................50
Hình 3.7. Kiểm tra biểu hiện protein FimHrb-GFP bằng SDS-PAGE và Western
Blot ............................................................................................................................51
Hình 3.8. Ảnh chụp huỳnh quang mẫu tế bào và các pha protein. ...........................52
Hình 3.9. Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch
bám cột Tris 50 mM pH 7,5 ......................................................................................53
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch
bám cột Acetate 50 mM pH 7,5, dịch rửa không bổ sung Imidazole .......................54
Hình 3.11. Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch
bám cột Acetate 50 mM pH 7,5, dịch rửa có bổ sung Imidazole..............................54

iii


Đặt vấn đề

Khóa luận tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ lâu, những vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm đã trở thành một trong
những mối quan tâm hàng đầu trong cộng đồng. Vấn đề này không chỉ dừng lại ở
mức độ ngộ độc thực phẩm, việc ăn phải các thực phẩm không an toàn cũng có thể
dẫn đến hàng loạt các căn bệnh nguy hiểm khác lây truyền qua con đường tiêu hóa.
Nhiều biện pháp phòng tránh đang được tập trung phát triển nhằm ngăn chặn nguy
cơ lây nhiễm các bệnh liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm hiện đang gia tăng.
Hằng ngày, cơ thể con người luôn phải tiếp xúc thường xuyên và trực tiếp với các tác
nhân gây bệnh có trong thực phẩm thông qua con đường tiêu hóa. Chính vì vậy, việc
tìm ra phương thức hỗ trợ ngăn chặn sự lan truyền của các tác nhân gây bệnh ngay từ
bước xâm nhiễm đầu tiên này là một phương pháp hiệu quả trong việc phòng chống
các bệnh lây nhiễm. Vì thế, một phương pháp tiềm năng với nhiều ưu điểm đang được

hướng tới chính là vắc xin đường uống.
Vắc xin đường uống thể hiện ưu điểm của nó ở nhiều khía cạnh khác nhau.
Đầu tiên, nếu vắc xin đường uống được phát triển thành công, nó có thể ngăn chặn
tác nhân gây bệnh ngay từ bước đầu xâm nhập. Đồng thời, vắc xin đường uống có
khả năng kích hoạt được không chỉ riêng hệ thống miễn dịch tại vị trí xâm nhiễm mà
còn cả hệ thống miễn dịch trong toàn cơ thể. Do đó vắc xin đường uống ngoài phòng
ngừa việc xâm nhiễm của vi sinh vật theo con đường tiêu hóa, nó còn có thể ngăn
chặn sự phát tán của vi sinh vật theo con đường máu. Tiếp theo, việc phát triển thành
công vắc xin đường uống có thể sẽ là một hướng giải quyết triệt để đối với tình trạng
kháng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay. Với tình hình thị trường tiêu dùng ngày
càng tẩy chay các thực phẩm chăn nuôi có sử dụng kháng sinh, và dự thảo cấm sử
dụng kháng sinh trong chăn nuôi đang sắp được thực hiện, vắc xin đường uống ra đời
có thể sẽ là một hướng giải quyết tốt vì ưu điểm của nó là có thể dễ dàng sử dụng và
áp dụng trên quy mô lớn.
Mặc dù vắc xin đường uống mang nhiều ưu điểm vượt trội, việc phát triển của
loại vắc xin này vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Việc thành phần vắc xin phân tán trực
tiếp trên niêm mạc ruột, cụ thể là khu vực màng nhầy, cản trở kháng nguyên đến đúng
vị trí mà nó cần kích hoạt quá trình đáp ứng miễn dịch, là rào cản đầu tiên đối với vắc
xin đường uống. Mặc dù hệ thống miễn dịch màng nhầy có cơ chế hiệu quả ngăn
Đinh Thị Phương Linh

1


Khóa luận tốt nghiệp

Đặt vấn đề

ngừa sự xâm nhiễm của vi sinh vật thông qua việc tiết kháng thể IgA vào trong lòng
ruột, bắt lấy kháng nguyên và đào thải chúng ra ngoài theo nhu động ruột, khu vực

này lại có xu hướng dung nạp miễn dịch cao hơn đáp ứng miễn dịch. Xu hướng dung
nạp miễn dịch nhằm tránh các đáp ứng không mong muốn đối với các kháng nguyên
lạ mà cơ thể phải tiếp xúc hằng ngày. Có nhiều giải pháp hiện nay được tập trung
nghiên cứu để hỗ trợ sự phát triển của vắc xin đường uống. Gần đây, có nhiều nghiên
cứu hướng tới sử dụng tế bào M, một tế bào đặc biệt bên trong niêm mạc ruột, có khả
năng thu nhận và vận chuyển kháng nguyên đến khu vực gây đáp ứng. Tế bào M là
cửa ngõ đầu tiên cho sự xâm nhập của kháng nguyên. Kháng nguyên khi được định
hướng đến tế bào M, nó sẽ được vận chuyển xuống hệ thống mô miễn dịch bên dưới
và kích hoạt phản ứng đáp ứng miễn dịch. Mặc dù đảm nhận vai trò quan trọng đối
với hệ thống miễn dịch màng nhầy của cơ thể, nhưng tế bào M chỉ chiếm một tỉ lệ
nhỏ trong tổng số các tế bào ruột. Chính vì thế, việc định hướng kháng nguyên đến
tế bào này là hết sức cần thiết. Do đó, cần tìm ra một yếu tố định hướng kháng nguyên
đến đúng đích là tế bào M để đạt hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch. Theo nhiều nghiên
cứu, protein FimH – một tiểu phần trong cấu trúc lông roi loại 1 của vi khuẩn E. coli
có khả năng bám dính đặc hiệu với thụ thể Glycoprotein 2 trên bề mặt tế bào M.
Chính khả năng bám dính của protein FimH đã hỗ trợ vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể.
Do đó, protein FimH có khả năng bám định hướng tế bào M được nghiên cứu để ứng
dụng làm yếu tố định hướng cho vắc xin đường uống.
Trong một nghiên cứu trước đây, việc biểu hiện protein FimH trong tế bào vi
khuẩn E. coli gặp phải vấn đề là protein FimH biểu hiện ở thể vùi, do đó gây cản trở
quá trình tinh sạch và thử hoạt tính. Vì vậy, cấu trúc protein FimH đã được tìm hiểu
và chúng tôi nhận thấy rằng protein FimH có cấu trúc gồm hai domain có vai trò khác
nhau: domain bám dính (FimHrb) có vai trò trong việc bám dính, và domain gắn
(FimHp) có chức năng đính FimH với các tiểu phần phía dưới của lông roi loại 1.
Việc biểu hiện chỉ domain bám dính FimHrb của protein FimH có thể mở ra hướng
khả quan hơn về khả năng biểu hiện và tính tan của protein này. Nhằm mục đích theo
dõi khả năng định hướng tế bào M của protein FimHrb, protein này được dung hợp
với protein GFP nhằm đánh giá khả năng bám dính thông qua hoạt tính phát huỳnh
quang.

Đinh Thị Phương Linh

2


Khóa luận tốt nghiệp

Đặt vấn đề

Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tạo dòng, biểu hiện và
tinh sạch tiểu phần bám dính (receptor binding domain) của protein FimH dung
hợp với GFP” trên hệ thống E. coli nhằm cung cấp những thông tin ban đầu cho dự
án phát triển vắc xin đường uống.

Đinh Thị Phương Linh

3


1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

1.1. VẮC XIN ĐƯỜNG UỐNG
1.1.1. Hiện trạng các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa

Hiện nay, những vấn đề về an toàn thực phẩm và sức khỏe của người tiêu dùng
thực phẩm đang ngày càng được quan tâm. Hàng loạt các vụ ngộ độc thực phẩm xảy
ra liên tiếp trong thời gian gần đây đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và thậm
chí là cướp đi sinh mạng của nhiều người.
Theo số liệu thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO vào năm 2010, trên thế
giới có 582 triệu trường hợp mắc các bệnh liên quan đến thực phẩm, trong đó có
351.000 trường hợp dẫn đến tử vong [1]. Tình trạng bệnh do thực phẩm này có thể
bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân: thực phẩm bị lây lan độc tố, bị nhiễm độc từ môi
trường tự nhiên, gây ra bởi vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng, hoặc nhiễm độc thông qua
sự nhiễm các chất hóa học từ thực phẩm hoặc nguồn nước. Trong các nguyên nhân
được dự đoán trên, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh dịch Hoa Kỳ (The
Centers for Disease Control and Prevention – CDC) đã xác định được 31 nguồn gây
bệnh cụ thể, trong đó có 90% nguồn gây bệnh là từ các vi sinh vật: Salmonella,
Campylobacter, Toxoplasma, E. coli O157:H7, Listeria Clostridium perfringens và
norovirus [2].
Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ ngộ
độc thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm. Số người bị ngộ độc thực phẩm trung bình
mỗi năm là 5.302 người/năm. Tổng số người chết là 298 người, trung bình 49,7
người/năm. Riêng trong năm 2010, trên cả nước đã xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm
làm 5.664 người mắc bệnh và trong đó có 42 trường hợp tử vong. Tìm hiểu về nguyên
nhân, Bộ Y tế đã xác định được nguyên nhân chính xác của 58,5% vụ ngộ độc thực
phẩm. Các nguyên nhân bao gồm ngộ độc do hóa chất hoặc do thực phẩm có sẵn độc
tố trong tự nhiên, trong đó nguyên nhân do vi sinh vật chiếm đến 51% [3].
Bên cạnh đó, vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh ngày một tăng lên ở vi
sinh vật đã mang tính toàn cầu. Nhóm nghiên cứu Quốc gia GARP ở Việt Nam, thuộc
tổ chức CDDEP (Center for Disease Dynamics, Economics & Policy) – Hoa Kỳ đã
thực hiện một cuộc nghiên cứu, khảo sát “Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh
và kháng kháng sinh ở Việt Nam”. Theo đó, tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam
hiện nay đang ở mức độ cao, điển hình như các chủng Streptococcus pneumoniae có
Đinh Thị Phương Linh

5


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

tỉ lệ kháng lần lượt là 71,4% và 92,1% đối với penicillin và erythromycin. Một nghiên
cứu giám sát đã cho thấy thực phẩm bao gồm thịt và cá phát hiện nhiễm Salmonella
đa kháng kháng sinh. Campylobacter phân lập từ thịt gà cũng có mức kháng cao:
90% kháng với nalidixic acid, 89% với tetracycline và 82% đối với ciprofloxacin. Vi
khuẩn phân lập từ trẻ bị tiêu chảy cũng có tỉ lệ kháng kháng sinh cao. Các vi khuẩn
gram âm đa số là kháng kháng sinh: 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với
ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic [4]. Bên
cạnh đó, châu Âu đang dự định đưa ra lệnh cấm sử dụng và nhập sản phẩm có sử
dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn Việt Nam
cũng đã đưa ra dự kiến cho ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm
2018 [5].
Với tình hình bệnh gây ra bởi vi sinh vật lan truyền qua con đường thực phẩm
nghiêm trọng như hiện nay, việc tìm ra một giải pháp mới và hiệu quả để ngăn ngừa
các bệnh gây ra bởi vi sinh vật thông qua con đườnng ăn uống là cần thiết. Đồng thời,
cùng với tình trạng kháng kháng sinh gia tăng, cần phải tìm ra một giải pháp mới
ngăn ngừa các bệnh gây ra từ vi sinh vật trong chăn nuôi vừa hiệu quả, vừa tốn ít chi
phí, đáp ứng điều kiện sản xuất hàng hóa trong và ngoài nước. Vắc xin đường uống
là một giải pháp tiềm năng, với nhiều ưu điểm sẵn có, sẽ đáp ứng được rất lớn nhu
cầu phòng bệnh cho người tiêu dùng thực phẩm và vật nuôi.
1.1.2. Vắc xin đường uống
Hơn một thế kỉ trước, các căn bệnh như sởi, bạch hầu, đậu mùa đã hoành hành
trên khắp thế giới, đứng vào nhóm các căn bệnh nguy hiểm hàng đầu và đã cướp đi

sinh mạng của nhiều người. Mãi cho đến khi có sự ra đời của phương thức phòng
bệnh là vắc xin, các căn bệnh này mới dần được đẩy lùi. Vắc xin đầu tiên được công
nhận và cấp phép sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới vào thế kỉ XIX là vắc xin bại liệt
giảm độc lực [6]. Tính đến nay, vắc xin là phương thức thành công, hiệu quả và phổ
biến trong việc ngăn ngừa lại các bệnh (Bảng 1.1).
Có thể phân loại vắc xin theo phương thức sử dụng: vắc xin sử dụng đường
tiêm và vắc xin sử dụng qua bề mặt niêm mạc (niêm mạc ruột, niêm mạc phổi và
niêm mạc đường tiết niệu). Vắc xin đường tiêm đã được nghiên cứu từ sớm và tính
đến nay, người ta đã phát triển được một số lượng lớn các loại vắc xin tiêm được sử
Đinh Thị Phương Linh

6


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

dụng rộng rãi. Không thể phủ nhận vai trò vô cùng quan trọng của vắc xin đường
tiêm, bởi hàng loạt các căn bệnh nguy hiểm đến tính mạng đã được phòng ngừa ngay
từ đầu bằng vắc xin tiêm như: bại liệt, uốn ván, sởi, … Tuy nhiên, với những ưu điểm
nổi bật riêng của mình, vắc xin đường uống đã được tập trung nghiên cứu gần đây và
cho được những kết quả khả quan trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể
chống lại các tác nhân gây bệnh.
Bảng 1.1. Tác động của vắc xin đối với một số bệnh nhiễm khuẩn thường gặp [7]

Bệnh
Bạch hầu
Sởi
Quai bị

Ho khan
Bại liệt
Rubella
Uốn ván

Số ca mắc bệnh
nhiều nhất

Số ca mắc bệnh
vào năm 2004

206.939 (1921)
891.131 (1941)
152.209 (1968)
265.269 (1934)
21.269 (1952)
57.688 (1969)
1.560 (1923)

0
37
236
18.957
0
12
26

Phần trăm
giảm
-99,99

-99,99
-99,90
-96,84
-100
-99,98
-98,33

Vắc xin đường uống mang một số đặc điểm lợi thế hơn so với vắc xin đường
tiêm, nổi bật là việc sử dụng vắc xin đường uống dễ dàng. Sử dụng vắc xin đường
uống không đòi hỏi phải có nhân viên kĩ thuật được đào tạo để thực hiện thao tác tiêm
chủng, do đó giảm chi phí về nhân lực. Đồng thời, việc không phải sử dụng kim tiêm
cũng giúp phòng tránh các bệnh lây nhiễm qua kim tiêm, đây chính là lợi thế rất có ý
nghĩa đối với các nước kém phát triển, nơi các bệnh truyền nhiễm qua đường kim
tiêm rất phổ biến.
Hơn nữa, vắc xin đường uống không đòi hỏi độ tinh sạch cao của sản phẩm
giống như vắc xin tiêm. Việc loại bỏ hoàn toàn các sản phẩm phụ sinh ra bởi vi khuẩn
trong vắc xin uống là không cần thiết, bởi vì môi trường ruột vốn đã là nơi khu trú
của một số lượng lớn vi sinh vật [8]. Trong khi đó, vắc xin tiêm không được phép
chứa nội độc tố của vi sinh vật. Đặc điểm này giúp giảm chi phí trong quá trình tinh
sạch sản phẩm.
Khu vực niêm mạc là nơi cơ thể tiếp xúc trực tiếp với môi trường bên ngoài
và hầu hết tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể thông qua con
đường này. Khả năng có thể kích thích được tốt đáp ứng miễn dịch ở khu vực màng
nhầy, đặc biệt là khu vực ruột đối với vắc xin đường uống trở thành ưu điểm nổi bật
Đinh Thị Phương Linh

7


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

của loại vắc xin này [9]. Vắc xin đường uống có thể kích thích đáp ứng miễn dịch
màng nhầy thông qua việc kích thích tiết IgA giúp ngăn chặn sự bám của vi sinh vật
lên biểu mô ruột, ngăn ngừa khả năng vi sinh vật xâm nhập sâu hơn vào các cơ quan
bên trong. Bên cạnh đó, vắc xin đường uống còn có thể kích thích đáp ứng miễn dịch
của toàn bộ cơ thể tạo ra IgG để ngăn ngừa thành phần của vi sinh vật trong máu. Ví
dụ, Rotarix và RotaTeq là hai loại vắc xin uống từ rotavirus giảm độc lực, có khả
năng phòng bệnh đến 90%, kích hoạt tiết được kháng thể IgA ở màng nhầy, tiết IgG
ở hệ thống và kích thích được đáp ứng của tế bào lympho T độc [10]. Chính khả năng
gây đáp ứng miễn dịch ngay từ bước đầu xâm nhiễm của vi sinh vật mà vắc xin đường
uống sẽ là một rào cản ngăn chặn vô cùng hiệu quả đối với tác động xấu của vi sinh
vật lên cơ thể.
1.1.2.1. Nhược điểm của vắc xin đường uống
Mặc dù sở hữu nhiều ưu điểm so với vắc xin đường tiêm, số lượng vắc xin
đường uống vẫn còn bị giới hạn lại ở con số rất hạn chế (Bảng 1.2), do việc nghiên
cứu phát triển vắc xin đường uống gặp phải khá nhiều khó khăn.
Môi trường khắc nghiệt bên trong ruột chính là một cản trở lớn. Ruột có pH
giao động từ 6,5 – 7,5, bên trong có hệ thống enzyme protease và peptidase có chức
năng phân hủy protein đi vào ruột, cùng với một hệ thống các enzyme protease tiết
ra từ tuyến tụy như trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, … Các
enzyme này phân hủy gần như toàn bộ tất cả các epitope kháng nguyên đưa vào cơ
thể ở dạng hòa tan [11].
Bên cạnh đó, diện tích rộng lớn của bề mặt biểu mô ruột cũng gây ra khó khăn
cho hoạt động của kháng nguyên. Diện tích tổng cộng của bề mặt niêm mạc ruột khi
trải ra được tăng lên gấp 600 lần so với diện tích của ống ruột lúc bình thường. Đó là
nhờ sự gấp nếp của các cấu trúc hình thành niêm mạc ruột: các nếp gấp ngang của
niêm mạc ruột giúp tăng diện tích lên gấp ba lần; các cấu trúc nhung mao xếp liên
tiếp nhau làm tăng diện tích bề mặt ruột lên khoảng 10 lần; trên mỗi nhung mao lại

có các tế bào biểu mô ruột được bao phủ khắp bề mặt bởi các lông siêu nhỏ, giúp diện
tích bề mặt ruột tăng lên 20 lần [12]. Cấu trúc gấp nếp của ruột này hoàn toàn phù
hợp với chức năng hấp thụ chất dinh dưỡng của ruột, tuy nhiên diện tích quá lớn của

Đinh Thị Phương Linh

8


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

ruột lại gây ra sự phân tán kháng nguyên được đưa vào ruột, đây là một trong những
trở ngại trong việc phát triển vắc xin đường uống.
Bảng 1.2. Một số vắc xin đang được sử dụng hiện nay [6]
Vắc xin tiêm
Anthrax
Yellow Fever
Cervical Cancer
Typhoid
DTaP; Tdap; DT; Td Tetanus
Hepatitis A
Rubella
Hepatitis B
Pertussis
Haemophilus
influenzae type b
(Hib)

Human
Papillomavirus
(HPV)
…

Tuberculosis
Meningococcal
Cholera
Smallpox
Rabies
Japanese
encephalitis

Vắc xin uống
Rota Teq; Rotarix
Orimune; OPV
Vivotif; Ty21 A
Orocol
FluMist
NASOVAC
Dukoral; Shancol

Thêm vào đó, vì ruột là nơi tiếp nhận rất nhiều tác nhân lạ từ môi trường bên
ngoài, trong đó có các chất dinh dưỡng, nên cơ thể có xu hướng dung nạp miễn dịch
cao hơn đáp ứng miễn dịch. Dung nạp miễn dịch là trạng thái ức chế đáp ứng của hệ
thống miễn dịch đối với kháng nguyên nhằm mục đích tránh các đáp ứng không mong
muốn cho cơ thể. Do đó, việc gây được đáp ứng miễn dịch ở ruột một cách chính xác
và hiệu quả gặp nhiều khó khăn [9].
1.1.2.2. Các phương pháp hỗ trợ phát triển vắc xin đường uống
Trước những nhược điểm của vắc xin đường uống, người ta đã nghiên cứu tìm

ra nhiều cách khắc phục để phát triển vắc xin đường uống tận dụng được đầy đủ
những ưu điểm vượt trội của nó.
Người ta lựa chọn các vật mang thích hợp như các hạt bao gói kháng nguyên
để đưa kháng nguyên đi vào cơ thể tránh được tác động của các enzyme trong ruột
cũng như môi trường khắc nghiệt của ruột: sử dụng các vật liệu polymer, tế bào thực
vật hoặc các sinh vật sống. Các cấu trúc hạt được thiết kế bao gói kháng nguyên lại
bên trong để tránh sự phân hủy bởi môi trường ruột như vi hạt polymer, lyposome
hoặc cochleate, … Việc sử dụng các hạt bao gói kháng nguyên này đã được chứng
minh là giúp bảo vệ kháng nguyên khỏi sự phân hủy của dịch ruột, đồng thời tăng
khả năng vận chuyển được kháng nguyên tới hệ thống miễn dịch. Gần đây, người ta
cũng đã phát triển hệ thống thực vật biểu hiện protein kháng nguyên trong tế bào của
chúng. Protein kháng nguyên biểu hiện với số lượng lớn trong tế bào thực vật, vì thế
Đinh Thị Phương Linh

9


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

liều lượng yêu cầu có thể đạt được dễ dàng, đồng thời chi phí tiêu tốn lại thấp. Tuy
nhiên, vấn đề gặp phải khi sử dụng tế bào thực vật mang kháng nguyên là việc kiểm
soát độ đồng đều và chất lượng của sản phẩm, mức độ rủi ro về sinh thái và sự chấp
thuận của công chúng đối với cây trồng biến đổi gen. Sử dụng vector là sinh vật sống
mang kháng nguyên là một hướng có tiềm năng khá lớn trong việc khắc phục nhược
điểm của vắc xin đường uống. Các chủng vi sinh vật được ưa thích là Salmonella và
Lactoccocus. Các chủng vi sinh vật được biến đổi để biểu hiện kháng nguyên mong
muốn, khi đưa vào cơ thể, chúng vượt qua được các điều kiện khắc nghiệt của môi
trường ruột và đưa kháng nguyên đến trúng đích [8].

Ngoài ra, giải quyết xu hướng dung nạp miễn dịch ở ruột, tá dược hỗ trợ kháng
nguyên đã được sử dụng để tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Tá dược làm tăng
cường phản ứng miễn dịch chủ yếu bằng cách làm tăng các phản ứng miễn dịch bẩm
sinh thông qua điều hòa tăng cường các phân tử đồng kích thích, chemokine,
cytokine. Một số tá dược đã sử dụng cho vắc xin đường niêm mạc mũi như CD80,
CD86, CD40, interferon‑α (IFNα), nhân tố kích hoạt tế bào B (BAFF), và các ligand
của các Toll-like receptor [9].
Hiện nay, một giải pháp giải quyết trở ngại của vắc xin đường uống đang được
rất nhiều người quan tâm, vừa giải quyết được vấn đề kháng nguyên dễ bị phân tán
do diện tích lớn của bề mặt ruột, vừa khắc phục được tình trạng ưu tiên xu hướng
dung nạp miễn dịch hơn đáp ứng miễn dịch của ruột. Đó là định hướng kháng nguyên
đến đúng mục tiêu là tế bào Microfold (M), một loại tế bào tuy chiếm tỉ lệ rất nhỏ
trong lớp tế bào biểu mô ruột, nhưng đóng vai trò quan trọng kích hoạt quá trình đáp
ứng miễn dịch.
1.2. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH THÔNG QUA TẾ BÀO M
1.2.1. Khái quát hệ thống miễn dịch ở ruột non
1.2.1.1. Vị trí hệ thống miễn dịch ở ruột non
Cấu trúc ruột non bao gồm bốn lớp: lớp màng thanh dịch, lớp cơ, lớp dưới
niêm mạc và trên cùng là lớp niêm mạc (Hình 1.1). Màng thanh dịch là lớp màng trơn
bao gồm một lớp mỏng mô liên kết và một lớp mỏng tế bào là nơi tiết ra dịch huyết
thanh. Lớp cơ là khu vực tiếp giáp với lớp dưới niêm mạc, thường cấu trúc bởi hai
Đinh Thị Phương Linh

10


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

lớp cơ vòng và cơ dọc, chịu trách nhiệm cho nhu động ruột. Lớp dưới niêm mạc là
lớp mô liên kết, chứa nhiều mạch máu. Niêm mạc là lớp mô trên cùng của ruột non,
bao gồm lớp tế bào biểu mô và lớp lamina propria bên dưới [11].

Hình 1.1. Cấu trúc các lớp trong ruột non [13].

Hệ thống ba thành phần bao gồm lớp biểu mô, lớp lamina propria và một lớp
cơ mỏng nằm dưới lamina propria tạo thành màng nhầy ruột. Màng nhầy ruột chính
là vị trí tương tác giữa hệ thống miễn dịch ở phía dưới và môi trường bên trong lòng
ruột, bao gồm cả thức ăn và các sản phẩm từ vi sinh vật. Lớp lamina propria gồm các
mô liên kết lỏng lẻo làm giá nâng đỡ cho các lông nhung, đồng thời chứa các tế bào
miễn dịch và các cấu trúc nang lympho [14]. Lớp biểu mô trên cùng là nơi tiếp xúc
trực tiếp với môi trường trong khoang ruột. Lớp biểu mô ruột gấp nếp tạo thành cấu
trúc lông nhung và hốc đặc trưng cho bề mặt của ruột. Đây là vị trí tập trung các tế
bào tiết chất nhầy, lysozyme, hormone, … [15]

Hình 1.2. Cấu trúc biểu mô ruột non [16].

Ngoài những vị trí gấp nếp tạo thành cấu trúc lông nhung và hốc, bề mặt ruột
còn có các vị trí khác đó chính là các nang lympho ruột (Hình 1.2). Trong hệ thống
Đinh Thị Phương Linh

11


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

các phương thức bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhiễm của các tác nhân gây hại từ đơn giản

đến phức tạp, thì cơ chế đáp ứng miễn dịch hiệu quả và quan trọng nhất được thực
hiện ở nang lympho ruột.
1.2.1.2. Nang lympho Peyer’s Patch ở khu vực ruột non
Tập hợp nang lympho ruột lần đầu tiên được mô tả bởi Marco Aurelio
Severino vào năm 1645, sau đó cấu trúc này được nghiên cứu kĩ hơn và được công
bố với tên gọi là Peyer’s Patch (PPs) bởi Conrad Peyer vào năm 1677 [17]. PPs là mô
đặc trưng nhất cho mô lympho màng nhầy ở ruột, nằm ở vị trí phía trên màng treo
ruột của ruột non [18] (Hình 1.3). PPs là một tập hợp các nang lympho, được phân
chia thành ba vùng. Vùng dưới cùng chứa một số lượng lớn các nang (follicle) chứa
tế bào lympho B và các tế bào lympho T. Tập hợp này được bao quanh bởi một cấu
trúc hình vòm gọi là SED (subepithelial dome) chứa hỗn hợp các tế bào B, tế bào T,
đại thực bào và tế bào DC. PPs kết nối với cơ thể nhờ mạch lympho và tĩnh mạch nhỏ
nội mô. Phía dưới là cấu trúc hạch lympho màng treo ruột (mesenteric lymph
nodes - MLN) có vai trò là nơi cung cấp các tế bào lympho trinh nguyên đến lớp PPs.
Phía trên cùng PPs là lớp nang tế bào biểu mô (follicle-associated epithelium – FAE)
hình thành mặt ngăn cách giữa cấu trúc mô lympho bên trong và môi trường trong
lòng ruột [15]. Thành phần lớp FAE bao gồm các tế bào biểu mô ruột và một tế bào
đặc biệt gọi là tế bào Microfold – tế bào M. Tế bào M có khả năng vận chuyển kháng
nguyên và vi sinh vật qua lớp biểu mô ruột đến các tế bào miễn dịch, thông qua đó
kích hoạt hoặc ức chế quá trình đáp ứng miễn dịch, dẫn đến một trong hai khả năng
của cơ thể là đáp ứng miễn dịch hay dung nạp miễn dịch [17].

Hình 1.3. Cấu trúc Peyer’s Patch [10].
Đinh Thị Phương Linh

12


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

1.2.1.3. Quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở Peyer’s Patch
Quá trình tiếp nhận kháng nguyên và gây kích thích đáp ứng miễn dịch diễn
ra trong lớp PPs bắt nguồn bởi tế bào M. Đầu tiên, kháng nguyên xâm nhập vào cơ
thể được tiếp nhận bởi tế bào M và được vận chuyển nguyên vẹn đến cho tế bào DC
(Hình 1.4). Sau đó, tế bào DC mang kháng nguyên đến cư trú trong vùng nang tế bào
T và kích hoạt việc biến đổi tế bào T trinh nguyên thành tế bào T đáp ứng. Tế bào T
CD4+ đáp ứng đặc hiệu kháng nguyên biểu hiện ligand CD40 tương tác với tế bào B
biểu hiện thụ thể CD40 kích hoạt sự tiết kháng thể IgA, cùng với sự tiết của cytokine
IL-4 và IL-10. Bào tương IgA+ di chuyển đến vị trí đáp ứng của màng nhầy và kháng
thể IgA được tiết ra, sau đó chuyển đến khoang ruột ở dạng sIgA thông qua tương tác
với thụ thể polymeric Ig [10].

Hình 1.4. Đáp ứng miễn dịch màng nhầy sản sinh kháng thể IgA [9].

1.2.2. Tế bào M
1.2.2.1. Đặc điểm của tế bào M
Tế bào M chiếm tỉ lệ 10% trong tổng số các tế bào biểu mô ruột. Trái ngược
với các tế bào biểu mô ruột có hệ thống các lông ruột nhỏ dày đặc trên bề mặt, tế bào
M có bề mặt với các lông ngắn bất thường, số lượng lại rất ít. Tế bào M không có lớp
glycoprotein-polysaccharide dày phía trên bề mặt giống như các tế bào hấp thụ của
ruột, mà thay vào đó là lớp glycoprotein-polysaccharide mỏng. Người ta cho rằng
chính cấu trúc khác biệt này giúp tế bào M thuận lợi hơn trong việc tiếp xúc với kháng
nguyên [19].
Đinh Thị Phương Linh

13

Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

Hình 1.5. Tế bào M [20].

Phía trong tế bào M có một hốc lõm vào tạo thành cấu trúc túi chứa tế bào B,
tế bào T, đại thực bào và các tế bào DC. Cấu trúc túi này là vùng tiếp cận của tế bào
lympho và các tế bào trình diện kháng nguyên (Hình 1.5). Nhờ cấu trúc này mà
khoảng cách từ đáy tới đỉnh tế bào M được thu hẹp lại, giúp rút ngắn quãng đường
vận chuyển của kháng nguyên từ vị trí tiếp nhận đến tế bào lympho [19].
Trong quá trình vận chuyển kháng nguyên từ tế bào M đến tế bào trình diện
kháng nguyên, người ta cho rằng kháng nguyên được vận chuyển nguyên vẹn đến
khoang tế bào M mà không trải qua bất kì một sự biến đổi cấu trúc nào. Sự giữ nguyên
cấu trúc này là do lượng lysosome chứa trong tế bào M rất ít, ít hơn 16 lần so với các
tế bào ruột bình thường, đồng thời hoạt động của lysozyme cũng giảm. Thực tế, có
một vài bằng chứng cho thấy ở tế bào M vẫn có hoạt động của enzyme. Người ta đã
tìm thấy các prelysosome giàu acid phosphatase, MHC nhóm II và proteinase
Cathepsin E ở tế bào M của chuột, đặt ra nghi ngờ rằng ở tế bào M có hoạt động biến
đổi kháng nguyên khi nó được tiếp nhận. Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào rõ
ràng về sự biến đổi của kháng nguyên tại tế bào M [19].
1.2.2.2. Phương thức tiếp nhận và vận chuyển kháng nguyên của tế bào M
Tế bào M có nhiều cách tiếp nhận và vận chuyển các vật chất khác nhau vào
trong tế bào. Cơ chế của các phương thức vận chuyển này phụ thuộc vào kích thước
và bản chất của vật chất mà nó vận chuyển. Đối với vi khuẩn và các hạt có kích thước
lớn, tế bào M thường sử dụng phương thức thực bào bằng cách biến đổi màng tế bào
và sắp xếp lại khung actin, tạo thành các bóng thực bào bao gói vật chất và vận chuyển
Đinh Thị Phương Linh

14

Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

vào trong tế bào. Đối với virus và các hạt bám dính khác, tế bào M sử dụng protein
clathrin tạo thành các bóng vận chuyển đưa vào tế bào, còn các hạt không bám dính
thì được vận chuyển bằng ẩm bào [21].
Ngoài các phương thức vận chuyển trên, tế bào M còn có phương thức vận
chuyển kháng nguyên mang tính đặc hiệu hơn, đó là dựa vào tương tác giữa ligand
và thụ thể. Thời gian trước đây, những hiểu biết về tế bào M và hệ thống các phân tử
trên bề mặt tế bào M vẫn còn hạn chế. Cho đến khi người ta tạo ra được mô hình
in vitro của tế bào giống với tế bào M của người, một loạt các nghiên cứu về các thụ
thể trên bề mặt tế bào M được thực hiện, kết quả là một số lượng khá lớn các thụ thể
trên tế bào M cùng với ligand bám đặc hiệu với nó đã được công bố [22].
Bảng 1.3. Ligand và thụ thể đặc hiệu trên tế bào M [10]

Ligand
UEA-1
AAL
Galectin-9
Peptide Co1 (SHFQLPARSPLP)
Antibody NKM 16-2-4
Antibody LM112
Antibody 3G7-H9
1 protein (reovirus)
Invasion (Yersinia)
FimH (E. coli, Salmonella)
OmpH (Yersinia)

LPS
Lipoteichoid acid
Đơn phân Phosphorylcholine của LPS
Hsp60 của Brucella abortus
Lipid A domain của LPS (vi khuẩn Gram âm)
Peptidoglycan vi khuẩn

Thụ thể trên tế bào M
1,2 Fucose
-L-Fucose
N-Glycans/repeated
C5aR
oligosaccharide
1,2 Fucose gồm carbohydrate
Sialyl Lewis A
Glycoprotein 2
2,3 Sialic acid
1 Integrin
Glycoprotein 2/uromodulin
C5aR
TLR-4
TLR-2
PAFR
Cellular prion protein
AnxA5
PGLYRP-1

Phương thức tiếp nhận và vận chuyển kháng nguyên bằng liên kết giữa ligand
và thụ thể là phương thức vận chuyển đặc hiệu nhất. Đặc điểm cấu trúc bề mặt tế bào
M khá bằng phẳng là một lợi thế lớn, bởi vì các thụ thể không bị che lấp bởi các cấu

trúc lông nhỏ li ti, nên cơ hội gặp gỡ và tạo liên kết giữa ligand và thụ thể được tăng
lên nhiều lần. Hơn nữa, phương thức vận chuyển này cho phép vận chuyển kháng

Đinh Thị Phương Linh

15


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

nguyên một cách đặc hiệu. Hệ thống các ligand và thụ thể của nó trên bề mặt tế bào
M được thể hiện trong Bảng 1.3.
Những hiểu biết về hệ thống ligand và thụ thể đặc hiệu tương ứng trên bề mặt
tế bào M mở ra một hướng vô cùng tiềm năng cho việc phát triển vắc xin đường uống.
Có thể lợi dụng đặc tính bám dính đặc hiệu này của ligand mà sử dụng nó để định
hướng kháng nguyên di chuyển đến trúng đích là thụ thể trên bề mặt tế bào M. Việc
quan trọng là cần phải lựa chọn chính xác được loại ligand thích hợp nhất.
Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng một vài thụ thể của tế bào M nêu trên
không chỉ biểu hiện trên bề mặt tế bào M mà còn xuất hiện ở các tế bào khác. PAFR
và TLR-2 được chứng minh là biểu hiện với số lượng rất nhiều trên bề mặt tế bào
biểu mô ruột, cũng như trên bề mặt tế bào M [22]. Thụ thể UEA-1 ngoài biểu hiện
trên bề mặt tế bào M, còn biểu hiện trên tế bào Goblet [23]. Những nghiên cứu khác
chỉ ra rằng một số ligand có thể gây độc cho tế bào. Lipopolysaccharide (LPS) trong
thành ngoài của vi khuẩn Gram âm cùng với lipid A của nó gây được đáp ứng miễn
dịch trong tế bào động vật, tuy nhiên khi dùng với liều lượng cao thì tế bào có phản
ứng bị sốc độc [24]. Tương tự đối với Lipoteichoid acid khi vào cơ thể cũng gây sốc
nhiễm trùng [25].
Do đó, với hệ thống ligand và thụ thể tương ứng trên tế bào M, lựa chọn được

một loại ligand mang nhiều ưu điểm sẽ hỗ trợ rất lớn trong việc giải quyết các trở
ngại của phát triển vắc xin đường uống. Protein FimH nằm trên tiểu phần lông roi
loại 1 của vi khuẩn E. coli có khả năng bám vào thụ thể đặc hiệu trên tế bào M là ứng
cử viên tiềm năng.
1.3. PROTEIN FIMH
Sự xâm nhập của nhiều vi khuẩn vào cơ thể vật chủ có liên quan đến sự hiện
diện của các cấu trúc có khả năng bám dính như lông hoặc tua trên bề mặt tế bào vi
khuẩn [26]. Vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa E. coli là một trong số các vi khuẩn
có biểu hiện cấu trúc bám dính này. Một vài cơ quan thực hiện chức năng bám dính
ở E. coli như lông roi P, lông roi loại 1, lông roi S và lông roi F1C. Trong số đó, lông
roi loại 1 được biểu hiện với tỉ lệ lớn hơn 80% trên tổng số các vi khuẩn E. coli gây
bệnh. Người ta suy đoán rằng, lông roi loại 1 chính là yếu tố quyết định khả năng
bám dính của E. coli [27].
Đinh Thị Phương Linh

16


Khóa luận tốt nghiệp

Tổng quan tài liệu

Cấu trúc của lông roi loại 1 bao gồm nhiều tiểu phần: FimA, FimF, FimG,
FimH (Hình 1.6). Protein FimH là tiểu phần nằm ở vị trí đầu lông roi. Đã có rất nhiều
thí nghiệm được tiến hành nhằm chứng minh vai trò của protein này đối với khả năng
bám dính của lông roi loại 1. Từ những thí nghiệm đột biến gen, kháng thể ức chế
FimH, và đột biến mất hoàn toàn FimH đều cho thấy khả năng bám đường mannose
và sự tồn tại trong cơ thể vật chủ của vi khuẩn đều giảm hẳn. Gần đây, những kết quả
tinh thể hóa của protein FimH chung với đường α-mannose đã khẳng định vai trò của
protein này trong việc bám dính với thành phần mannose trên bề mặt tế bào trong cơ

thể [27].

Hình 1.6. Cấu trúc gồm nhiều tiểu phần của lông roi loại 1 [28].

1.3.1. Cấu trúc protein FimH
Protein FimH tiền thân sau khi dịch mã có kích thước 300 amino acid, protein
khi trưởng thành có kích thước 279 amino acid. Cấu trúc protein FimH gồm hai tiểu
phần chức năng: tiểu phần nằm ở đầu N có chức năng bám dính, gọi là lectin domain
hay receptor binding domain (FimHrb) ở vị trí từ amino acid 1 – 156; tiểu phần nằm
ở đầu C gọi là pilin domain (FimHp) ở vị trí từ amino acid 160 – 279, có chức năng
giúp liên kết FimH với các thành phần còn lại của lông roi [29]. Hai tiểu phần của
protein FimH liên kết với nhau nhờ một cấu trúc khá linh hoạt hình thành bởi hai
amino acid Glycine ở vị trí 159 và 160 [30] (Hình 1.7A).

Đinh Thị Phương Linh

17